No division operations!
TOO COMPLEX?
O melhor perfil de CLAE foi obtido a partir da programação em que se utilizou coluna Lichrospher 100 RP18 e como fase móvel (A) ACN (A) e H2O.pH3(TFA)(B). A eluição foi realizada em gradiente, durante 60min: onde A:B em t=0min é 82:12; t=20min, 55:45; t=50min, 0:100 e t=60min 82:18, a uma temperatura de 26ºC (±1º) com detecção nos comprimentos de onda 254, 330, 400, 450nm e monitoramento em 254nnm. Os cromatogramas registrados em 330 e 400nm fornecem picos com características das duas principais classes de metabolitos secundários que são quinonas e flavonoides.
No cromatograma de 330nm, no intervalo de tempo de 4 a 24minutos foi possível observar o aparecimento de picos significativos, característicos de flavonoides (Figura 7), com destaque para os picos localizados nos tempos de
FH FC FAE
53
retenção (Rt) de 8,67min, com pureza de 0,9914 e máximos de absorbancia em 275nm e outro em 324nm (Figura 6), o de 11,49min, com máximos em 268nm e 333nm (Figura 6a) e o de 15,07min, com máximos em 266nm e 331nm (Figura 6b). Segundo Harborne (1998), essas combinações de máximos de absorvância são característicos da classe dos flavonóis, que se caracterizam pela presença de uma hidroxila na posição C3.
Figura 5: Cromatograma obtido por CLAE-DAD do EEB de A. chica no comprimento de onda de 330nm. Com destaque para os picos registrado entre os tempos de 4 a 24min, especialmente o com tempo de retenção de 8,67min. Com observação de picos de pouca intensidade no tempo de 37 a 54min.
Figura 6: Espectro do pico registrado, por CLAE-DAD de A. chica a 330nm, com Rt de 8,67min e pureza de 0,9914., observa-se dois máximos de absorção um em 275,7 nm e outro em 324,7nm.
275,7nm
54 Figura 6a: Espectro do pico registrado, por CLAE-DAD deo EEB de A. chica a 330nm, com Rt de 11,49 min observa-se dois máximos de absorção um em 268 nm e outro em 324.
Figura 6b: Espectro do pico registrado, por CLAE-DAD do EEB de A. chica a 330nm, com Rt de 15,07 min , observa-se dois máximos de absorção um em 266 nm e outro em 331nm.
No cromatograma registrado em 400nm, no intervalo de tempo de 37 a 54min, observa-se a presença de picos referentes a espectros característicos de quinonas, sendo que os mesmos já tinham sido observados em 330nm, porém apresentavam- se menos intensos neste comprimento de onda (Figura 9). Em destaque tem-se o pico apresentado no tempo de retenção (Rt) de 50,64min, que corresponde a um espectro com 4 máximos de absorbância: 222; 278; 324 e 404nm, com pureza de 0,9989 (Figura 10). Harborne (1998) diz que as naftoquinonas têm de três a quatro máximos de absorbância em seu espectro, sendo um ou dois abaixo de 300nm, outro entre 320 e 340nm e outra acima de 400nm. Os máximos do espectro do pico
331nm 266nm
333nm 268nm
55
mencionado estão de acordo com esta citação e nos leva a mencionar uma possível presença de naftoquinonas neste extrato.
Em estudos anteriores realizados com o mesmo equipamento a quinona isoleuterina foi caracterizada através do espectro no ultavioleta, que mostra quatro máximos de absorbância (MALHEIROS, 2008), o mesmo padrão se observa no espectro da substância discutida nesse relatório. A comparação entre os dois espectros mostra que as bandas com máximo de absorção em torno de 400nm, relativa a transição das carbonilas quinonicas, estão presente em ambos os espectros. Tal fato permite inferir que existe um cromóforo quinônico em ambas as estruturas, reforçando a observação de A. chica apresentar ao menos uma quinona na amostra analisada, uma vez que é freqüente em outros trabalhos com Bignoniácea o isolamento de quinonas na família (STEIRNET, 1995; JACOME, 2001e OLIVEIRA, 1990).
Figura 7: Cromatograma obtido por CLAE-DAD do EEB de A. chica, registrado no comprimento de onda de 400nm. Com destaque para os picos no tempo de 37 a 54min, especialmente o pico do tempo de retenção de 50,64 min, indicado pela seta.
56 Figura 8: Esspectro do pico observado por CLAE-DAD DO EEB de A. chica em 400nm com (Rt) de
50,64 min e pureza de 0, 9989. Com quatro máximos de absorção: 222; 278; 324 e 404.
7.10.3. LC-MS
Na análise por LC-DAD-MS observou-se baixa absorbância nos espectros de absorção na região do Ultra Violeta, indicando a ausência de grupos cromóforos. Além disso, os espectros de massas mostram que estes compostos majoritários da fração possuem baixa massa molecular (conforme anexo A 1; 2 e 3).
222,6 nm
278,2 nm
324,7 nm
57 7.10.4. CROMATOGRAFIA LIQUIDA A VÁCUO:
Para a CLV foi escolhida a fração acetato de étila (FAE), pois foi a fração que apresentou melhor perfil na CCD. Cerca de 3,217g da fração foram aplicados na coluna, preenchida com gel de sílica 60 (230-400mesh) para cromatografia em coluna. Como eluente foram utilizados Hexano:Acetato de étila: metanol nas seguintes proporções: 80:20:0; 70:30:0; 60:40:0; 60:30:10; 60:20:20; 60:10:30 e 60:0:40. As frações foram recolhidas em tubos de ensaios e as proporções de eluentes foram modificadas a cada observação de Constancia na cor das frações.
No total foram recolhidas 332 frações ao final da CLV, estas foram analisadas por CCD, utilizando como eluente hexano: acetona: MeOH (67,5:27,5:5) e observadas em UV 254 e 365nm e reveladas com anisaldeído. As frações com perfis semelhantes foram reunidas somando ao final 14 frações, numeradas de 1-14. Os rendimentos de cada fração foram: F1-0,050g; F2-0,0154; F3-0,0153; F4-0,0188; F5-0,1625; F6-0,0499; F7-0,075; F8-0,1252; F9-0,2509; F10-0,723; F11-0,6218; F12-0,3761; F13-0,474 e F14-0,3218.
Estas frações foram analisadas por CLAE-DAD. Para esta análise, as frações foram dissolvidas em metanol grau HPLC na concentração de 10 mg/mL e posteriormente filtradas em filtro Millipore 0,45 µm. Alíquotas de 20 µL foram injetadas no cromatógráfo, em análises distintas, a fim de definir os perfis da composição de cada fração. Foi usada uma coluna LiChrospher® 100 HPLC 125-4 RP-18 a 26ºC e como eluentes A: Solução aquosa de ácido ácético 2% e B: acetonitrila/metanol/ácido acético (88:10:2) em gradiente linear de 18 a 100% de A em 30 minutos, com fluxo de 1 mL/min, e detecção nos seguintes comprimentos de onda: 280, 330, 400 e 450.
No cromatograma da fração 8 (figura 11) observa-se o pico de 12,35 min., que apresenta espectro no UV com máximos de absorção em 266 e 336nm (figura 12) típicos de flavonóides, mais especificamente da classe dos flavonóis (MABRY et al.,1970).
58 Figura 11: cromatograma da fração 8, onde se observa o pico de 12,35min.
Figura 12: Pico de 12,35min da Fr8, com pureza de 0.9977 e máximos em 227, 266 e 336nm.
E ao comparar o espectro relativo ao pico de 10,45 da fração 8 com espectro no UV de padrões de disponíveis armazenados na biblioteca do aparelho, encontrou se uma correlação significativa com o espectro de apigenina, sugerindo assim que o núcleo flavonoídico seja derivado da flavona apigenina. A presença deste flavonóide já foi relatada em outra espécie da família Bignoniácea do gênero Arrabidaea (BLATT et al, 1998).
Uma solução de Padrão de apigenina (SIGMA-ALDRICH® CAS 520-36-5) na concentração de 0,5mg/mL em MeOH grau HPLC foi injetada nas mesmas condições da fração 8, e após a análise o pico da apigenina foi observado no tempo
12,35min
227 nm
336nm 266
59
de 12,24 no cromatograma (figura 13), com pureza de 0,9997 e espectro com máximos em 233; 266 e 333 (figura13.a).
Figura 13: Cromatograma HPLC-DAD de apigenina pura a 0,5mg/mL.
Figura13.a: Espectro da Apigenina pura.
Foi ainda realizada co-injeção da apigenina com a fração 8. Onde 0,05mg da substância de referência foram adicionado a 1mL da solução da Fração 8 a 15mg/mL. Observou-se então no perfil apresentado na co-injeção o aumento da absorção do pico de 12,35 min, que passou de 0,615AU para 1,585 AU, fato este
Rt=12,24min.
233
266
60
não observado nos demais picos. Conforme se observa na figura 14, em comparação com a figura 11.
Figura 14: Perfil cromatográfico LC-DAD da Co-injeção Fração8 + apigenina.
Na química flavonoídica da família Bignoniácea predomina de flavonóides de esqueleto regular, não havendo ocorrência de tipos mais diferenciados tais como isoflavonóides e neoflavonóides (CIPRIANI, 2006). É relatado também que a família apresenta uma preferência na produção de flavonas o que segundo BATE-SMITH (1962) pode ser indicativo de posicionamento mais avançado para o táxon. A presença da apigenina confirma essa teoria reforçando a idéia de uma família mais desenvolvida dentro de seu reino.
61 7.10.5. Avaliação Microbiológica:
A avaliação de EEB e EAB por teste de difusão em disco frente a cepas de
Enterococcus hirae; Bacillus subtilis; Candida albicans; Escherichia coli; Staphylococcus aureus nas concentrações testadas não mostraram qualquer halo
de inibição em torno dos discos contendo o extrato da planta em nenhuma de suas concentrações. Os microorganismos que mostraram sensibilidade, através da formação do halo de inibição foram: Pseudomonas aeruginosa nas concentrações de 500 e 250; Streptococcus mitis a 500; Streptococcus mutans 500; Streptococcus
sanguis 500; Enterococcus faecalis 500 e 250; Candida krusei 500 e 250; Candida parapsilosis 500, 250 e 125.Conforme tabela a seguir:
Tabela 5 – Atividade antimicrobiana in vitro do EEB de Arrabidaea chica pelo método de disco- difusão.
Micro-organismo 500 250 125 62,50 31,25 15,625 Cloranfenicol Nistantina DMSO
Bactérias Gram- negativas Pseudomonas aeruginosa 12 mm* 9 mm - - - - 20 mm NSA -
Escherichia coli - - - 18 mm NSA -
Bactérias Gram- positivas Staphylococcus aureus - - - 30 mm NSA - Streptococcus mitis 11 mm - - - 23 mm NSA - Streptococcus mutans 10 mm - - - 23 mm NSA - Streptococcus sanguis 11 mm - - - 23 mm NSA - Enterococcus faecalis 11 mm 9 mm - - - - 30 mm NSA -
Enterococcus hirae - - - 32 mm NSA -
Bacillus subtilis
Fungos leveduriformes
Candida albicans - - - NSA 20 mm -
Candida krusei 12 mm 9 mm - - - - NSA 20 mm - Candida parapsilosis 15 mm 12 mm 10 mm - - - NSA 20 mm -
62
Estudos biológicos com espécies desta mesma família têm revelado atividade microbiana em alguns gêneros inclusive o Arrabidaea (LIMA, 2003). A atividade biológica apresentada pelo extrato pode sustentar seus usos tradicionais como antimicrobiana e antifúngica. E ainda a presença da apigenina que possui entre suas atividades, já comprovada a atividade antibacteriana vem reforçar esta possivel atividade do extrato analisado (VERDI, 2005).
Alves (2008) testou a atividade antimicrobiana da A. chica para alguns dos mesmos microorganismos testados neste trabalho. Ele relata em seu estudo a atividade antimicrobiana positiva da mesma para o S. aureus nas concentrações de 500, 250, 125 e 62,5; para a E. coli nas concentrações de 500 e 250 mg/mL para a
C.albicans somente na concentração de 500 mg/mL. Já Barbosa e Quinard (1998)
não observaram atividade antimicrobiana contra estas cepas em extrato etanólico. Esse fato pode estar associado á sazonalidade da planta, pois esta foi coletada em diferentes estações do ano em cada um dos trabalhos descritos acima. Castro (2007) apresentou a influencia da sazonalidade na atividade antibacteriana e atribuiu à alteração na concentração de compostos bioativos que pode variar em função do período de coleta e da sazonalidade local.
63 8. CONCLUSÃO
No presente trabalho observou-se que o processamento da droga vegetal foi satisfatório, uma vez que os resultados das análises físico-químicas estavam dentro de parâmetros aceitáveis. O pó foi classificado como grosso, com 11% de teor de água e 7,63% de cinzas totais. O rendimento da tintura obtida pelo método de maceração foi de 17,79% em relação à droga vegetal (pó) e 2,22% em relação à planta fresca.
Na abordagem fitoquímica observou-se a presença de diversos metabólitos secundários entre ele saponinas; ácidos orgânicos; açucares redutores; fenóis e taninos; alcalóides; derivados da cumarina; derivados de fenan-, benzo- e naftoquinonas e também flavonóides tão mencionados na literatura como sendo abundantes nesta família e na espécie Arrabidaea chica (H&B) Verl.este foi reforçado no perfil de CCD obtido com o eluente Hexano/Acetona/ MeOH (67,5:27,5:5) e revelado com NP/PEG, revelou uma banda com Rf=0,17 com fluorescência amarela característico de flavonóides
O indicativo da presença de um possível derivado flavonoidico da apigenina e a atividade microbiológicas apresentada contra os microorganismos Pseudomonas
aeruginosa; Streptococcus mitis; Streptococcus mutans; Streptococcus sanguis; Enterococcus faecalis; Candida krusei e Candida parapsilosis, corroboram seu uso
popular e contribuem para a padronização de uma forma de uso e direcionamento para a produção de fitoterápicos a partir desta planta e seus insumos.
64 9. REFERÊNCIAS
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