Cruz e colaboradores (1999) desenvolveram um modelo matemático não-estruturado para descrever o processo de produção de cefalosporina C pelo fungo Cephalosporium acremonium, em batelada alimentada. Neste modelo, foram considerados dois tipos celulares metabolicamente diferentes – um grupo de células
X2, que crescia e produzia o antibiótico, e um outro grupo X1 apenas com
capacidade de crescimento, mas que ao longo do cultivo se transformava em células
X2 . Para descrever o processo de produção, os autores consideraram que as
células X2, ao se multiplicarem, produziam um complexo enzimático, responsável
pela síntese da cefalosporina C a partir de seus precursores. A cinética de produção foi estabelecida como um modelo de cinética enzimática e levou em consideração a concentração do complexo enzimático e do substrato. Baseado no modelo, foi possível calcular a vazão de alimentação ótima do meio suplementar, de modo a maximizar a produção do antibiótico.
Malmberg e Hu (1991) propuseram um modelo cinético estruturado para a produção de cefalosporina C por Streptomyces clavuligerus. O modelo partiu da concentração intracelular dos aminoácidos precursores e incluiu os passos enzimáticos conhecidos da rota metabólica de biossíntese da cefalosporina. Com a simulação do modelo, foi possível prever o perfil de concentração dos intermediários ao longo do período de cultivo e a atividade específica das enzimas envolvidas. Os autores constataram que o passo metabólico catalizado pela enzima ACV sintetase é o limitante do processo, seguido pelo passo catalizado pela hidroxilase. O aumento da atividade destas duas enzimas aumenta linearmente a produção, até um certo ponto que uma terceira enzima limitante se torna o fator dominante. Como pode ser observado, este tipo de modelo fornece informações importantes que podem ser usadas, por exemplo, no desenvolvimento de um microrganismo geneticamente modificado, no qual pode-se introduzir uma super-expressão das enzimas limitantes.
Kirk et al. (2000) estudaram o efeito do substrato limitante – nitrogênio, fosfato ou carbono - na produção de ácido clavulânico por meio de uma análise de fluxo metabólico. No modelo, foram incluídas as principais rotas metabólicas presentes na maioria das espécies de Streptomyces, as reações de biossíntese dos precursores envolvidos na produção de biomassa e a reação de síntese do ácido clavulânico. Os autores constataram que a natureza do substrato limitante interferiu no fluxo de carbono através das diferentes reações consideradas, o que explicaria uma maior ou menor produção. A maior concentração de ácido clavulânico foi observada no meio no qual o fosfato era o substrato limitante, enquanto que no meio em que a fonte de carbono era limitante não houve produção. A limitação de carbono reduziu o fluxo através do metabolismo anaplerótico, que repõe os intermediários do ciclo do ácido cítrico. Segundo os autores, esta redução se refletiu
na redução da concentração intracelular de α-cetoglutarato, diminuindo a
disponibilidade deste para a biossíntese do glutamato, e consequentemente, reduzindo a biossíntese da arginina. Já no meio com fosfato limitante, o fluxo para a arginina a partir do arginino-succinato foi o maior entre as diferentes condições testadas, disponibilizando uma maior concentração deste precursor para a síntese do ácido clavulânico. Segundo os autores, os resultados sugerem que sob limitação de fosfato, o fluxo através das reações que sintetizam a arginina está saturado, limitado sob limitação de nitrogênio e insuficiente sob limitação de carbono.
Bushell et al. (2006) também utilizaram a análise de fluxo metabólico para desenvolver uma estratégia de adição de aminoácidos ao meio de cultura que pudesse estimular a produção de ácido clavulânico. A análise dos resultados mostrou que a síntese do ácido clavulânico foi limitada pela disponibilidade do gliceraldeído-3-fosfato, o precursor C3 da molécula, e que parece que a “competição” entre as diferentes rotas que utilizam este componente influencia a sua disponibilidade. Os autores realizaram então um experimento com a adição de aminoácidos cuja biossíntese requer oxaloacetato como precursor – a combinação de arginina, aspartato e treonina, e outra dos três anteriores mais asparagina. A suplementação promoveu o aumento da produtividade de ácido clavulânico em até cinco vezes, comparado com o meio sem suplementação.
Baptista Neto et al. (2005) propuseram um modelo cinético simples para a produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus. Para descrever a cinética de crescimento, foi usado o modelo de Contois, e dois substratos diferentes como fonte de carbono e energia – o glicerol e a fonte de nitrogênio. A cinética de produção foi considerada não associada ao crescimento, e levou-se em conta a degradação do produto. A estimação dos parâmetros foi feita ajustando-se valores experimentais de um cultivo contínuo ao modelo proposto. Com os parâmetros estimados, foram feitas simulações de processos em batelada alimentada e cultivo contínuo com reciclo celular. Concluiu-se que a maior produtividade foi obtida no modo de operação contínuo com reciclo.
Como apresentado anteriormente, os modelos cinéticos, além de ferramentas tecnológicas muito úteis para desenvolvimento de processos, também auxiliam na compreensão da biossíntese de metabólitos pelos microrganismos, identificando gargalos nas rotas metabólicas, substratos limitantes e componentes no meio de cultura que não são precursores mas favorecem a produção. Apesar dos avanços alcançados na elucidação dos passos metabólicos da produção do ácido clavulânico e cefamicina C por S. clavuligerus, os mecanismos de regulação da produção destes compostos ainda não são completamente conhecidos. Justifica-se, assim, o uso de modelos cinéticos como uma ferramenta de auxílio para entender e explicar a produção desses metabólitos secundários, descrevendo a maneira como cada componente presente no meio de cultura pode afetar a cinética de crescimento e produção.