Inicialmente, para a extração do RNA total hipofisário foi utilizado o reagente Trizol (Invitrogen®), que consiste em uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina. Este método é amplamente utilizado em biologia molecular sendo adequado para a extração de RNA total em inúmeras amostras, pois proporciona a solubilização simultânea de tecidos ou células e inativação de RNases endógenas. Entretanto, nos resultados iniciais deste estudo a quantificação do RNA total obtido por amostra não foi suficiente para a reação de transcrição reversa, o que requereria a utilização de um pool de amostras (3 aproximadamente) e consequentemente acabaria
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por impor ajustes metodológicos indesejados. Diante disso, foi utilizado o kit de extração de RNA total - RNAqueous kit (Ambion Inc®) de acordo com instruções do fabricante, cujo rendimento médio foi de 0,9 µg/µl de RNA total por amostra.
A reação de transcrição reversa foi realizada com oligo dT primer (Promega®) e com a enzima RevertAID H Minus Reverse Transcriptase # EP0451 (Fermentas®) a partir de aproximadamente 0,5 µg de RNA total. O cDNA obtido foi submetido a uma reação de PCR a partir de primers degenerados para FSH e LH (subunidade β) dos estudos de Parhar et al., (2003) no seguinte gradiente de temperaturas de associação dos oligonucleotídeos 40x (52.0; 52.2; 52.7; 53.6; 54.7; 56.1; 57.7; 58.8; 60.1; 61.2; 62.0; 62.4ºC) para assim determinar as condições ideais para o funcionamento destes primers. Estas reações ocorreram no termociclador Master Cycler modelo Nexus gradiente (Eppendorf®). Todas as quantificações de DNA e RNA ocorreram no equipamento
Nanodrop TM Spectrophotometer (ND-1000).
Os fragmentos obtidos pela reação de PCR foram verificados em gel de agarose a 2% e, depois de constatado o tamanho de pares de bases esperado para cada gene (βFSH e βLH), procedeu-se a extração e purificação destas bandas do gel de agarose com o uso de QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN®), comparados com o marcador
100 pb. O produto amplificado na reação de PCR (inserto) foi clonado utilizando-se o vetor pGEM-T Easy Vector Systems – Promega®, juntamente com a enzima T4 DNA
ligase (Promega®) de acordo com as instruções do fabricante. A proporção inserto - vetor foi de [3:1], respectivamente e a transformação bacteriana foi em colônias competentes de Escherichia coli linhagem DH5α, as quais permaneceram incubadas em estufa a 37°C por 24h, plaqueadas em meio SOB sólido com ampicilina, isopropil-β-D- tiogalactosídeo (IPTG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosideo (X-gal).
Após este período de incubação para a reação de transformação bacteriana (inserção do vetor com o inserto nos plasmídeos bacterianos) foram selecionadas colônias brancas, pois teoricamente estas são recombinantes e contém o inserto de interesse, e removidas do meio sólido para o meio SOB líquido, com ampicilina por mais 24 horas a 37o C sob constante agitação. O DNA plasmidial obtido desta reação foi extraído (Miniprep) através da lise alcalina que é um dos procedimentos mais usuais e rápidos para a extração de plasmídeos bacterianos (Sambrook e Russel, 2001).
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A reação de digestão plasmidial dos clones transformados ocorreu com a enzima de restrição ECORI fast digest #FD0274 (Thermo Scientific®) de acordo com as instruções do fabricante. Por intermédio de uma eletroforese o inserto foi analisado e comparado entre amostras digeridas e não digeridas. Subsequentemente, os clones contendo bandas cujo tamanho esperado foi constatado na eletroforese passaram por reação de sequência com os seguintes reagentes: tampão Save Money (200 mM Tris- HCl pH 9,0 e 5 mM MgCl2), e o kit para reação de sequenciamento BigDye Terminator
Cycle SequencingV 3.1 (Applied Biosystem®), com os primers T7 ou SP6 (3.2 µM,
Invitrogen®).
Estas reações ocorreram em termociclador nas seguintes condições: 96ºC por 90 segundos, seguidos de 49 ciclos de 96ºC por 20 segundos, 55º C por 20 segundos e 60º C por 4 minutos, sendo em seguida precipitadas e secas a 96ºC por 2 minutos em termociclador. Estas amostras foram submetidas a um sequenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystem), no Instituto de Química da Universidade de São Paulo.
Os resultados da reação de sequência foram expressos em cromatogramas, que por sua vez foram analisados e editados no software Bioedit Sequence Alignment Editor. As respectivas sequências foram alinhadas no mesmo software e realizado o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) na base de dados pública para comparação e confirmação das sequências de nucleotídeos (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi). Confirmadas as sequências de FSH e de LH, procedeu-se a elaboração de primers internos específicos para a reação de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) utilizando-se a ferramenta online OligoPerfect™ Designer em
http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716&icid=fr-oligo-6. Posteriormente as condições ideais do primer elaborado foram conferidas no software Oligo Calc:
Oligonucleotide Properties Calculator em:
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html.
O gene utilizado como normalizador foi o ELF1 – α (elongation factor), descritos por McCurley e Callard, (2008) como ideal para estudos relacionados ao encéfalo de peixes. Os primers foram gentilmente cedidos pela pesquisadora Dra. Maria Inês Borella, pois estes foram delineados por Adolfi (2011) para a espécie Astyanax
altiparanae. A partir destes primers, foi determinada sua especificidade para a espécie
31 primers internos desenhados, conforme metodologia supracitada para βFSH e βLH. O
gradiente de temperatura para o PCR foi de: 94o C – 2 minutos, 94o C – 30 segundos,
58o C – 30 segundos, 72o C – 30 segundos (40 vezes); 94o C (40 vezes), 72o C – 7
minutos e storage 4oC.
2.8.1 PCR em tempo real (qRT-PCR)
Para a análise da expressão gênica e quantificação absoluta dos genes em questão: βFSH, βLH e ELF1-α, foi construída um curva padrão com 10 pontos: 100 a
109 a partir dos plasmídeos dos quais os primers internos específicos foram elaborados. O DNA plasmidial, pGEM - T Easy Vector de 3015 bp contendo os insertos foi clivado com a enzima Scal #ER0431 (Thermo Scientific®) linearizando o vetor pelo lado oposto ao do inserto e os fragmentos gerados foram verificados em gel de agarose a 2%. As bandas obtidas foram extraídas do gel e purificadas pelo Protocolo Bench: QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN®).
O qRT-PCR proporciona a determinação da expressão quantitativa dos genes em tempo real, sendo sensível a ponto de detectar a presença de uma única cópia gênica e quantificar exatamente a expressão de um único gene (Novais et al., 2004) . Para tanto, os produtos amplificados em tempo real são quantificados através da emissão de sinal fluorescente. No presente trabalho foi feito o método de comparação de Ct (cycle
threshold - ciclo limiar) ou ∆∆Ct. Durante os ciclos iniciais, o sinal de fluorescência,
assim como previsto, foi fraco e não pôde ser distinguido da fluorescência basal (background). O ponto que detectou o ciclo no qual a reação atingiu o limiar da fase exponencial foi denominado de ciclo Threshold. A emissão dos compostos fluorescentes está diretamente relacionada à quantidade de DNA amplificado.
Foi utilizado o fluoróforo Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2X) ROX
Solution (#K0251) Thermo Scientific®, de acordo com as especificações do fabricante,
juntamente com os primers específicos elaborados para este estudo referentes aos genes de interesse. Cada reação foi amplificada em um ciclo inicial de 50°C por 2 minutos e 95°C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 94°C por 30 segundos e 58,3°C por 20 segundos. A obtenção dos dados e a determinação do número de cópias das amostras foram feitas no termociclador ExicyclerTM 96 através do software Exicycler Diagnosis3.
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