CG-Stem construct cloning

Os mecanismos biológicos envolvidos na imunossenescência estão em debate e variam da desregulação das respostas imunitárias causadas pelo envelhecimento – como o aumento da adiposidade, a presença de condições subclínicas inflamatórias, a má nutrição e/ou a diminuição dos hormônios esteróides sexuais –, até o estilo de vida adotado pela pessoa – sedentarismo – (NICKLAS; BRINKLEY, 2009). Entretanto, o mecanismo por meio do qual o aumento dos biomarcadores pró-inflamatórios podem predispor a condição de inflamação crônica sistêmica e, consequentemente, a ocorrência de doenças crônicas, é melhor compreendido examinando a resposta inflamatória ao estresse fisiológico agudo (doença, trauma, infecção) (BEAVERS et. al., 2010).

Nessa típica resposta imunitária aguda (doença, trauma, infecção), células possuidoras de antígenos encontram o hospedeiro, e secretam citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-1 e TNF-α), que colaboram com o recrutamento de células T e com o desenvolvimento da resposta imunitária antígeno- especifica (BEAVERS et. al., 2010; ROWBOTTOM & GREEN, 2000). Esses biomarcadores exercem consideráveis efeitos no metabolismo, induzindo a hiperglicemia, a dislipidemia, a resistência insulínica e o aumento da proteólise, da lipólise e da reabsorção óssea (BEAVERS et. al., 2010; PEDERSEN, 2009).

A ativação da via inflamatória em sessão aguda de exercício faz com que a prática de atividade física seja contraindicada para reduzir a inflamação crônica, entretanto evidências atuais sugerem que a resposta inflamatória aguda desempenha importante função na adaptação muscular a atividade física (BEAVERS et. al., 2010; NICKLAS & BRINKLEY, 2009; FEBBRAIO & PEDERSEN, 2002).

Inicialmente, caracterizando-se por efeitos inflamatórios, a resposta aguda ao exercício físico aumenta a atividade lipolítica e ajuda na regulação da homeostase glicolítica, por ativar

a produção de glicose hepática e/ou aumentar o consumo de glicose pelos músculos metabolicamente ativos (BEAVERS et. al., 2010; NICKLAS & BRINKLEY, 2009). Embora o mecanismo pelo qual o exercício físico modifica a resposta inflamatória e imunitária não seja inteiramente compreendido, acredita-se que a produção e a secreção aguda de citocinas derivadas das fibras musculares (miocinas), particularmente, a IL-6 derivada da fibra muscular esquelética, regulam a produção de mediadores pró-inflamatórios liberados por células mononucleares periféricas (NICKLAS & BRINKLEY, 2009; PETERSEN & PEDERSEN, 2004), bem como alteram a atividade metabólica durante o exercício (NICKLAS & BRINKLEY, 2009; PEDERSEN & FISCHER, 2007; FEBBRAIO & PEDERSEN, 2002). A figura 3 apresenta as adaptações decorrentes do exercício físico a nível local e sistêmico no perfil inflamatório.

Figura 3 - Representação esquemática das adaptações decorrentes do exercício físico a nível local e sistêmico na

melhora do estado de inflamação crônica. Respostas adaptativas nas vias inflamatórias e via redox-sensitiva no músculo esquelético, bem como potenciais respostas adaptativas nas células imunitárias inatas, podem servir na prevenção da inflamação sistêmica crônica. Adaptado de NICKLAS, BRINKLEY (2009).

A IL-6 produzida e secretada pela fibra muscular aumenta mais do que 1.000 (mil) vezes durante a ação muscular, e sua produção resulta no aumento local e sistêmico de citocinas anti-inflamatórias (IL-1ra e IL-10), inibindo a produção das citocinas TNF-α e de IL-1 de efeito pró-inflamatório (PEDERSEN et. al., 2002). Quando praticada de forma regular, a atividade física ocasiona diminuição da produção e da expressão de citocinas pró- inflamatórias pelas células mononucleares (NICKLAS; BRINKLEY, 2009).

Em concordância, ajustes adaptativos observados em fibras musculares e no sistema imunitário inato ao exercício regular contribuem para a redução dos níveis basais de citocinas pró-inflamatórias, e na redução da resposta aguda inflamatória ao exercício, incluindo

Efeitos agudos no músculo esquelético:

Respostas adaptativas do músculo esquelético:

↑La ça e to ioci as (IL-6 & IL-8) ↑EROS & Atividade do NO

↓IL-6, TNF-α & IL-1β ↓EROS e Atividade do NO

↓Concentrações sistêmicas de

biomediadores pró-inflamatórios

↓Estado pró-inflamatório Sessão aguda de exercício

Repetidas sessões de exercício

Células sanguíneas mononucleares periféricas:

↓da produção de citoci as pró-inflamatórias

Fígado:

↓Reage tes de fase aguda (PCR, fibrinogênio, SAA)

modificações nos níveis de TNF-α, o IFN- e a IL-1 (NICKLAS & BRINKLEY, 2009; PEDERSEN & FISCHER, 2007; PETERSEN & PEDERSEN, 2005).

Smith et. al. (1999) evidenciaram que o treinamento aeróbio em adultos com risco de isquemia cardíaca resultou em redução de 58% (cinquenta e oito por cento) na produção de citocinas aterogênicas (IFN- , TNF-α e IL-1) e em aumento de 36% (trinta e seis por cento) na produção de citocinas ateroprotetoras (IL-10, IL-4, TGF- 1). Timmerman et. al., (β008) observaram que o treinamento físico reduz o número de monócitos CD14+ CD16+, e a produção de TNF-α por monócitos em idosos saudáveis. Além de reduzir a expressão de receptores toll-like-4 e receptores de lipopolissacarídeos que contribuem para atenuar a resposta imunitária aguda (MCFARLIN et. al., 2006; GLEESON et. al., 2006; STEWART et. al., 2005).

Ademais, a expressão músculo-esquelética de IL-8 aumenta com o exercício físico agudo, e essa mudança pode desempenhar importante função, estimulando a angiogênese (AKERSTROM et. al., 2005). De fato, o exercício físico regular aumenta a concentração de IL-6, que inibe a produção de TNF-α presente na inflamação crônica sistêmica (NICKLAS & BEAVERS, 2009; PETERSEN & PEDERSEN, 2004).

Alguns estudos fornecem informações que podem contribuir para entender os efeitos de repetidas sessões de exercício físico (em nível muscular - ação muscular), na melhoria do estado inflamatório a longo prazo. Entre esses efeitos, podemos citar: mudança no fenótipo dos monócitos (especificamente, redução na produção das células imunitárias produtoras de mediadores inflamatórios com o exercício físico regular) (SMITH et. al., 1999), adaptações locais a nível músculo esquelético e sistêmico (PEDERSEN, 2009; TIMMERMAN et. al., 2008), adaptações na geração intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROS) e produção de óxido nítrico (NO) (SCHEELE et. al., 2009).

Não obstante, a produção de citocinas pode ser afetada por outros fatores fisiológicos, que se alteram com a prática de exercício físico, como: hormônios de estresse, acidose, estresse oxidativo, calor, entre outros (RANDOM-AIZIK et. al., 2007).

Em repouso, as taxas de produção EROS e NO orgânico são reduzidas, sofrendo, transitórias elevações na sua produção durante o esforço agudo, exercendo importante função na ativação no mecanismo de defesa anti-inflamatória (SCHEELE et. al., 2009). O aumento dos EROS pode ativar a tradução do fator de transcrição nuclear (NF-кB), provocando uma regulação na síntese de inúmeras citocinas pró-inflamatórias (PEDERSEN; FEBBRAIO, 2008). Já com a prática crônica de atividade física, essas moléculas exercem função na

expressão muscular dos seus genes, codificando enzimas antioxidantes e proteínas de choque térmico (BROOKS et. al., 2008).

O aumento das enzimas antioxidantes e das proteínas de choque térmico ajuda a proteger o músculo esquelético contra exposições subsequentes de EROS. Com isso, os EROS atuam nos efeitos catabólicos do TNF-α em nível muscular, que, com a sua redução, pode atenuar a resposta inflamatória, diminuindo a degradação proteica (NICKLAS; BRINKLEY, 2009). Já a redução nas concentrações de NO, com a atividade física regular, implica em reduzido conteúdo da nitrotirosina muscular-esquelética, um marcador de dano protéico derivado do NO (GIELEN et. al., 2003).

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Os procedimentos experimentais adotados no presente estudo estão descritos no artigo de Cordova et. al. (2011), intitulado Long-term resistance training is associated with reduced

circulating levels of IL-6, IFN-gamma and TNF-alpha in elderly women publicado no

periódico Neuroimmunomodulation, volume 18, nº 03, p.165-70, 2011 (APÊNDICE B). As informações e a descrição dos procedimentos da pesquisa referentes à amostra, aos aspectos éticos da pesquisa (oficio Comitê de Ética em Pesquisa/UCB Oficio N. 014/2010 – ANEXO B; termo de consentimento livre e esclarecido – APÊNDICE C; critérios de inclusão e exclusão do estudo), a anamnese e os exames clínicos (APÊNDICE D), o protocolo de TR, a avaliação das medidas antropométricas e da composição corporal e a avaliação nutricional (registro de consumo alimentar – ANEXO A), estão presentes no artigo supracitado.

4 RESULTADOS

No artigo de Cordova et. al. (2011) (APÊNDICE B) estão presentes os achados e os comentários mais relevantes acerca dos resultados do estudo (caracterização da amostra – Tabela 1 do artigo, efeitos do treinamento resistido nos níveis circulantes de TNF-α, IL-6 e IFN- – Tabela 2 do artigo, e, correlação dos níveis circulantes de IL-6, TNF-α e IFN- com medidas de composição corporal – Figura 1 do artigo).

5 DISCUSSÃO

O principal objetivo do presente estudo foi investigar a associação entre adaptações induzidas por programa de TR sobre os níveis circulantes dos mediadores pró-inflamatório IL-6, TNF-α e IFN- em idosas.

Até o presente momento nenhuma pesquisa havia analisado, em conjunto, as adaptações induzidas pelo TR em idosas nos níveis de mediadores pró-inflamatórios, tendo medidas de ingestão de macro e micronutrientes como covariantes.

Os principais achados foram que idosas adaptadas ao TR de longa duração (cerca de 8 meses) apresentaram menores concentrações séricas de IL–6, TNF–α e IFN– em relação ao grupo de sedentárias. Na perspectiva de que a adiposidade constitui importante fonte de adipocinas, especificadamente, IL–6 e TNF–α, e que variações na MG representam fator de confundimento em pesquisas que investigam a correlação entre mediadores pró-inflamatórios e adaptações induzidas pelo treinamento físico, nosso estudo também incluiu as variáveis IMC e MGR como covariantes.

No entanto, este controle estatístico não eliminou a significativa disparidade nas concentrações circulantes de mediadores pró-inflamatórios entre os grupos investigados (Tabela 2). Os achados deste estudo sugerem que os benefícios da adaptação ao TR podem advir de mecanismos fisiológicos não inteiramente dependentes daqueles relacionados com alterações da adiposidade, em particular na região mesentérica. Uma hipótese consiste no fato de idosas adaptadas ao TR exibirem expressão reduzida de receptores toll-like-4 (TLR-4) em monócitos (FLYNN et. al., 2003). Receptores Toll-like-4 são reconhecidos por ativar o fator de transcrição nuclear kB (NF–kB) e promover a expressão de diferentes citocinas pró-

inflamatórias, tais como TNF-α e IL-6 (KANAYAMA et. al., 2004).

Mediadores pró-inflamatórios possuem propriedades hormonais que induzem e/ou agravam condições metabólicas, patologias associadas à idade, constituindo ligação entre fatores de estilo de vida e alterações imunitárias e endócrinas, fenômenos chaves no processo de envelhecimento (STRAUB et. al., 2000). Efeitos endócrinos do TNF-α, por exemplo, incluem resistência insulínica e disfunção endotelial (BRUUNSGAARD, PEDERSEN, 2003), enquanto IL-6, liberada a partir do tecido adiposo, afeta o metabolismo de lipídios e da glicose, causando um estado aterogênico (TONET et. al., 2008; FERNANDEZ-REAL et. al., 2000). Além disso, o biomarcador pró-inflamatório TNF-α inibe a diferenciação miogênica e promove o catabolismo protéico, uma vez que esse marcador reduz a síntese protéica

muscular esquelética, por retardar a iniciação da tradução (DIRKS et. al., 2009; PETERSEN et. al., 2009).

Além da hipótese de que a expressão reduzida de TLR-4 em monócitos possa explicar as concentrações de mediadores pró-inflamatórios em idosas treinadas, ajustes adaptativos, a nível intracelular, observados em fibras musculares e no sistema imunitário inato ao exercício regular contribuem para a redução dos níveis basais de citocinas pró-inflamatórias (Tabela 2), bem como na redução da resposta inflamatória a uma sessão aguda de exercício, incluindo a diminuição das concentrações dos mediadores pró-inflamatórios TNF-α, do IFN- e da IL-1 (NICKLAS & BRINKLEY, 2009; PEDERSEN & FISCHER, 2007; PETERSEN & PEDERSEN, 2005). Smith et. al. (1999), ao investigarem os efeitos do exercício aeróbio a longo prazo na atividade aterogênica de células mononucleares sanguíneas, observaram que o treinamento aeróbio em adultos com risco de isquêmia cardíaca resultou em diminuição de 58% (cinquenta e oito por cento) na produção de citocinas aterogênicas (IFN- , TNF-α e IL- 1) e em aumento de 36% (trinta e seis por cento) na produção de citocinas ateroprotetoras (IL- 10, IL-4, TGF- 1).

Adiciona-se a essa evidência o achado que sessão aguda de exercício reduz o aumento de TNF-α induzida por endotoxina em humanos (STARKIE et. al., β00γ), como também diminui os níveis de TNF-α em ratos (KELLER et. al., β004), sugerindo, assim, que o exercício físico, seja TR ou aeróbio, pode proteger contra inflamação crônica sistêmica por mecanismo de sinalização intramuscular IL-6-independente. Nesse sentido, o TR de longa duração em idosas pode ser uma terapia não medicamentosa e anti-inflamatória eficaz contra inflamação crônica sistêmica, fenômeno este presente na fisiopatologia de agravos à saúde típicos dessa população.

Outros autores têm apresentado interessantes resultados com relação aos efeitos crônicos do exercício físico em variáveis do sistema imunitário e relacionando-os ao fenômeno do inflammaging ou mesmo ao efeito anti-inflamatório do exercício. Smith et. al. (1999) verificaram que o estresse fisiológico decorrente da realização de contrações musculares crônicas pode induzir alterações funcionais em fagócitos mononucleares, reduzindo níveis de TNF-α e, indiretamente, de IFN- por atividade de citocinas anti- inflamatórias. Nesse sentido, tem sido recentemente observado que IL-10 derivada de células mononucleares atua como antagonista natural do TNF–α (FUJIWARA, KOBAYASHI, β005; PETERSEN, PEDERSEN, 2005), possivelmente por inibir a sinalização pelo fator NF–kB (KANAYAMA et. al., 2004). É importante destacar que, embora pesquisas em modelos animal (ZANCHI et. al., 2010) e humano (BAUTMANS et. al., 2005) têm sugerido menor

atividade inflamatória mediante efeitos do TR, uma contribuição da IL-10 permanece duvidosa. Novos estudos devem esclarecer exatamente como o TR contribui com a regulação negativa do perfil inflamatório, característica da inflammaging.

Ademais, a intensidade, a duração da intervenção e o tipo de ação muscular prescrita aparecem como fatores que podem influenciar nas concentrações basais dos mediadores pró- inflamatórios, todavia, o mecanismo exato desse fenômeno é desconhecido (DE SALLES et. al., 2010; PETERSEN, PEDERSEN, 2005; FEBRRAIO, PEDERSEN, 2002). Petersen e Pedersen (2005), ao investigarem o efeito anti-inflamatório do exercício físico, observaram que a IL-6 pode ser produzida a partir de contrações musculares (miocina) e que sua expressão e lançamento são dependentes da intensidade da atividade muscular e do número de fibras musculares recrutadas, especialmente nas contrações isotônicas.

Esses autores sugeriram que a expressão de IL-6 derivada do músculo esquelético, provavelmente, ocorre através de uma rota independente do lançamento do TNF-α, ocasionando a inibição da ação biológica deste, consequentemente, reduzindo os efeitos deletérios a nível muscular esquelético, bem como sistêmico, induzindo atividade anti- inflamatória através do lançamento do IL-1ra e IL-10 (PETERSEN & PEDERSEN, 2005)

De fato, o exercício físico regular aumenta a concentração de IL-6 derivada do músculo, que aumenta os níveis plasmáticos de citocinas anti-inflamatórias, (IL-10 e IL-1ra), que inibem a produção de TNF-α e de IL-1 , que possuem ação pró-inflamatória, presente na inflamação crônica sistêmica (NICKLAS & BEAVERS, 2009; PETERSEN & PEDERSEN, 2005).

Em nosso estudo, observamos que o grupo TR apresentou PAS marcadamente inferior ao do grupo fisicamente inativo (Tabela 1). Embora a importância quantitativa das citocinas na regulação pressórica e na patogênese da hipertensão não seja totalmente conhecida (GRANGER, 2006), resultados de estudos em modelo animal sugerem que elevados níveis de TNF-α plasmático contribuem significativamente para o aumento da pressão arterial e da resistência vascular renal (LAMARCA et. al., 2005; ALEXANDER et. al., 2002). Lee et. al. (β006) observaram que a hipertensão induzida por angiotensina ІІ depende expressivamente da presença de IL-6. E que a pressão arterial elevada ocasiona a infiltração de células inflamatórias e a formação de miofibroblastos, que contribuem para a infusão de angiotensina II, induzindo fibrose cardíaca (QI et. al., 2011). Logo, é possível que níveis cronicamente elevados de IL-6 e TNF-α no grupo de sedentárias estejam relacionados com os maiores valores de PAS em relação ao grupo TR.

Embora os efeitos do exercício físico a longo prazo, na fisiopatologia da hipertensão esteja claro, o entendimento do mecanismo molecular por meio do qual o exercício físico exerce influência nessa DCNT é desconhecido (AGARWAL et. al., 2009). Ao investigar os possíveis mecanismos envolvidos na ação profilática, a longo prazo (16 semanas), do exercício físico de intensidade moderada, em modelo animal, Agarwal et. al. (2009) verificaram o envolvimento de citocinas pró-inflamatórias, do redox homeostase e do NF-кB no desenvolvimento da hipertensão arterial. Nesse estudo, corroborando os achados da presente pesquisa, a intervenção aplicada ocasionou a diminuição dos níveis circulantes e miocárdico das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 , bem como ocasionou a melhoria da homeostase redox celular, o aumento do NO e reduziu a atividade miocárdica do NF-кB. Hipoteticamente, a redução da atividade do NF-кB decorrente do exercício físico regular está associada à redução de citocinas pró-inflamatórias e do estresse oxidativo, levando a interrupção do ciclo feedback positivo envolvido na progressão da hipertensão arterial.

Todavia, deve-se ter cautela na interpretação desse resultado, uma vez que uma distribuição desigual de patologias pregressas não consideradas na constituição da amostra pode justificar que idosas com maior predisposição à hipertensão não-idiopática possam ter preferencialmente ingressado por viés de prevalência no grupo sedentário. E futuros estudos são necessários para estabelecer ou não a possível relação causa/efeito entre os parâmetros supracitados.

Dados transformados de IL–6 e IFN– revelaram que idosas com maiores concentrações circulantes dessas citocinas apresentam menor MLGR, um indicador da massa muscular esquelética (Figura 1). Portanto, nossos dados reforçam a concepção de correlação negativa entre os níveis de mediadores pró-inflamatórios e a massa muscular adquirida por TR em população geriátrica (OGAWA et. al., 2010; VISSER et. al., 2002). Ogawa et. al (2010), ao investigarem a associação entre alterações induzidas pelo TR na densidade muscular (indicador de massa muscular) com alterações nas concentrações em marcadores pró-inflamatórios (entre eles, as citocinas, PCR, IL-6, TNF-α), encontraram uma correlação negativa entre a densidade muscular subescapular e os níveis de PCR e TNF-α. Esses autores confirmaram a hipótese de Petersen e Petersen (2005), e os resultados da presente pesquisa, do efeito anti-inflamatório do exercício, e sugeriram que TR de baixa a moderada intensidade é eficaz na diminuição do estado de inflamação crônica em idosas sedentárias.

Estudo em modelo animal também evidenciou que a administração de IL–6 incrementa a atividade proteolítica e contribui para a fraqueza muscular (GOODMAN, 1994). Em sintonia com estudos epidemiológicos que apontam neste mesmo sentido (KATULA et.

al., 2008; SAYERS, 2007), acreditamos que a constituição de uma “reserva muscular” pode contribuir com a homeostase e prolongar a autonomia funcional de idosos uma vez que refletem a efetividade do programa de TR em induzir ajustes sobre mecanismos neuroimunoendócrinos e efeitos benéficos para a saúde. Hipótese semelhante foi defendida por Pedersen (2009; 2011), segundo o qual a plenitude das funções endócrinas desempenhadas pela massa muscular perfaz condição necessária ao equilíbrio da atividade metabólica e funcional de outros órgãos e sistemas, sugerindo que as miocinas estejam associadas aos efeitos benéficos da prática de exercício físico regular sobre a saúde, especialmente, na prevenção das doenças crônicas relacionadas à inflamação crônica sistêmica e distúrbios metabólicos.

É importante mencionar que a covariante ingestão calórica revelou significativo impacto sobre os níveis de IL–6 circulantes. De fato, as idosas adaptadas ao TR evidenciaram ingestão calórica significativamente menor quando comparadas ao grupo sedentário, provavelmente, como reflexo de diferenças na ingestão de carboidratos (CHO) (Tabela 1). Esse resultado é relevante, uma vez que o aspecto quantitativo relacionado com a ingestão de nutrientes é citado como fator capaz de induzir alterações nas respostas imunitárias, tanto celular, quanto humoral (BISHOP et. al., 1999). Há evidências de que programas alimentares com níveis reduzidos de CHO acentuam a produção de citocinas anti-inflamatórias e promovem redução daquelas com atividade pró-inflamatórias (GRANGER, 2006; BAUTMANS et. al., 2005).

Outros autores (HAN & REN, 2010; MARZETTI et. al., 2009) demonstraram, através de evidencias clínicas e experimentais, que a distribuição dos macronutrientes na alimentação, em especial o CHO, é capaz de retardar o processo de envelhecimento e o desenvolvimento de DCV. Nesse sentido, os benefícios para a saúde com o adequado consumo de macronutrientes é decorrente de adaptações bioquímicas celulares a nível de homeostase redox, de inflamação, de apoptose e de autofagia, que de forma crônica proporcionam a supressão da produção de EROS e da instalação do processo inflamatório crônico sistêmico (HAN; REN, 2010). No presente estudo, o grupo adaptado ao TR mostrou menor ingestão calórica, aproximadamente de 23%, quando comparado ao grupo fisicamente inativo. Sendo assim, nossos resultados sugerem que as ingestões calóricas assim como o perfil de ingestão de macronutrientes constituem variáveis a serem controladas em estudos que abordam a relação entre atividade física e mediadores pró-inflamatórios.

Ademais, os resultados de medidas celulares não evidenciaram diferenças significativas entre fenótipos leucocitários, assim como desvios percentuais em subpopulações de

neutrófilos que poderiam sugerir consumo de reserva granulocítica medular por processos infecciosos agudos, utilização de corticóides ou de exercício físico em horas que antecederam a coleta de sangue. Portanto, vigoram os cuidados com a seleção dos participantes segundo os critérios de exclusão adotados para a investigação.

5.1 LIMITAÇÕES DO ESTUDO

Amostras de conveniência e as características homogêneas dos participantes limitam a extrapolação dos resultados para a população. Ademais, devido às características transversais do trabalho, também não é possível estabelecer relação causal entre fatores ou determinar se os níveis circulantes de mediadores investigados atuam como marcadores de subjacentes