O PCR quantitativo em tempo real (qPCR) é utilizado para quantificar a expressão de um determinado gene em diferentes amostras.
Uma reacção de PCR possui três fases distintas: a fase exponencial durante a qual ocorre a duplicação do ácido nucleico em cada ciclo, em reacções 100% eficientes; a fase linear na qual a taxa de amplificação decresce um pouco, devido ao consumo dos reagentes durante a fase exponencial; e a fase plateau na qual a reacção de amplificação termina. A principal diferença entre o PCR convencional e o qPCR é que o qPCR torna possível determinar a quantidade de ácido nucleico durante a fase exponencial, enquanto que o PCR convencional apenas permite determinar a quantidade final de ácido nucleico, na fase plateau. Desta forma, com o qPCR é possível determinar a quantidade inicial, relativa ou absoluta, do ácido nucleico.
Para a quantificação dos níveis de expressão de um gene, é necessário definir o valor de threshold. O threshold é o nível arbitrário de fluorescência
produzida pela reacção que é possível distinguir do background, e que ocorre durante a fase exponencial, geralmente entre o 3º e o 15º ciclo. O ciclo de theshold (Ct) é definido como o número de ciclos do PCR em que cada amostra atinge o threshold. Este valor é utilizado na quantificação absoluta, ou relativa de ácido nucleico. Se um gene tem maior expressão, atingirá o threshold mais rapidamente do que um gene que é menos expresso. Assim, as amostras nas quais o gene em estudo tem uma expressão aumentada terão Ct menores do que amostras que tenham menor expressão do mesmo gene.
Existem dois métodos de detecção utilizados em qPCR: TaqMan® e SYBR® Green (Applied Biosystems). Neste trabalho utilizou-se o método baseado nas sondasTaqMan®.
As sondas TaqMan® têm uma especificidade elevada, pois contêm um oligonucleótido, que hibrida especificamente com uma sequência do gene que se pretende estudar, ligado a um fluorocromo reporter (neste trabalho utilizou-se o fluorocromo FAMTM) na extremidade 5’ e um quencher sem fluorescência
Figura II.1 - Amplificação com sondas TaqMan®. A preto estão representados fragmentos de DNA. A vermelho estão representados os primers. R – Reporter; Q –
(nonfluorescent quencher, ou NFQ) na extremidade 3’. Quando ligado à sonda, o fluorocromo reporter encontra-se suficientemente próximo do quencher, para que este reduza a sua emissão de fluorescência. Na fase de extensão, a Taq polimerase, que tem actividade de nuclease 3’-5’, cliva o fluorocromo reporter que se encontra na região 5’ da sonda, afastando-o do quencher (Figura II.1). Desta forma, a amplificação prossegue e a fluorescência do repórter é emitida e detectada pelo aparelho de qPCR. A fluorescência emitida é proporcional à quantidade de produto de PCR.
A quantificação relativa é usada para analisar variações na expressão génica numa dada amostra, em relação a uma outra amostra (ou pools de amostras) de referência, designada por calibrador. A quantidade de ácido nucleico alvo em cada amostra é expressa relativamente à quantidade presente no calibrador.
No método da curva-padrão, constrói-se uma curva de calibração, uma relação linear entre o Ct e o logaritmo da quantidade inicial de ácido nucleico alvo na amostra padrão. Para tal, utiliza-se uma série de diluições de uma amostra de concentração conhecida, e que expressa o gene em estudo. Para corrigir variações nas quantidades de RNA em cada amostra, e nas eficiências de transcrição reversa e PCR, amplifica-se em paralelo um controlo endógeno, para todas as amostras. O controlo endógeno é um segmento de mRNA que se encontra presente em todas as amostras em estudo, em quantidade aproximadamente constante e que não é afectada pelo procedimento experimental. Geralmente, selecciona-se um gene constitutivo (housekeeping). Desta forma, a quantidade de ácido nucleico alvo é normalizada, dividindo a quantidade obtida para o gene em estudo, pela quantidade de referência endógena (Ct/quantidade). Por fim, obtêm-se os valores de expressão relativa, dividindo cada valor normalizado para cada amostra, pelo valor do calibrador.
O molde para a amplificação por qPCR são cadeias de cDNA, sintetizado a partir de RNA purificado de cada amostra (secção II.8).
Neste trabalho, utilizou-se o qPCR para quantificar os níveis de expressão do gene SNAI2 (codifica a proteína Slug envolvida na adesão celular; ver secção I.5.1.2.2) nas amostras de PDTC e ATC. O gene ACTB (codifica a β-actina) foi utilizado como gene housekeeping. Na construção da curva de calibração do gene SNAI2, utilizou-se uma amostra de ATC com expressão elevada do gene, diluída em 4 concentrações (2000; 200; 20 e 2 ng). A curva de calibração do gene ACTB foi construída a partir de uma pool de controlos normais comercial, diluída em 4 concentrações (1000; 125; 15,6 e 1,9 ng). As quantidades mencionadas são relativas à quantidade de RNA utilizado na síntese de cDNA. Para cada gene, foi incluído um controlo negativo, sem cDNA (NTC – non-template control). Todas as amplificações por qPCR foram realizadas em triplicado, em placas de 96 poços (MicroAmp Optical 96-well reaction plate, Applied Biosystems).
As reacções de Taqman foram executadas seguindo o protocolo do fabricante (Applied Biosystems). Preparou-se uma diluição de 1:8 do cDNA de cada amostra com H2O destilada estéril, que foi usada para a reacção de qPCR. O valor desta diluição foi previamente testado, e permitiu manter os valores de Ct das amostras razoáveis, e entre os valores abrangidos pelas curvas de calibração. Para além disso, a diluição do cDNA foi importante também, para diluir os reagentes utilizados para a síntese de cDNA, que poderiam interferir na reacção de qPCR.
Para cada amostra preparou-se, em gelo, a seguinte reacção para um volume final de 20 μl: 2 µL da diluição do cDNA da amostra, 1 µL de sonda TaqMan (Gene Expression Assay; Applied Biosystems) 20x concentrada, para cada gene, 10 µL de Master Mix de PCR TaqMan 2x concentrada (Applied Biosystems), 7 µL de H2O destilada estéril até perfazer o volume final.
As reacções foram iniciadas com uma desnaturação a 95ºC durante 10 minutos, que foi seguida de 45 ciclos de amplificação. Cada ciclo consistiu numa fase de desnaturação, durante 15 segundos a 95ºC e uma fase de annealing e extensão a 60ºC durante 1 minuto. Os qPCR foram realizados no ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), monitorizado através do software SDS (Applied Biosystems), no qual também foi efectuada a análise dos resultados.
Os qPCR realizados neste trabalho foram executados com a colaboração do Dr. Jaime Pita, do nosso grupo.