Butikk image

Brotações com 4-5 cm de comprimento, foram inoculadas em meio de cultura MS/2 + 100 mgL-1 _{de carvão ativado, suplementado com 0, 1, 2 e 4 mgL}-1 _{de NAA ou}

IBA. O tratamento 0 mgL-1 _{foi tomado como controle. No experimento com meio semi-sólido,}

O experimento foi conduzido em DIC, totalizando 4 tratamentos, sendo: 0 - controle - MS/2 + 100 gL-1 de carvão ativado; 1 - MS/2 + 100 gL-1 de carvão ativado + 1 mgL-1 de NAA ou IBA; 2 - MS/2 + 100 gL-1 de carvão ativado + 2 mgL-1 de NAA ou IBA; 3 - MS/2 + 100 gL-1 de carvão ativado + 4 mgL-1 de NAA ou IBA.

Para a instalação de todos os experimentos, utilizou-se brotações previamente repicadas com 30dias, aproximadamente, padronizando o comprimento da parte aérea. Para todos os tratamentos, em todos os experimentos, utilizou-se 10 mL de meio e o pH foi ajustado para 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem. Cada tratamento constituiu-se de 6 repetições e 5 cubetas/repetição. Para os tratamentos em meio líquido, utilizou-se papéis de filtro como suporte sólido.

Os experimentos foram instalados utilizando-se cubetas de vidro (25 x 85 mm), tampadas com tampa plástica e vedadas com parafilme. As cubetas foram colocadas em sala de crescimento sob condições controladas de temperatura 26 ± 1ºC, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 25 μmol.m-2_.s-1_{, fornecida por lâmpadas do tipo fluorescente}

branca fria.

Foram realizadas avaliações quanto a % de enraizamento, número e comprimento de raiz, comprimento da parte aérea e formação de calos. Nos experimentos 1 e 2, realizou-se apenas uma avaliação aos 30 dias para as espécies M. illustris e A. arvense. Para a espécie M. velutina, foram realizadas avaliações aos 30 e 60 dias. Nos experimentos 3 e 4, realizou-se avaliações aos 30 e 60 dias para todas as espécies em estudo. Nos demais experimentos, realizados somente com a espécie M. velutina, realizou-se uma avaliação aos 60 dias. Para a medição do comprimento das raízes e da parte aérea, utilizou-se uma régua.

3.2 DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES NATURAIS DE Mandevilla velutina (Mart.) Woodson E INTRODUÇÃO IN VITRO DE DIFERENTES GENÓTIPOS PARA A CONSERVAÇÃO EM BANCO DE GERMOPLASMA 3.2.1 Análise da diversidade genética

3.2.1.1 Coleta

Folhas de M. velutina foram coletadas no Estado de São Paulo, nos municípios de São Carlos (SC) e Pedregulho (PD) e no Estado de Minas Gerais, no município de Araxá (AR), compondo 67 indivíduos. Folhas jovens de cada acesso foram acondicionadas separadamente em tubos falcon devidamente identificados contendo sílica gel azul e posteriormente estocadas no freezer a - 2ºC até o momento da extração.

A coleta foi aleatória e os dados de localização geográfica foram mapeados por Sistema de Posicionamento Global (GPS).

Uma exsicata foi depositada no Herbário de Plantas Medicinais da Universidade de Ribeirão Preto (HMP – UNAERP, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil), sob o número nº 013.

3.2.1.2 Extração do DNA

O DNA genômico de folhas jovens foi isolado conforme protocolo proposto por Doyle & Doyle (1987); seguido de uma purificação, onde o DNA foi ressuspendido em 500μL de solução 1M de NaCl, onde permaneceu em banho-maria a 65ºC por 5 min. Posteriormente, foi incubado a 4ºC por 30 min e centrifugado a 12.000 G/5min. O sobrenadante contendo DNA foi transferido para um outro tubo no qual foi adicionado 350μL de isopropanol. Após 10 min de repouso, houve a precipitação e o material foi centrifugado a 12.000 G; 5min. Em seguida, descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi lavado duas vezes em etanol 70% seguido de centrifugação a 12.000 G/5min. Após uma hora de secagem a temperatura ambiente, o sedimento foi ressuspendido em 100μL de água miliQ.

O DNA extraído foi quantificado através da visualização da banda, sobre luz ultravioleta, em gel de agarose 1% (p/v) e corante de brometo de etídeo. Esse DNA foi comparado com DNA padrão (de fego lambda) de concentrações conhecidas.

3.2.1.3 Otimização do Protocolo de amplificação RAPD

As amostras de DNA de M. velutina foram avaliadas inicialmente com 100 iniciadores (Operon Life Technology e Biosynthesis Incorporated), dos quais foram selecionados 11 (Tabela 98). A partir do protocolo de amplificação de Ferreira & Gratapaglia (1998), diferentes concentrações dos seguintes componentes da reação foram testadas: enzima Taq polimerase (Pharmacia), (0,5 a 5,5 U, com intervalo de 0,5), cloreto de magnésio (Pharmacia), (20 a 65 mM, com intervalo de 5), DNA molde (5 a 55 ng, com intervalo de 5), iniciador (0 a 100 ng, com intervalo de 10) e diferentes temperaturas de anelamento de 39°, 40°, 41° e 45°C (termociclador M J Research, Ic., modelo PTC-100 Programmable Thermal Controller). Os produtos da reação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% (p/v) corado com brometo de etídeo. Marcadores de peso molecular de DNA (100 pb e 50 pb) foram adicionados em cada gel. Todos os reagentes utilizados foram da Amersham Biosciensces do Brasil LTDA. Os géis foram fotografados sob luz ultravioleta (aparelho Image Master® VDS, Pharmacia Biotech). Somente as bandas reprodutíveis em diferentes análises foram consideradas. As amplificações fracas que eventualmente ocorreram foram excluídas. Amostras controle, contendo todos os produtos da reação exceto DNA, foram avaliadas para verificar a não auto-amplificação ou a presença de contaminantes. A partir da ausência ou presença de bandas amplificadas, confeccionou-se uma matriz binária.

3.2.1.4 Variabilidade genética dentro e entre populações

Os dados binários (presença ou ausência de bandas nos indivíduos) obtidos a partir do RAPD foram utilizados para estimar as freqüências alélicas, com base na correção proposta por Lynch & Milligan (1994). Primeiramente foi realizada uma análise descritiva da variabilidade total calculando-se a porcentagem de locos polimórficos, a

diversidade de Nei (1973, 1978) e o índice de Shannon (Ashburner et al. 1997; Lewontin 1972, citado por Gauer & Cavalli-Molina 2000).

As distâncias genéticas de Nei (1978) foram utilizadas em uma análise de agrupamento do tipo UPGMA (“Unweighted Pair-Group Method by Arithimetic Averages) (Ferreira & Crattapaglia, 1998), mostrando a relação entre as populações.

A segunda forma de decompor a variância utilizada neste trabalho foi a AMOVA (Análise da Variância Molecular), conforme proposto por Excoffier et al (1992). Para tanto utilizou-se os programas TFPGA (Miller 1997), AMOVA-PREP 1.01 (Miller 1998) e WINAMOVA 1.04 (Excoffier, 1992), onde as freqüências alélicas foram submetidas a uma análise de variância de freqüências alélicas (Weir 1996; Telles, 2000), que permite a decomposição da variância genética total em seus componentes entre e dentro de populações, possibilitando a avaliação da estruturação da variabilidade.

3.2.2 Introdução dos genótipos in vitro

O desenvolvimento do protocolo adequado para o estabelecimento do banco de germoplasma in vitro de M. velutina, foi realizado por Biondo (2003).

Para a introdução dos genótipos in vitro, como explantes, foram utilizados segmentos nodais contendo uma gema axilar ou apical de plantas conservadas em casa de vegetação.

3.2.2.1 Assepsia

As plantas foram borrifadas com uma solução de Cercobin® (1%) + gentamicina® (80 mgL-1), em água destilada, a cada 24 horas, durante uma semana.

Os segmentos nodais (1 cm) foram lavados com detergente para a retirada de contaminantes superficiais e colocados em água corrente por duas horas. Posteriormente, foram submergidos em solução de Cercobin® (0,2% p/v) por 24 h sob agitação de 80 rpm.

Após este tratamento, os explantes foram transferidos para solução de hipoclorito de cálcio (0,5% p/v) por 20 min e inoculados diretamente em meio MS basal + 2 gL-1 de fitagel® (Murashige & Skoog, 1962), sem lavagem prévia em água.

Os explantes foram deixados em sala de crescimento onde realizou-se avaliações semanais quanto a porcentagem de contaminação durante quatro semanas.

3.3 AVALIAÇÃO DA INFECÇÃO MICORRÍZICA E IDENTIFICAÇÃO DE