begrensninger i beregningene
8.5 BOS Nordlandsbanen
dos animais submetidos ao tratamento com doses repetidas (28 dias) de EHZB.
Pode-se observar que houve uma diminuição significativa no consumo de ração por parte dos camundongos machos tratados com as doses de 500 mg/kg (32,4 ± 1,6 g; p<0,05) e 1000 mg/kg (29,7 ± 1,0 g; p<0,05) de EHZB em comparação com o controle (40,6 ± 1,3 g), assim como, uma diminuição significativa no consumo de ração em todos os grupos de camundongos fêmeas tratados com EHZB (27,1 ± 0,8 g; 30,9 ± 0,9 g; 39,4 ± 1,3 g para os grupos tratados com 250, 500 e 1000 mg/kg, respectivamente; p<0,05) quando comparados ao grupo controle (45,6 ± 1,7 g).
Também pode-se observar uma diminuição significativa no consumo de água por parte dos animais machos tratados com as doses de 500 mg/kg (46,6 ± 1,4 mL; p<0,05) e 1000 mg/kg (45,2 ± 1,5 mL; p<0,05) de EHZB, quando comparados ao grupo controle (54,0 ± 2,1 mL). Além disso, houve um aumento significativo no consumo de água no grupo de camundongos fêmeas tratados com EHZB apenas na dose de 1000 mg/kg (51,8 ± 1,8 mL; p<0,05 ) quando comparado ao grupo controle (43,8 ± 1,0 mL).
Não foram observadas alterações significativas na evolução ponderal dos animais tratados com as diferentes doses de EHZB.
62
Tabela 3 - Consumo de água e ração, e evolução ponderal de camundongos submetidos ao
tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose (mg/kg) Gênero Consumo de ração (g) Consumo de água (mL) Peso inicial (g) Peso final (g) Controle - M 40,6 ± 1,3 54,0 ± 2,1 29,6 ± 0,9 37,7 ± 1,2 F 45,6 ± 1,7 43,8 ± 1,0 27,0 ± 0,6 33,2 ± 0,7 EHZB 250 M 43,0 ± 1,5 55,1 ± 2,2 29,7 ± 0,6 38,4 ± 1,1 F 27,1 ± 0,8a 41,5 ± 1,5 25,4 ± 0,7 32,4 ± 1,3 EHZB 500 M 32,4 ± 1,6 a 46,6 ± 1,4a 26,9 ± 0,8 41,7 ± 1,3 F 30,9 ± 0,9a 42,9 ± 1,3 25,4 ± 0,5 36,2 ± 0,6 EHZB 1000 M 29,7 ± 1,0 a 45,2 ± 1,5a 28,3 ± 0,7 39,2 ± 1,2 F 39,4 ± 1,3a 51,8 ± 1,8a 25,6 ± 0,3 35,8 ± 0,8
Dados estão apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais, analisados por ANOVA seguido por Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle.
5.3.2 Avaliação da temperatura corporal e glicemia
No que se refere à temperatura dos camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas de EHZB, não foram observadas alterações significativas desse parâmetro, nos diferentes períodos analisados, em nenhum dos gêneros, quando comparado ao grupo controle (Tabela 4).
Tabela 4 – Temperatura de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Temperatura (ºC)
Basal 14 dias 28 dias
Controle - M 35,6 ± 0,2 34,7 ± 0,5 36,4 ± 0,3 F 34,9 ± 0,2 35,1 ± 0,3 34,5 ± 0,3 EHZB 250 M 35,7 ± 0,2 34,9 ± 0,3 36,5 ± 0,4 F 34,2 ± 0,2 35,1 ± 0,1 34,9 ± 0,7 EHZB 500 M 36,5 ± 0,3 35,1 ± 0,3 36,6 ± 0,6 F 34,7 ± 0,2 34,7 ± 0,3 35,7 ± 0,5 EHZB 1000 M 35,7 ± 0,2 34,6 ± 0,2 35,8 ± 0,2 F 35,0 ± 0,2 35,6 ± 0,2 34,5 ± 0,2 Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey.
63
Em relação à glicemia dos animais, observou-se um aumento significativo nos animais fêmeas nas doses de 500 mg/kg (115,8 ± 6,7 mg/dL; p<0,05) e 1000 mg/kg (146,5 ± 3,6 mg/dL; p<0,05), após 28 dias de tratamento com EHZB, em comparação com o controle (83,5 ± 5,6 mg/dL) (Tabela 5).
Os camundongos machos por sua vez, não apresentaram alterações significativas no parâmetro glicemia durante os 28 dias de tratamento (Tabela 5).
Tabela 5 – Glicemia de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Glicemia (mg/dL)
Basal 14 dias 28 dias
Parâmetros - M 80 - 160 - - normais * F 80 – 150 - - Controle - M 173,4 ± 15,3 118,7 ± 2,7 123,4 ± 5,3 F 109,9 ± 6,2 124,2 ± 9,8 83,5 ± 5,6 EHZB 250 M 166,9 ± 16,3 122,6 ± 8,7 136,9 ± 9,2 F 115,9 ± 5,2 134,0 ± 8,5 92,8 ± 5,4 EHZB 500 M 148,1 ± 10,3 137,2 ± 9,9 149,0 ± 6,3 F 143,9 ± 6,3 132,0 ± 9,1 115,8 ± 6,7a,b EHZB 1000 M 202,6 ± 10,2 156,7 ± 9,6 135,7 ± 4,8 F 103,0 ± 8,6 133,3 ± 8,6 146,5 ± 3,6a,b
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisado por ANOVA seguido de Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle. bp < 0,05 comparado ao grupo EHZB
250 mg/kg. * Fonte: Gad, 2007.
5.3.3 Avaliação da atividade exploratória
No teste do campo aberto observou-se um aumento significativo na ambulação dos animais fêmeas tratados com a dose de 1000 mg/kg (56,7 ± 4,7;
p<0,05) de EHZB quando comparado aos animais do grupo controle após 28
64
Tabela 6 – Ambulação no teste de campo aberto de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Ambulação (nº de quadrantes)
Basal 14 dias 28 dias
Controle - M 61,4 ± 4,2 35,4 ± 4,2 38,0 ± 5,1 F 60,7 ± 5,6 50,2 ± 5,3 36,6 ± 3,4 EHZB 250 M 58,0 ± 7,9 43,8 ± 3,9 37,0 ± 1,4 F 40,9 ± 9,5 39,3 ± 4,9 42,6 ± 3,8 EHZB 500 M 46,7 ± 3,6 29,2 ± 5,3 36,3 ± 2,4 F 44,0 ± 5,6 34,1 ± 4,5 36,4 ± 2,9 EHZB 1000 M 42,2 ± 3,1 35,6 ± 5,0 40,3 ± 3,1 F 45,4 ± 7,8 43,9 ± 4,3 56,7 ± 4,7a,b
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisado por ANOVA seguido de Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle. bp < 0,05 comparado ao grupo EHZB
500 mg/kg.
Ainda no teste do campo aberto, em relação ao parâmetro tempo de auto- limpeza dos camundongos, não foram observadas alterações significativas nos animais machos ou fêmeas, submetidos ao tratamento com doses repetidas de EHZB quando comparados ao grupo controle (Tabela 7).
Tabela 7 – Tempo de auto-limpeza no teste de campo aberto de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Auto-limpeza (s)
Basal 14 dias 28 dias
Controle - M 16,7 ± 6,6 11,6 ± 2,9 7,6 ± 2,1 F 6,9 ± 2,7 14,3 ± 2,9 16,0 ± 5,5 EHZB 250 M 18,2 ± 3,7 16,8 ± 5,0 7,8 ± 2,0 F 11,0 ± 2,3 9,1 ± 2,3 8,6 ± 2,9 EHZB 500 M 16,3 ± 3,9 10,2 ± 5,6 9,6 ± 2,9 F 17,3 ± 5,9 11,5 ± 2,6 5,3 ± 1,6 EHZB 1000 M 25,3 ± 8,8 14,9 ± 2,9 13,1 ± 2,4 F 11,3 ± 3,3 16,7 ± 2,9 11,5 ± 2,3 Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey.
65
De forma semelhante, não foram observadas alterações significativas no número de levantamentos, após 14 ou 28 dias de tratamento com EHZB, quando comparado ao tempo dos animais do grupo controle (Tabela 8).
Tabela 8 – Número de levantamentos em duas patas no teste de campo aberto de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Levantamentos (nº)
Basal 14 dias 28 dias
Controle - M 4,5 ± 1,2 4,0 ± 2,0 7,3 ± 1,6 F 4,6 ± 1,2 6,8 ± 1,7 7,0 ± 1,3 EHZB 250 M 2,3 ± 0,8 8,3 ± 2,9 3,2 ±1,2 F 2,5 ± 1,0 8,3 ± 4,1 4,1 ± 1,4 EHZB 500 M 5,5 ± 1,5 7,2 ± 2,5 3,2 ± 1,0 F 3,2 ± 1,3 5,6 ± 2,7 3,5 ± 1,5 EHZB 1000 M 5,1 ± 1,9 2,3 ± 1,1 3,9 ±1,4 F 2,0 ± 1,8 5,0 ± 1,6 6,2 ± 2,0 Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey.
No que se refere à defecação, foi observado apenas uma diminuição significativa no número de bolos fecais dos animais fêmeas tratados com 1000 mg/kg de EHZB (1,7 ± 0,7; p < 0,05) quando comparados ao grupo controle (4,4 ± 0,3), após 14 dias de tratamento (Tabela 9).
66
Tabela 9 – Número de bolos fecais no teste de campo aberto de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Defecação (nº de bolos fecais)
Basal 14 dias 28 dias
Controle - M 4,1 ± 0,5 3,1 ± 0,4 1,9 ± 0,4 F 2,6 ± 0,6 4,4 ± 0,3 4,5 ± 0,8 EHZB 250 M 4,0 ± 0,9 3,6 ± 0,7 1,9 ± 0,6 F 1,0 ± 0,4 2,5 ± 0,4 2,5 ± 0,9 EHZB 500 M 1,3 ± 0,4 4,2 ± 0,5 2,8 ± 0,5 F 0,5 ± 0,3 3,8 ± 0,9 2,9 ± 0,9 EHZB 1000 M 1,5 ± 0,5 4,0 ± 0,8 3,0 ± 0,8 F 0,9 ± 0,3 1,7 ± 0,7a 2,7 ± 0,4
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle.
5.3.4 Avaliação da atividade motora
Não foram observadas alterações significativas no tempo de permanência dos animais na barra giratória do aparelho de rota-rod, após 14 ou 28 dias de tratamento com EHZB, quando comparado ao tempo dos animais do grupo controle (Tabela 10).
Tabela 10 – Tempo de permanência na barra giratória (rota-rod) de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero
Tempo de permanência na barra giratória (s) Basal 14 dias 28 dias
Controle - M 155,6 ± 15,6 171,6 ± 6,2 161,5 ± 12,4 F 168,9 ± 4,5 168,4 ± 5,6 178,6 ± 1,4 EHZB 250 M 166,0 ± 9,1 167,4 ± 10,2 176,8 ± 2,2 F 165,8 ± 4,5 173,6 ± 2,6 172,4 ± 4,1 EHZB 500 M 164,6 ± 9,6 153,4 ± 6,0 174,8 ± 5,1 F 160,6 ± 9,6 161,1 ± 7,4 173,0 ± 3,4 EHZB 1000 M 166,6 ± 6,3 164,5 ± 12,3 170,9 ± 5,1 F 151,8 ± 9,5 161,1 ± 8,2 165,2 ± 10,6 Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey.
67
5.3.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos e hematológicos
A investigação dos efeitos toxicológicos de EHZB por meio das análises bioquímicas revelou um aumento significativo na atividade enzimática de AST dos camundongos machos tratados com a dose de 1000 mg/kg (243,5 ± 15,9 U/L; p<0,05) de EHZB quando comparado ao grupo controle (155,7 ± 3,0 U/L). Não foram observadas alterações na atividade enzimática de AST nos camundongos fêmeas tratados com EHZB em nenhuma das doses, quando comparadas ao grupo controle (Tabela 11).
Pode-se observar um aumento significativo na atividade de ALT dos camundongos machos tratados com a dose de 1000 mg/kg (89,5 ± 17,1 U/L;
p<0,05) de EHZB quando comparado ao grupo controle (36,50± 6,1 U/L). Este
aumento também se fez presente nos camundongos fêmeas tratados com EHZB nas doses de 250 mg/kg (56,8 ± 9,0 U/L; p<0,05), 500 mg/kg (63,7 ± 6,8 U/L;
p<0,05), 1000 mg/kg (41,1 ± 1,3 U/L; p<0,05) quando comparados ao grupo
controle (24,2 ± 2,4 U/L).
Ainda em relação aos parâmetros bioquímicos, na avaliação da função renal, foi possível observar uma diminuição significativa da concentração sérica de creatinina dos camundongos fêmeas tratados com as doses de 250 mg/kg (0,2 ± 0,05 mg/dL; p<0,05), 500 mg/kg (0,2 ± 0,02 mg/dL; p<0,05) e 1000 mg/kg (0,2 ± 0,03 mg/dL; p<0,05) de EHZB, quando comparado ao grupo controle (0,6 ± 0,05 mg/dL).
Não foram observadas alterações significativas na concentração sérica de ureia em nenhuma das doses de EHZB testadas (Tabela 11).
68
Tabela 11 – Parâmetros bioquímicos de sangue periférico de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Grupos Dose
(mg/kg) Gênero AST (U/L) ALT (U/L)
Ureia (mg/dL) Creatinina (mg/dL) Parâmetros Normais * - M 70 - 400 25 - 200 15 - 45 0,3 – 0,8 F 70 - 400 25 - 100 15 - 40 0,2 – 0,6 Controle - M 155,7 ± 3,0 36,50 ± 6,1 43,0 ± 1,3 0,4 ± 0,08 F 164,7 ± 10,6 24,2 ± 2,4 40,3 ± 1,3 0,6 ± 0,05 EHZB 250 M 191,3 ± 13,7 56,6 ± 9,1 57,3 ± 2,4 0,6 ± 0,08 F 182,7 ± 13,4 56,8 ± 9,0a 46,5 ± 6,7 0,2 ± 0,05a EHZB 500 M 207,5 ± 3,5 61,3 ± 7,1 53,3 ± 6,5 0,6 ± 0,03 F 180,1 ± 16,7 63,7 ± 6,8a 50,9 ± 7,1 0,2 ± 0,02a EHZB 1000 M 243,5 ± 15,9 a 89,5 ± 17,1a 50,6 ± 3,6 0,4 ± 0,09 F 151,1 ± 11,5 41,1 ± 1,3a 43,3 ± 3,3 0,2 ± 0,03a
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais, analisados por ANOVA seguido por Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle. *Parâmetros normais (Fonte: Gad,
2007).
Em relação aos parâmetros hematológicos observou-se um aumento significativo no número de hemácias nos camundongos machos tratados com EHZB nas doses de 250 mg/kg (10,3 ± 0,3 106/mm3; p<0,05) e 500 mg/kg (11,1
± 0,4 106/mm3; p<0,05) quando comparados ao grupo controle (8,2 ± 0,4
106/mm3) (Tabela 12).
Também foi observado um aumento significativo na quantidade de hemoglobina nos camundongos machos tratados com EHZB nas doses de 250 mg/kg (17,5 ± 0,5 g/dL; p<0,05) e 500 mg/kg (18,7 ± 0,5 g/dL; p<0,05) quando comparados ao grupo controle (13,5 ± 1,1 g/dL) e hematócrito nas doses de 250 mg/kg (60,2 ± 1,5%; p<0,05) e 500 mg/kg (60,3 ± 2,6%; p<0,05) quando comparados ao grupo controle (45,3 ± 3,5%) (Tabela 12).
Ainda, foi evidenciada uma diminuição significativa no parâmetro Concentração Hemoglobínica Corpuscular Média (CHCM) nos camundongos machos submetidos ao tratamento com EHZB na dose de 1000 mg/kg (23,9 ± 2,2 g/dL; p<0,05) quando comparados ao grupo controle (29,5 ± 0,2 g/dL) (Tabela 12).
69
Tabela 12 – Parâmetros hematológicos de sangue periférico de camundongos machos
submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Parâmetro Parâmetros normais Controle EHZB 250 mg/kg 500 mg/kg 1000 mg/kg Hemácias (106/mm3) 9,0 – 11,3 8,2 ± 0,4 10,3 ± 0,3a 11,1 ± 0,4a 8,3 ± 0,5 Hemoglobina (g/dL) 13,5 – 17,0 13,5 ± 1,1 17,5 ± 0,5a 18,7 ± 0,5a 14,3 ± 0,9 Hematócrito (%) 45 – 55 45,3 ± 3,5 60,2 ± 1,5a 60,3 ± 2,6a 54,3 ± 2,2 VCM (fm3) 47–55 56,4 ± 1,4 58,0 ± 1,1 56,2 ± 2,0 68,3 ± 6,7 HCM (pg) 13–16 16,6 ± 0,5 17,0 ± 0,3 16,9 ± 0,5 16,5 ± 0,2 CHCM (g/dL) 29 – 34 29,5 ± 0,2 29,4 ± 0,4 30,1 ± 0,7 23,9 ± 2,2a Leucócitos totais (103/mm3) 2,0 – 10,0 5,1 ± 0,3 6,5 ± 0,8 6,0 ± 0,6 6,8 ± 0,7 Linfócitos 60 – 90 53,2 ± 5,2 63,4 ± 3,4 63,3 ± 4,6 66,4 ± 3,9 Segmentados 10 – 40 42,5 ± 4,9 30,0 ± 3,1 30,8 ± 4,2 31,4 ± 5,0 Monócitos 0 – 6 4,3 ± 0,7 5,7 ± 0,7 5,7 ± 0,7 3,57 ± 0,9 Eosinófilos 0 -5 0,00 ± 0,00 0,4 ± 0,3 0,5 ± 0,3 0,0 ± 0,0
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle. *Parâmetros normais (Fonte: Gad,
2007).
Já a análise de parâmetros hematológicos dos camundongos fêmeas submetidos ao tratamento com doses repetidas de EHZB revelou uma diminuição significativa no hematócrito nos animais tratados com a dose de 500 mg/kg (47,0 ± 1,5%; p<0,05) quando comparado ao grupo controle (51,1 ± 1,4%) (Tabela 13).
No que se refere a contagem diferencial de leucócitos, pode-se observar uma diminuição significativa no número de eosinófilos nos animais tratados com a dose de 500 mg/kg (0,4 ± 0,2 %; p<0,05) e 1000 mg/kg (0,0 ± 0,0%; p<0,05) quando comparado ao grupo controle (1,4 ± 0,3%), e uma diminuição significativa no número de monócitos nos animais tratados com a dose de 1000 mg/kg (1,3 ± 0,4%; p<0,05) quando comparado ao grupo controle (4,1 ± 0,4%) (Tabela 13).
70
Tabela 13 – Parâmetros hematológicos de sangue periférico de camundongos fêmeas
submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB.
Parâmetro Parâmetros normais Controle EHZB 250 mg/kg 500 mg/kg 1000 mg/kg Hemácias (106/mm3) 9,0 – 11,5 9,0 ± 0,2 8,6 ± 0,4 8,6 ± 0,3 9,1 ± 0,1 Hemoglobina (g/dL) 14,5 – 17,5 14,4 ± 0,4 13,7 ± 0,4 13,5 ± 0,4 14,3 ± 0,3 Hematócrito (%) 45 – 57 51,1 ± 1,4 48,6 ± 1,4 47,0± 1,5a 51,1 ± 1,5 VCM (fm3) 45–55 56,7 ± 0,9 56,8 ± 1,6 54,6 ± 1,3 56,3 ± 1,2 HCM (pg) 13–16 16,0 ± 0,3 16,0 ± 0,3 15,7 ± 0,2 16,5 ± 0,2 CHCM (g/dL) 29–34 28,3 ± 0,5 28,3 ± 0,4 28,8 ± 0,7 28,0 ± 0,4 Leucócitos totais (103/mm3) 1,0 – 12,0 3,6 ± 0,2 6,5 ± 0,8 6,0 ± 0,6 6,8 ± 0,7 Linfócitos 60 – 90 76,0 ± 2,2 78,4 ± 4,9 74,8 ± 2,6 79,6 ± 1,4 Segmentados 10 – 40 18,0 ± 2,1 16,9 ± 4,7 20,0 ± 2,5 18,4 ± 1,1 Monócitos 0 – 6 4,1 ± 0,4 4,4 ± 0,9 3,4 ± 0,4 1,3 ± 0,4a Eosinófilos 0 -5 1,4 ± 0,3 0,8 ± 0,3 0,4 ± 0,2a 0,0 ± 0,0a
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey. ap < 0,05 comparado ao grupo controle. *Parâmetros normais (Fonte: Gad,
2007).
5.3.6 Avaliação dos índices dos órgãos
Em relação aos índices dos órgãos, não foram evidenciadas alterações significativas nos grupos de camundongos machos e nas fêmeas submetidos aos tratamentos com doses repetidas de EHZB quando comparados ao grupo controle (Tabela 14).
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Tabela 14 – Índices dos órgãos de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) de EHZB. Grupos Dose (mg/kg) Gênero Índice de coração (mg/g) Índice de fígado (mg/g) Índice de rins (mg/g) Índice de baço (mg/g) Índice de timo (mg/g) Controle - M 4,7 ± 0,3 59,2 ± 0,9 14,3 ± 0,8 6,0 ± 0,7 3,0 ± 0,2 F 4,3 ± 0,2 52,2 ± 3,0 11,7 ± 0,6 6,5 ± 0,6 4,3 ± 0,2 EHZB 250 M 4,0 ± 0,2 55,7 ± 1,6 12,7 ± 0,2 4,2 ± 0,3 2,4 ± 0,2 F 4,4 ± 0,2 57,2 ± 0,8 11,2 ± 0,4 6,0 ± 0,4 3,9 ± 0,2 EHZB 500 M 3,9 ± 0,1 56,3 ± 1,3 12,7 ± 0,2 5,3 ± 0,4 2,6 ± 0,3 F 4,2 ± 0,2 57,8 ± 1,5 11,0 ± 0,5 6,2 ± 0,6 4,2 ± 0,4 EHZB 1000 M 3,8 ± 0,2 60,4 ± 2,7 12,4 ± 0,8 6,0 ± 0,5 2,9 ± 0,1 F 4,1 ± 0,1 55,0 ± 1,3 9,8 ± 1,13 6,1 ± 0,7 3,9 ± 0,2 Dados apresentados como média ± erro padrão da média de dez animais analisados por ANOVA seguido de Tukey.
5.3.7 Avaliação histopatológica
A histopatologia dos rins e fígado dos animais tratamentos com EHZB não revelou alterações significativas. No entanto, em algumas amostras do fígado foram observados leve infiltrado inflamatório, seguido de vasodilatação, estase e hemossiderose, com preservação dos hepatócitos, cordões hepáticos e manutenção da arquitetura tecidual. Nos rins dos animais tratados com EHZB, observou-se uma discreta hemorragia no córtex e medula renal externa, com hemossiderose renal cortical, discreto edema cortical nos machos seguidos da preservação dos glomérulos e túbulos renais em ambos os grupos. Achados esses que não apresentam significado clínico relevante (FIGURA 2).
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Figura 2 – Figura representativa da histopatologia do fígado e rins de camundongos submetidos ao tratamento com doses repetidas (v.o.) com EHZB. A: Controle machos (fígado). B: Controle fêmeas (fígado). C: EHZB 1000 mg/kg machos (fígado). D: EHZB 1000 mg/kg fêmeas (fígado). E: Controle machos (rins). F: Controle fêmeas (rins). Hematoxilina-eosina e Tricrômico de Masson (40 x e 100 x).
A B
C D
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5.4 Avaliação da genotoxicidade de EHZB
Para avaliar o possível efeito genotóxico in vivo de EHZB foi realizado o ensaio do micronúcleo em sangue periférico, cujo resultado está apresentado na Tabela 15.
Como esperado, a ciclofosfamida induziu um aumento significativo na frequência de eritrócitos micronucleados (17,7 ± 1,4; p<0,05) quando comparada ao grupo controle (8,3 ± 1,0).
Todavia, o tratamento dos animais com a dose de 2000 mg/kg de EHZB não induziu aumento na frequência de eritrócitos micronucleados em sangue periférico quando comparados ao grupo controle.
Tabela 15 - Frequência de eritrócitos micronucleados em sangue periférico de camundongos tratados com EHZB e ciclofosfamida.
Grupos Dose (mg/kg) N° de células micronucleadas Controle - 8,33 ± 0,99 Ciclofosfamida 50 17,67 ± 1,39a EHZB 2000 7,83 ± 0,75
Dados apresentados como média ± erro padrão da média de seis animais analisado pelo test t-
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6 DISCUSSÃO
O uso da medicina popular baseado no conhecimento tradicional não é suficiente para validar as plantas medicinais como alternativas terapêuticas eficazes e seguras (MARTINS-RAMOS; BORTOLUZZI; MANTOVANI, 2010). Por isso, existe uma necessidade iminente da realização de testes toxicológicos de plantas medicinais para garantir o seu uso seguro e para determinação de doses seguras que poderão ser utilizadas em testes farmacológicos pré-clínicos, bem como, em humanos.
Considerando que Zornia brasiliensis é uma planta medicinal utilizada pela população com fins medicinais, como agente diurético, a avaliação de sua toxicidade torna-se imprescindível para segurança da população que a utiliza.
Testes in vitro, como o ensaio de citotoxicidade em eritrócitos, são utilizados com o intuito de avaliar os danos que uma determinada amostra pode causar in vitro, estimando os danos in vivo (SCHREIER et al., 1997; APARICIO et al., 2005). Isso porque a membrana eritrocítica é uma estrutura delicada que pode ser significantemente alterada por interações com drogas (SHARMA; SHARMA, 2001; AKI; YAMAMOTO, 1991). Essas células são importantes para predizer efeitos protetores e tóxicos de substâncias ou condições associadas com estresse oxidativo, sendo um possível indicador desse tipo de dano às células (APARICIO et al., 2005; LEXIS; FASSETT; COOMBES, 2006; MUÑOZ- CASTAÑEDA et al., 2006).
A análise da atividade hemolítica de EHZB mostrou que em eritrócitos de camundongos, o extrato provocou hemólise apenas em concentrações consideradas elevadas. Essa observação, aliada ao parâmetro publicado por Dos Santos Júnior e colaboradores (2010) que relata que um produto natural em estudo, para não apresentar atividade hemolítica, deve apresentar CH50 maior Em seguida, com o objetivo de avaliar a toxicidade de EHZB in vivo, foi realizado o estudo de toxicidade pré-clínica aguda em camundongos, por via oral.
Os resultados obtidos permitem inferir que EHZB apresentou uma baixa toxicidade, nas condições avaliadas. Este dado pode ser confirmado pelo fato de que a maior parte dos parâmetros avaliados nos 14 dias de observação não
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apresentou alteração significativa. Observou-se apenas, uma diminuição significativa no consumo de ração dos camundongos tratados machos, entretanto, esta fato não provocou alterações significativas na evolução ponderal dos animais. Parâmetros metabólicos, como o consumo de água e de alimentos, e a avaliação ponderal, devem ser analisados nos estudos pré-clínicos para investigação da toxicidade de uma amostra em estudo sobre o sistema gastrintestinal ou mesmo sobre o sistema nervoso central. Entretanto, alteração em apenas um desses parâmetros não é suficiente para caracterizar toxicidade nesses sistemas.
Estes dados corroboram os resultados publicados por Belcavello e colaboradores (2012) que mostram que a espécie Zornia diphylla, também utilizada pela população para fins medicinais no tratamento de febre e congestão, e externamente para tratamento de inchaços e reumatismo, não apresentou sinais de toxicidade aguda em camundongos Swiss. Nesse estudo, para avaliação da toxicidade aguda, o extrato de Zornia diphylla foi administrado por via intraperitoneal nas doses de 50, 300, 500, 1000 e 2000 mg/kg, doses estas que não induziram os animais a óbito durante os períodos de observação de 24 e 48 horas, o que levou os autores a concluírem que a amostra possui baixa toxicidade nas condições avaliadas.
Sequencialmente, com o objetivo de avaliar o efeito da administração, por via oral, de EHZB, em um intervalo de tempo maior, mimetizando uma intoxicação subcrônica pelo extrato, foi realizado o estudo de toxicidade pré- clínica de doses repetidas.
Para este estudo foram escolhidas três doses (250, 500 e 1000 mg/kg), segundo a recomendação do Guia para a condução de estudos não clínicos de
segurança necessários ao desenvolvimento de medicamentos, publicado em
2013 pela ANVISA. Este guia preconiza que nos ensaios de doses repetidas, geralmente três doses são utilizadas, sendo a mais alta escolhida com a expectativa produzir efeitos tóxicos observáveis, mas não morte nem sofrimento intenso e respeitando-se o limite máximo de 1000 mg/kg/dia em roedores.
Após 28 dias de tratamento com EHZB, foi possível observar alterações no consumo de água e de ração, o que fornece indícios de toxicidade sistêmica. Porém, apesar da redução significativa observada nesses parâmetros, os
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mesmos não foram capazes de provocar alterações significativas na evolução ponderal dos animais mesmo após 28 dias de tratamento.
O referido guia descreve ainda estudos e parâmetros essenciais na avaliação da segurança farmacológica de novas drogas, permitindo a investigação de efeitos indesejáveis nas funções fisiológicas dos diversos sistemas orgânicos (ANVISA, 2013). Dentre os parâmetros citados no guia como de interesse nessa avaliação está a temperatura corporal.
O tratamento com doses repetidas de EHZB não foi capaz de provocar alterações significativas na temperatura corporal dos camundongos, não evidenciando, portanto, efeitos sobre o metabolismo geral.
Um dos parâmetros geralmente monitorados em um estudo de doses repetidas é a determinação da glicemia. Em consequência da toxicidade de determinadas drogas podem ocorrer alterações no metabolismo da glicose, ocasionando prejuízo a diferentes órgãos (EVANS, 2005; FONSECA; DAVIDSOBN, 2006).
A administração de EHZB por 28 dias não foi capaz de provocar alterações significativas na glicemia dos animais machos, no entanto, nas fêmeas observou-se um aumento neste parâmetro, o que pode significar uma possível influência sobre o mecanismo regulador hormonal do pâncreas.
Para a avaliação da segurança farmacológica de novas drogas estão incluídos os testes para investigação de toxicidade sobre o Sistema Nervoso Central (SNC) (ANVISA, 2013), pois diversas substâncias presentes em plantas tem a capacidade de interferir no funcionamento desse sistema produzindo deficiência psicomotora ou atividade depressora/estimulante (SÁ et al., 2013). Dessa forma, com o objetivo de investigar possíveis alterações sobre o SNC decorrentes da utilização de EHZB, realizaram-se os testes de rota-rod e campo aberto nos animais em estudo.
Não foi observada alteração significativa no tempo de permanência dos camundongos na barra giratória do aparelho de rota-rod, não evidenciando, portanto, influência de EHZB na atividade motora dos animais.
O teste de campo aberto é utilizado com frequência para avaliar o comportamento de ansiedade, entretanto avalia também sedação ou atividade exploratória do animal. É um teste que não é caracterizado como um método específico, pois não só drogas ansiolíticas (benzodiazepínicos) tem sido
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estudadas, mas também substâncias estimulantes (anfetaminas), sedativas (neurolépticos) ou drogas epileptogênicas (PRUT; BELZUNG, 2003).
Quando o teste é realizado retira-se o animal de seu ambiente familiar, ele é transferido para o aparelho de campo aberto e exposto a um novo ambiente (campo aberto e suas paredes), estes são os principais fatores ansiogênicos deste modelo (WALSH; CUMMINS, 1976; ENNACEUR; MICHALIKOVA; CHAZOT, 2006).
No teste do campo aberto, a administração repetida (28 dias) de 1000 mg/kg de EHZB aos animais fêmeas induziu um efeito estimulante no SNC demonstrado pelo aumento no parâmetro ambulação. Todavia, como esse efeito foi observado apenas no final do tratamento e com a maior dose em apenas um dos gêneros avaliados, sem alteração concomitante dos outros parâmetros (número de levantamentos e tempo de auto-limpeza), sugere-se que outros estudos necessitam ser realizados para uma melhor investigação desse efeito.
O fígado é um dos órgãos mais importantes do corpo humano. Sua função está relacionada com o metabolismo dos nutrientes, e com a biotransformação de drogas e produtos químicos, protegendo assim o organismo contra substâncias tóxicas. Sendo assim, o fígado fica exposto a uma elevada concentração de substâncias e seus metabólitos o que pode levar a uma lesão hepática (AL-ASMARI et al., 2014)
As enzimas podem ser encontradas em todos os tecidos e são responsáveis pela maioria das reações químicas do corpo. Algumas são identificadas no plasma ou no soro e a mensuração de sua taxa sanguínea pode indicar um estado de normalidade ou de dano celular. Dentre estas, a atividade de duas enzimas em especial são de extrema importância para avaliação da função hepática, a aspartato aminotransferase (AST) e a alanina aminotransferase (ALT). A atividade das aminotransferases tem sido usada como indicadora de danos hepatocelulares desde 1955 (MONTEIRO, 2010).
A enzima AST, que catalisa a transaminação de L-aspartato e alfa- cetoglutarato em oxalacetato e glutamato, pode ser encontrada em altas concentrações no citoplasma e nas mitocôndrias das células hepáticas, ela também é encontrada no músculo esquelético e cardíaco, rins, pâncreas e eritrócitos. Logo, a atividade sérica da AST não é específica para nenhum tecido,
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porém o músculo e o fígado podem ser considerados suas maiores fontes (LIMA, 2009; JORGE, 2006).
A enzima ALT é encontrada no fígado e catalisa a transferência do grupo amino da alanina, permanecendo o ácido pirúvico. A atividade da ALT é significativamente elevada em uma variedade de alterações hepáticas incluindo infecções virais, cirrose, esteatose não alcoólica e toxicidade por drogas (MONTEIRO, 2010).
Todavia, as elevações nas atividades enzimáticas podem ser resultados