Positiv Positiv Positiv, svak
Positiv Positiv Positiv Positiv Positiv
Hemolyse Positiv,
T. maritimum vokste saktere enn de andre bakteriene og hadde en svakere hemolyse.
Figur 4: Vekst på blodskål. Fra venstre: T. finnmarkense (1), T. maritimum (7) og ukjent bakterie (8).
- 27 - Oksydase
Enzymet cytokom c oksydase katalyserer overføringen av elektroner til oksygen i den aerobe respirasjonskjeden. Når enzymet er tilstede vil det redusere N,N-dimethyl-p-fenyldiamin, som fungerer som en kunstig elektronakseptor, til indofenolblå.
Tabell 1.4. Resultat etter oksydase test.
OKSYDASE
1. TF 2. TF 3. TF 4. TF 5. TF 6. TM 7. TM 8.
Ukjent Oksydase Positiv Positiv Positiv Positiv Positiv Positiv Positiv Positiv
Samtlige bakterier produserte enzymet cytokrom c oksydase. Resultatene fra stripsen var vanskeligere å tolke enn resultatet fra filterpapiret. For å unngå tolkningsfeil ble begge testene utført og avlest.
Figur 6 Resultat etter oksydasetest på strips Figur 5 Resultat etter oksydasetest på filterpapir
- 28 - Katalase
Katalase katalyserer frigjøringen av oksygen fra hydrogenperoksid som er et endeproduktene i den aerobe metabolismen. Ved aerob vekst spaltes hydrogenperoksid av katalase med dannelse av vann og oksygen.
Tabell: 1.5. Resultat etter vurdering av katalase produksjon.
KATALASE
1. TF 2. TF 3. TF 4. TF 5. TF 6. TM 7. TM 8.
Ukjent Katalase Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Positiv Positiv
Tenacibaculum finnmarkense produserer ikke enzymet katalase. Tenacibaculum maritimum og ukjent bakterie produserer enzymet katalase som spalter hydrogenperoksid til vann og oksygen ved aerob metabolisme.
Figur 7: Positive katalasetester fra T. finnmarkense (6), T. maritimum (7) og ukjent bakterie (8).
Bakteriene 1-5 var negative.
- 29 - Hugh og Leifson
Mediet er tilsatt en pH- indikator. Ved spalting av sukkerarten, vil pH synke og mediet skifter farge. Parafinolje tilsatt på toppen av mediet benyttes for å undersøke evne til anaerob fermentering.
Resultat:
- Rørene med parafinlokk: ingen vekst.
- Rørene uten parafinlokk: Rør nummer 1 og rør nummer 8 var positive. Rør nummer 2, 3 og 4 er svakt positiv. Rør nummer 5, 6 og 7 var negativ. Negativ kontroll var negativ.
Methyl Red-Voges Proskauer (MRVP)
Metylrødt-testen baserer seg på syrene som produseres ved fermentering av glukose. Voges-Proskauer testen baseres på glukose som metaboliseres til pyruvatsyre og videre til acetion.
Enzymene som katalyserer reaksjonene kan detekteres indirekte ved å påvise sluttproduktet acetion.
Tabell 1.6: Resultatet fra methyl red og voges proskauer METHYL RED- VOGES PROSKAUER
1. TF 2. TF 3. TF 4. TF 5. TF 6. TM 7. TM 8.
Ukjent Methyl red Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ. Negativ Negativ Negativ Voges
Proskauer
Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
I rør nummer 5 var det liten bakterievekst. I rør nummer 6 og 7 var det svært liten bakterievekst.
Negativ kontroll var negativ.
- 30 - Motilitetstest ved hjelp av Tryptic Soya Broth (TSB)
Resultat: Ingen bakterievekst og testen ble avsluttet uten resultat.
Indol
Aminosyren tryptofan spaltes av flere enzymer og det dannes blant annet indol. Indol kan påvises ved å tilsette para-dimethylamino-benzaldehyd (Kovacs reagent) som binder seg til indol og danner et rødfarget produkt.
Tabell 1.7 Resultat etter indoltest.
INDOL
1. TF 2. TF 3. TF 4. TF 5. TF 6. TM 7. TM 8.
Ukjent Indol Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv
I rør nummer 5,6, og 7 var det svært liten bakterievekst. I rør nummer 8 var resultatet for den første testen negativ, mens på den andre testen ble resultatet positivt.
Triple sugar iron (TSI)
Tabell 1.8. Resultat etter TSI test.
TSI
Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv.
Hele mediet er gult.
Negativ kontroll var negativ.
- 31 - Aminosyre decarboxylase test
På grunn av manglende bakterievekst ble testen avsluttet uten resultat.
Kanamycin
Kanamycin er et aminoglykosid som fester seg til 30S subenheten på ribosomene og hemmer proteinsyntese. Antibiotikumet finnes blant annet i preparatet Kanaplex og brukes for å behandle bakterie- og soppinfeksjoner hos fisk (14).
Tabell 1.9. Resultat etter resistenstesting med Kanamycin.
KANAMYCIN
1. TF 2. TF 3. TF 4. TF 5. TF 6. TM 7. TM 8. Ukjent
Kana-mycin
Resistent (svakere)
Resistent Resistent Resistent Resistent Resistent Resistent Resistent
Antibiotikaresistenstesting ved hjelp av agar diffusjonsmetode:
Ved å se på diameteren på vekstsonen kan det avgjøres om bakterien er følsom, intermediær, eller resistent.
Tabell 2.0 Resultat etter agar diffusjonsmetode.
Penicillin Tetracyclin Gentamicin Erythromycin Cefrazidime Ampicillin 1. TF Resistent Resistent Resistens Resistent Resistent Resistent
2. TF Resistent Resistens Resistent Resistent Resistent Resistent 3. TF Resistent Resistens Resistent Resistent Resistent Resistent
- 32 -
4. TF Resistent Resistens Resistent Resistent Resistent Resistent 5. TF Resistent Resistens Resistent Resistent Resistent Resistent 6.
TM
Resistent Resistens Resistent Resistent Resistent Resistent 7.
TM
Resistent Resistent Resistent Resistent Resistent Resistent 8.
Ukje nt
Resistent Svært sensitiv.
Hemningsson
Figur 8: Antibiotikaresistenstesting. Tydelige hemningssoner på ukjent bakterie (8) til venstre. Tenacibaculum maritimum til høyre.
API test
API 20 E strip består av 20 mikrotuber som inneholder dehydrert substrat. Testene ble inokulert med en bakteriell suspensjon som rekonstituerer mediet. Under inkubering vil metabolisering kunne gi et positivt eller negativt resultat i form av et fargeomslag, enten spontant eller avdekket ved tilsetting av reagens. Med de ulike testene vurderes bakteriens evne til enten å produsere det aktive stoffet for en reaksjon eller produsere enzymet som katalyserer reaksjonen. Det ble
- 33 -
først avlest resultat med hensyn på eventuell fargeendring etter tabell, vedlegg 1. For noen stoffer må reagens tilsettes for avlesing, dette gjelder L-tryptofan (TDA), Indol (IND) og natriumpyruvat (VP). Disse tre testene må leses av tilslutt da reagensen kan ødelegge resultatet for de andre testene. Det ble tilsatt 1 dråpe TDA-reagens til TDA-kuppel. Videre 1 dråpe VP 1-reagens og en dråpe VP 2-1-reagens til VP kuppel for reaksjon. VP-reaksjonen vurderes 10 minutter etter tilsetting. Deretter ble 1 dråpe Indol-reagens tilsatt i IND for reaksjon og avlesing.
En dråpe nitrat ble tilsatt D-glukose (GLU) for vurdering om bakterien reduserer nitrat til nitritt.
I tillegg ble zinc pulver tilført for vurdering om bakterien produserer nitrogen(12).
Forklaring til tabell(15):
1. ONPG - test for tilstedeværelse av enzymet beta-galaktosidase ved hydrolyse av substrat o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside (ONPG).
2. ADH - test for tilstedeværelse av enzymet arginine dihydrolase for dekarboksylering av aminosyren arginin.
3. LCD - tilstedeværelsen av enzymet lysin-dekarboksylase for dekarboksyelring av aminosyren lysin
4. OCD - tilstedeværelsen av enzymet ornitin dekarboksylase for dekarboksylering av aminosyren ornitin
5. CIT - testen vurderer bakteriens evne til å utnytte citrat som en kilde til karbon 6. H2S - detekterer bakteriens evne til å produsere hydrogensulfid
7. URE - detekterer tilstedeværelsen av enzymet urease i bakterien 8. TDA - detekterer tilstedeværelsen av enzymet tryptofan deaminase
9. IND - detekterer produksjon av indol fra tryptofan ved tilstedeværelsen av enzymet tryptofanase
- 34 -
10. VP - Voges-Proskauer-test for detektering av acetyl metylkarbinol som produseres ved fermentering av glukose der bakterien utnytter butylen glykol reaksjon
11. GEL - detekterer produksjon av enzymet gelatinase som omdanner gelatin til væskeform.
12. GLU - tester bakteriens evne til å fermentere glukose 13. MAN - tester bakteriens evne til å fermentere mannose 14. INO - tester bakteriens evne til å fermentere inositol 15. SOR - tester bakteriens evne til å fermentere sorbitol 16. RHA - tester bakteriens evne til å fermentere rhamnose 17. SAC - tester bakteriens evne til å fermentere sukrose 18. MEL - tester bakteriens evne til å fermentere melibiose 19. AMY - tester bakteriens evne til å fermentere amygdalin 20. ARA - tester bakteriens evne til å fermentere arabinose
Tabell 2.1. Resultat etter API test.
API - kit 20E
1. TF 2. TF 3. TF 4. TF 5. TF 6. TM 7. TM 8.
Ukjent
ONPG Positiv Positiv Positiv
ADH Negativ Negativ Positiv
LDC Negativ Negativ Negativ
ODC Negativ Negativ Negativ
CIT Negativ Negativ Positiv
H2S Negativ Negativ Negativ
URE Negativ Negativ Negativ
TDA Ikke avlesbar
Positiv Positiv
IND Negativ Negativ Positiv
VP Negativ Negativ Positiv
- 35 - API - kit 20E
GEL Positiv Positiv Positiv
GLU Negativ Negativ Positiv
MAN Negativ Positiv Positiv
INO Negativ Negativ Negativ
SOR Negativ Negativ Negativ
RHA Negativ Negativ Negativ
SAC Partiell negativ
Positiv Positiv
MEL Positiv Negativ Partiell
negativ
AMY Negativ Partiell
negativ
Positiv
ARA Negativ Negativ Negativ
NO2 Negativ Positiv Positiv
N2 Negativ Positiv Positiv
I ukjent prøve nummer 8 var det mer enn 3 positive resultater etter 1 ukes inkubering og testen var dermed klar for avlesing. For Tenacibaculum finnmarkense og Tenacibaculum maritimum var det kun en til to positive resultater per kit, og disse ble derfor inkubert videre på 15°C. Prøve nummer 4 var klar for avlesning etter 2 uker, mens prøve nummer 1 ble avlest etter 3 uker og 5 dager. De resterende prøvene fikk aldri 3 positive resultater på grunn av manglende vekst og de ble dermed ikke avlest.
Figur 9: Resultat API test fra Tenacibaculum finmarkense (4).
- 36 -
Figur 10: Resultat API test fra ukjent bakterie (8).
DNA konsentrasjon
Tabell: 2.2. Resultat etter spektrofotometri av prøvene.
- 37 -
PCR
16S: PCR bekrefter at det er ribosomalt RNA tilhørende bakterier i familien Flavobacteriaceae.
Figur 11: PCR kjørt med primer 16S på alle bakterieprøvene.
Tuf, rpoB og tenaci-CsIA: PCR med spesifikke primere bekrefter tilstedeværelse av Tenacibaculum finnmarkense og Tenacibaculum maritimum.
Figur 12: PCR Tenacibaculum finnmarkense kjørt med primere tuf(t.v) og rpoB(t.h).
Figur 13: PCR Tenacibaculum maritimum kjørt med primer tenaci-CsIA.
- 38 -
VS-rpoA: Ukjent bakterie bekreftes til Vibrio splendidus via PCR og spesifikke primere rettet mot denne bakteriearten.
Figur 14: PCR Vibrio splendidus
Sekvensering
Sekvenseringsresultatene mottatt fra Eurofins genomics ble bekreftet ved hjelp av National Center for Biotechnology Information (NCBI).
16S RNA sekvenser
Nummer 1: Ikke mottatt resultater fra denne.
Nummer 2:
AACGGCGTAGCAAGCTTCACGTGCAGTACCAGTCGTCGATTGTGCTTGCGCTGCT GACGACCGGCGAACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTGTACAGGAGGA TAGCCTTTAGAAATGAAGATTAACACTCCATAATGTAATAGTCTGGCATCACTTT ATTATTAAACATTTATGGGTACAAGATGACTATGCGTCCCATTAGCTAGATGGTG AGGTAACGGCTTACCATGGCAACGATAGGTAGGGGGTCTGAGAGGATTATCCCC CACACTGGTACTGAGACACGGATCAGACTCTTAAAA.
Bekreftet Tenacibaculum finnmarkense strain Tsp.2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. med 98.80% identitet.
- 39 - Nummer 3:
GAGCTCCACGATATCTTTCAGTGCCACTACCAGTCGTCGAGTGGGCTTGCTTGCCT TCGATGGCCTCGGGTGCGTATAGCGTTCTTGTCTGATTTGTGTTTAATTATAAACT TTTGAAATGAAGATTACCACTCCAAGTGGTAATAGACTGGCATCACTTTTTTATTA AACATTTATGGGTACTAGATAACCATGCGTCCCATTAGCGAGATGGTGAGGTAAT GGCTTACCATGGCGACGATAGGTAGGGGGTCTGAGAGGATTATCCCCCACGTTGG TCCTGAGCCAGGATCAAAAAAAACAAAA
Bekreftet Tenacibaculum finnmarkense strain S2F3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Bekreftet med 91.01% identitet (162/178).
Nummer 4:
GACGACGGCGCAGCTTCACGTGCAGTCGAGTCGTCCATTGTGCTTGCGCTGCTGA CGACTGGCGAACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTGTACAGGAGGATA GCCTTTAGAAATGAAGATTACCACTCCATAATGTAATCGTCTGGCATCAATTCTCT ATTAAACATTTATGGGTACAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTGAGG TAACGGCTTACCATGGCGACGATAGGTAGGGGGTCTGAGAGGATTATCCCCCACA CTGGTACTGAGCCAGGATCAAAATCTCAAAA
Bekreftet Tenacibaculum finnmarkense strain Tsp.2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Bekreftet med 95.44% identitet (230/241).
- 40 - Nummer 5:
GACGACGTCGCTGCTTAACGTGCAGTCGTGTCGTCGATTGTGCTGGCGCTGCTGA CGACTGGCGAACGGGTGCGCACGCGTTAGAATCTGCCTTGTCAGGAGGATAGCCT TTAGAATGAAGATTAACACTCCATAATGTAATGATTCGGCATCAAAACACTATTA AACATTTATGGGTACAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTAAGGTAAC GGCTTACCATGGCTACGATAGGTAGGGGGTCTGAGAGGATTATCCCCCACACTGG TACTGAGACAGGACCAGACTCACAAAGG
Bekreftet Tenacibaculum finnmarkense strain Tsp.5 16S ribosomal RNA gene, partial sequence med 95.98% identitet (239/249).
Nummer 6:
GTCGAAACGGCAGCCTTCACATGACAGTTCGAGGGGTACATTGTAGCTTGCTACA GATGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTGCCTTCTACAGAGG GATAGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACCTCATAACACTTTGGAATGGCATCGTT TTAAAGTTAAAGATTTATCGGTAGAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGG TAAGGTAACGGCTTACCATGGCAACGATAGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCC CCCACACTGGTACTGAGCCAGGATCA
Bekreftet Tenacibaculum maritimum strain NLF-15 16S ribosomal RNA gene, partial sequence med 98.76% identitet (238/241).
Nummer 7:
GTCGAAACGGCAGCCTTCACATGACAGTTCGAGGGGTACATTGTAGCTTGCTACA GATGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTGCCTTCTACAGAGG GATAGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACCTCATAACACTTTGGAATGGCATCGTT
- 41 -
TTAAAGTTAAAGATTTATCGGTAGAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGG TAAGGTAACGGCTTACCATGGCAACGATAGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCC CCCACACTGGTACTGAGCCAGGATCA
Bekreftet Tenacibaculum maritimum strain NLF-15 16S ribosomal RNA gene, partial sequence med 98.76% identitet (238/241).
Nummer 8:
GTCCATTCGGCGGCTACCGTGCAGTCGAGCGGTAACGACACTATTAGTCCTTCGG AGGATTTAGTGGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCC TTGATGTGGGGGATAACCATTGTAAACGATGGCTAATACCGCATAATGCCTACGG GCCACAGAGGGGGATCTTCGGACCTCTCGCGTCCCGATATGCCTAGGTGGGATTA GCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAG GATGATCAGCCACACTGGAACTGACACAAGGTCCAAACTAATAC
Bekreftet Vibrio sp. MOLA 527 partial 16S rRNA gene med 95.53% identitet.
Sekvenser av “husholderingsgener” (delvis sekvens) Nummer 6:
GATGGGCTGTGCTCAGTAGCTCCATCTCCATATACAGGAAATACTAGTGTACAAA GAGCTAATATACCTTTAAAGTTGAAGAAAGATATGCAAGTTTATTTAGAAAAAGA TACCGATATACTGGTGCTTTCTTCAATAAACCATCTCAAAAAAGTCGAGATTATA GGAATAAATGGGAGAGTAGCTGCATCTTATGATAGGCTAAATGTATATGATATGA ATATTGATATGTCTAACTATCCAAAAGGAGTGTATATTGTAAGGATATTGGATGA AAAGAACCAGTTAATAACAGAGAAAGTTCTTAAAATATAAGAATTCAAAAAAA
- 42 -
Bekreftet Tenacibaculum maritimum isolate med 95.68% identitet.
Nummer 7:
GATCGGCTGTGCGCGGTAGCTCCTCTCCATATACAGGAAATACTAGTGTACAAAG AGCTAATATACCTTTAAAGTTGAAGAAAGATATGCAAGTTTATTTAGAAAAAGAT ACCGATATACTGGTGCTTTCTTCAATAAACCATCTCAAAAAAGTCGAGATTATAG GAATAAATGGGAGAGTAGCTGCATCTTATGATAGGCTAAATGTATATGATATGAA TATTGATATGTCTAACTATCCAAAAGGAGTGTATATTGTAAGGATATTGGATGAA AAGAACCAGTTAATAACAGAGAAAGTTCTTAAAATATAAGAATTCA
Bekreftet Tenacibaculum maritimum isolate med 95.33% identitet.
Nummer 8:
GACGATGCAGTCTAGGTATGCTCTTCGCCGCATTCTTCTATCTTCTATGCCGGGTT GTGCCGTAACAGAAGTTGAAATTGAAGGTGTGCTACACGAATACAGCACTAAAG AAGGCGTTCAGGAAGATATCCTGGAAATCCTTCTAAACCTTAAAGGTTTAGCTGT ACGCGTTGCTGAAGGCAAAGATGAAGTGTTTATTACACTGAACAAATCAGGCTCA GGCCCTGTTGTTGCAGGTGACATCACCCACGATGGTGATGTAGAGATCGCTAACC CTGAGCACGTAATTTGTCACCTAACGGATGACAATGCTGAGATCGCTATGCGTAT CAAAGTAGAACGTGGTCGTGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTCGTATCCATACTGAA GAAGATGAGCGTCCTATCGGTCGTCTATTAGTTGACGCTACTTACAGCCCGGTTG ATAAAATCGCCTATGCTGTAGAAGCGGCACGTGTAGAACAACGTACTGATTTAGA CAAGCTTGTTATCGATATGGAAACGAGCT
Bekreftet Vibrio splendidus strain BST398 chromosome 1, complete sequence med 99.80%
identitet (511/512).
- 43 -
DEL 2
Ingen av anleggene hadde aktive utbrudd av Tenacibaculum spp. da spørreundersøkelse ble utført i februar-mars 2019. Det ble derfor benyttet tall fra tidligere utbrudd i 2018 og 2019.
Varighet og antall affiserte merder
Utbruddene varte mellom to og fire uker og ett anlegg hadde fremdeles klinisk syk fisk ut over fire uker. Fire av fem anlegg hadde utbrudd i samtlige merder. Et anlegg hadde utbrudd i tre av åtte merder, der de tre merdene som hadde syk fisk var lokalisert ut mot åpent hav og var derfor mer eksponert enn andre merder. De tre merdene med utbrudd var i tillegg mindre enheter på 90-meters ringer, mens de fem uten utbrudd var 130-meters ringer. Utbruddene skjedde i vinterhalvåret og gjennomgående for samtlige merder i undersøkelsen var utsett på fallende vanntemperatur.
Sjøsetting og smoltkvalitet
Fire av fem anlegg opplevde utbrudd 2 - 3 uker etter sjøsetting. Et anlegg skilte seg ut med utbrudd 4 - 5 måneder etter sjøsetting. Dette anlegget hadde sjøsatt 0-åring i oktober og utbruddet begynte i februar/mars. Videre hadde anlegget utsett av smolt på 60 - 80 gram. Dette er noe mindre enn de andre anleggene i undersøkelsen, men stadig innenfor normal smoltstørrelse ved sjøsetting og smoltkvaliteten var vurdert til normal. De resterende fire anleggene vurderte også smoltkvaliteten til å være normal. Størrelsen på smoltet hos disse anleggene var mellom 80 - 180 gram der et anlegg hadde stor variasjon på sitt utsett, henholdsvis mellom 100 - 180 gram ved sjøsetting. Dette anlegget måtte sette ut smolten tidligere enn planlagt grunnet tekniske problemer på settefiskanlegget.
- 44 - Årstid for utbrudd og vanntemperatur
Vanntemperaturen hos anlegg i utbruddsfasen var gjennomgående under 7 °C. Tre av fem anlegg opplevde utbrudd i slutten av desember og i løpet av januar måned, mens de to resterende anleggene hadde problemer i mars 2018. Disse to anleggene er lokalisert i Troms og historisk sett så var det svært kalde vanntemperaturer i Troms i mars og april 2018. Vanntemperaturen er sjelden under 4 °C på disse anleggene, men i mars 2018 opplevde begge anlegg vanntemperaturer på 4 °C og kaldere.
Mekanisk avlusing og rensefisk
Et anlegg benyttet mekanisk avlusning i form av Thermolicer, to ganger før utbrudd. Dette gjaldt for utsettet som hadde utbrudd 4-5 måneder etter sjøsetting. De resterende fire anleggene hadde ikke lus på anlegget siden utbruddene skjedde 2-3 uker etter sjøsetting. Kun et anlegg hadde rensefisk i merdene under utbrudd, herunder 10 % rensefisk og utbruddet skjedde 2-3 uker etter sjøsetting.
Tabell 2.2. Systematisering av relevant informasjon fra anleggene.
Sjøsetting Utbrudd Vanntemperatur Smoltstørrelse Avlusing Anlegg 1 Tidlig i desember
2018
Anlegg 2 Oktober 2017 Februar-mars 2018,
- 45 -
Salinitet og oksygennivå i merdene er valgt bort fra undersøkelsen da få anlegg har konkrete tall på dette. Anleggene opplyste om stabile verdier og ingen spesielle utfordringer med hensyn på oksygen. Hos de to anleggene med konkrete oksygenmålinger var verdiene 8,62 mg/L og 9,11 mg/L under utbrudd. Videre målte tre anlegg salinitet som under utbrudd var 32‰, 32,7‰
og 32,5 ‰. Ingen spesielle utfordringer knyttet til saliniteten.
Håndtering, skadedyr og fôring
Det hadde ikke blitt utført noen annen form for håndtering enn transport fra settefiskanlegg til matfiskanlegg hos samtlige anlegg. Mekanisk avlusing tas ikke med i denne sammenheng. Et anlegg opplevde skarv i anlegget i forbindelse med utbrudd, men det er usikkert om skarven dukket opp før utbrudd eller underveis i utbruddet. Et annet anlegg opplevde mye skarv rundt matfiskanlegget etter klinisk utbrudd. Når antallet svimere og dødfisk økte så kom skarven. Det var ingen spesielle hendelser i driften til noen av anleggene i forkant og under utbrudd, for eksempel ombygging, ekstremvær, teknisk svikt eller lignende. Det var ingen endringer i fôring hos noen av anleggene.
- 46 - Andre sykdommer på anleggene
Et anlegg hadde HSS (hemoraggisk smoltsyndrom) rett i forkant av tenacibaculose utbruddet.
Et annet anlegg opplevde vintersår etter utbrudd med tenacibaculose, og hadde i noen uker en kombinasjon av begge sykdommene. Et tredje anlegg opplevde utbrudd med CMS (Kardiomyopatisyndrom). Dette er en alvorlig hjertelidelse som typisk oppstår 14 - 18 måneder etter utsett i sjø. Det er nærliggende å tro at anlegget derfor ikke hadde problemer med CMS i forkant av tenacibaculose siden snutesårene på laksen oppstod 2-3 uker etter sjøsetting og tas derfor ikke videre med i diskusjon om risikofaktorer. Når det gjelder vaksinering, opplyser 4 av 5 anlegg at de vaksinerer mot vintersår. Det siste anlegget hadde ikke konkret informasjon om fiskens vaksinestatus, da vaksinene gis på settefiskanlegget før utsett.
Diagnostikk og behandling
Samtlige anlegg stilte diagnosen tenacibaculose på bakgrunn av bakteriell undersøkelse etter klinisk mistanke. Bakteriologisk dyrkning og påvisning bekreftet Tenacibaculum spp. hos alle anlegg. Hos et anlegg var det artsbestemt til Tenacibaculum finnmarkense.
Fire av fem anlegg intensiverer plukking av dødfisk og svimere under utbrudd. Videre forsøkes forebyggende behandling ved å unngå håndtering og stress av fisken på fallende vanntemperaturer. Et anlegg har benyttet seg av antibiotikabehandling med florfenikol.
Vaksine mot snutesår
Fire av fem anlegg ville benyttet en vaksine mot tenacibaculose dersom det var tilgjengelig.
Det siste anlegget var ikke interessert i en vaksine, da de hovedsakelig hadde problemer i 14 dager i løpet av sesongen.
- 47 - Vurdering av problem
Et anlegg anser snutesår som et minimalt problem, et annet opplever det som et stort problem, mens to anlegg synes det er et moderat problem. Det siste anlegget har ikke svart på hvor stort problem de anser tenacibaculose for å være.
Diskusjon
Karakterisering av Tenacibaculum spp.
I denne fordypningsoppgaven har det blitt utført et utvalg av biokjemiske tester og molekylære metoder for å karakterisere Tenacibaculum spp. Tenacibaculum er et relativt nyoppdaget bakteriegenus og det gjenstår mye forskning for å karakterisere bakterien fullstendig. Foreløpig er det Tenacibaculum maritimum som er den mest studerte bakterien i slekten. Et generelt problem ved flere av testene i denne studien har vært manglende bakterievekst, og dette har gjort det utfordrende å karakterisere bakteriene. Den manglende veksten kan skyldes at bakteriene ikke tåler enkelte stoffer tilsatt i mediene, at testene som ble benyttet ikke er tilpasset marine bakterier som vokser ved 15 °C, eller at ytre forhold ikke har vært optimale for bakteriens vekst, eksempelvis fuktighet, temperatur, saltinnhold og lignende. Likevel har vi kunnet innhente en del resultater gjennom studiene i laboratoriet og mange av resultatene fra de biokjemiske testene bekrefter funn fra en tidligere studie gjort i 2015 (12), følgelig at Tenacibaculum spp. er Gram-negative stavbakterier som er oksidase positive og indol negative.
Resultatene skiller seg derimot fra samme studie når det gjelder katalasetesten og vekst på blodagar. Våre resultater viste at Tenacibaculum finnmarkense er katalase negativ og vokser på blodagar, mens nevnte studie konkluderte med at bakterien er svakt katalase positiv og ikke vokser på blodagar. Mulige årsaker til at disse testene avviker fra hverandre kan være at testene er ulikt utført og avlest. Studien fra 2015 har et svakt positivt resultat på katalsetesten mens vi har konkludert med at testen er negativ. Det vil alltid være en viss forskjell på hva som vurderes
- 48 -
som positivt og hva som vurderes som negativt ved svake reaksjoner. Til blodagartesten kan det ha blitt brukt ulik type agar som kan ha påvirket resultatet eller det har vært benyttet fullblod fra annen art enn det vi benyttet (fra sau).
Vi har observert en stor forskjell mellom Tenacibaculum finnmarkense og Tenacibaculum maritimum når det gjelder bakterienes morfologi. Tenacibaculum finnmarkense vokser i tydelige sennepsgule kolonier og har en viskøs og slimete konsistens. Tenacibaculum maritimum vokser derimot i pin-point kolonier som er blekere i fargen og har en betydelig mer klebrig konsistens. Sammenlignet med T. finnmarkense var det spesielt vanskelig å plukke T.
maritimum-kolonier til de ulike biokjemiske testene og det kunne virke som om koloniene vokste ned i agaren. Det var ingen store forskjeller mellom T. finnmarkense og T. maritimum på de biokjemiske testene, bortsett fra katalasetesten.
Videre vil vi kommentere resultatene fra antibiotikaresistenstesten, der samtlige Tenacibaculum bakterier var resistente for de syv typene antibiotika det ble testet for. Dette kan tyde på at det tidligere har vært et lite bærekraftig antibiotikaforbruk som har ført til en resistens hos bakterien og som en konsekvens kan ikke disse antibiotikaene benyttes som behandling.
Det er grunn for å tro at bakterien også har resistens mot andre antibiotika enn de syv som det er testet for. Antibiotikaresistens deles inn i naturlig og ervervet resistens. Naturlig resistens innebærer resistens som normalt forekommer hos bakterien eksempelvis dersom bakterien mangler angrepsmålet for antibiotikumet. Dette er egenskaper som overføres vertikalt mellom bakterier. Ervervet resistens er bakterier som tidligere har vært sensitive og som har utviklet en resistens som følge av forandringer i bakteriens genom via horisontal overføring eller gjennom mutasjoner. Antibiotikaresistens oppstår normalt ikke via mutasjoner i DNA-tråden, men ved horisontal overføring av plasmider som innholder gener som koder for resistens (16).
Videre studier bør inkludere en analyse av plasmid-eller genom-assosiert resistens.
- 49 -
I motsetning til Tenacibaculum spp. har den ukjente bakterien vokst godt i samtlige medier og har derfor vært en enklere bakterie å jobbe med på laboratoriet. Ved hjelp av biokjemiske tester ble det konkludert med at den ukjente bakterien er en gram negativ stav som er oksidase- og katalase positiv. Dermed rettet mistanken seg mot en vibrio-bakterie, nærmere bestemt Vibrio splendidus.
De molekylære metodene har vært enklere å utføre enn de biokjemiske metodene. Primerne som ble designet til utførelse av PCR er såkalte housekeeping gener. Dette er stabile gensekvenser som koder for grunnleggende funksjoner og uttrykkes til en hver tid.
På bakgrunn av sekvenseringsresultater fra Eurofins Genomics samt resultater fra PCR fikk vi bekreftet de ulike bakterieartene, bortsett fra bakterie nummer 1 der vi av usikker årsak ikke mottok resultater. Selv om bakteriene ikke er bekreftet med 100% sikkerhet, anser vi sikkerheten som høy nok til at vi kan konkludere med at dette er gjeldene bakterier. Dette viser at arbeidet vårt med molekylære metoder har vært vellykket.
Vurdering av risikofaktorer for utvikling av tenacibaculose
Vurdering av risikofaktorer for utvikling av tenacibaculose