4.3.1. Extrato de proteínas totais para eletroforese bidimensional
Para extração de proteínas visando o preparo de géis bidimensionais, ressuspendeu-se cada alíquota de células tratadas em 250 μL de tampão de reidratação (ureia 7 M, tioureia 2 M, CHAPS 2%, azul de bromofenol 0,002%) adicionando-se PIC 1X (Sigma-Aldrich). Em seguida, submeteu-se às células ressuspensas a cinco ciclos de sonicação (25 W) de 20 pulsos, com intervalos de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250 Branson). Centrifugou-se a suspensão resultante a 2.000 x g a 10 ºC por 15 minutos para remoção de debris celulares. O sobrenadante foi novamente centrifugado, desta vez a 20.000 x g a 10 ºC por 1 hora. Ao término do processo, recuperou-se o sobrenadante.
4.3.2. Extrato de proteínas solúveis para digestão em solução
Para a extração das proteínas solúveis, ressuspendeu-se os fibroblastos em 500 μL de tampão Tris-HCl 25 mM pH 7,5; DTT (ditiotreitol) 1 mM e glicerol 1% acrescido de PIC 1X (Sigma-Aldrich). A seguir, submeteu-se às amostras a quatro ciclos de sonicação (25 W) de 20 pulsos, com intervalos de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250 Branson). Centrifugou-se o material resultante a 46.000 x g a 4 ºC por 2 horas e 20 minutos em centrífuga Sorvall 5C, recuperando-se o sobrenadante. Realizou-se a determinação da concentração proteica destas alíquotas utilizando-se o método do BCA (Thermo Scientif, EUA), segundo recomendações do fabricante.
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Figura 8: Etapas realizadas para a obtenção de extrato proteico de fibroblastos controles e tratados com o
peptídeo PR-11 para o preparo de eletroforeses bidimensionais e digestão em solução de proteínas solúveis. 4.3.3. Eletroforeses uni e bidimensional em géis de poliacrilamida (1D/2D SDS- PAGE)
A qualidade das extrações de proteínas foram analisadas por meio de eletroforeses unidimensionais em condições desnaturantes (1D SDS-PAGE) segundo método descrito por Laemmli (1970), utilizando géis de separação a 12% e de concentração a 5%.
As alíquotas foram diluídas (1:1) em tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%, azul de bromofenol 0,002%) e submetidas a 100oC por 5 minutos para desnaturação das proteínas. Utilizou-se como padrão de peso molecular o Molecular Weight
Marker Kit (Sigma Aldrich) e adotou-se a corrente de 20 mA por gel. Após a corrida em
tampão Tris-HCl 25 mM, glicina 0,19M e SDS 0,1%, o gel foi corado com Coomassie
Brilhant Blue G250 em 40% de etanol e 7% de ácido acético por 2 horas. Realizou-se a
descoloração do background com solução de ácido acético 7% e etanol 10%. Obteve-se as imagens dos géis utilizando-se o scanner ImageScanner III (GE Healthcare).
A quantidade de proteínas a ser aplicada na eletroforese bidimensional foi uniformizada por densitometria comparativa entre caneletas do grupo tratado e seu respectivo controle, através da utilização do software Quantity One versão 4.6.9 (Bio-Rad). A seguir,
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completou-se o volume das amostras com tampão de reidratação para 250 µL contendo DTT 1% e anfólitos pH 3-10 não-linear 0,8%. As amostras foram acondicionadas em sarcófagos de porcelana (Strip Holder 13 cm, GE Healthcare) para incorporação e isoeletrofocalização das proteínas no gel de primeira dimensão (Immobiline DryStrip Gels 13 cm pH 3-10 não-linear, GE Healthcare). Após a focalização isoelétrica, as proteínas presentes nos géis de primeira dimensão foram submetidas à redução com DTT 1% em tampão de equilíbrio (ureia 6 M, Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, Glicerol 30%, SDS 2%, Azul de Bromofenol 1%) e alquiladas com iodoacetamida 4% no mesmo tampão.
A separação de proteínas por massa molecular (2D SDS-PAGE) foi realizada em gel de poliacrilamida 12%. A eletroforese foi conduzida a 20 mA por gel. Para a coloração, utilizou-se solução de Coomassie Brilhant Blue G 250 coloidal, que dispensa a etapa de descoloração por não apresentar background. A análise entre os géis dos grupos controles e tratados foi obtida através da sobreposição de imagens realizada pelo software Ludesi Redfin.
4.3.4. Digestão em solução de proteínas solúveis
Alíquotas das proteínas solúveis extraídas das culturas de fibroblastos controles e tratadas com o peptídeo PR-11 foram submetidas à digestão em solução. Após a dosagem de proteínas pelo método do BCA, completou-se para 45 µL com água mili-Q o volume correspondente a 20 µg de cada amostra. Adicionou-se 5 µL de NH4HCO3 1M e 5 uL de DTT 45 mM, incubando-se a 56ºC por 15 minutos. Logo após, acrescentou-se 5 µL de iodoacetamida 100 mM, mantendo ao abrigo da luz e em temperatura ambiente por mais 15 minutos. Em seguida, adicionou-se 125 µL de água mili-Q e 15 uL de NH4HCO3 1 M. Para a digestão enzimática, utilizou-se 0,8 µg de tripsina (Promega), permanecendo sob incubação a 37ºC por 18 horas. Interrompeu-se a reação pela adição de 10 uL de ácido acético. A solução contendo os peptídeos trípticos foi dessanilizada em mini-coluna Strata C-18-E (55 µm, Phenomenex) e seca em speed vacuum. Manteve-se as amostras à 4 ºC até a análise por espectrometria de massas.
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4.3.4.1. Cromatografia líquida e análise em espectrômetro de massas: digestão em solução
Para cada amostra, 3 µg de peptídeos trípticos foram separados no cromatógrafo
UltiMate 3000 (Thermo Scientific) em coluna C18 (Acclaim PepMap RSLC - 75 µm × 15
cm) sob um fluxo de fase móvel de 0,3 µL/minuto em gradiente não linear (4 a 90% de acetonitrila 80% e ácido fórmico 0,1%) durante 180 minutos. A ionização dos peptídeos ocorreu através da interface ESI-nanospray e esses foram analisados no espectrômetro de massas Q-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Scientific) sob o modo de aquisição Full MS seguido de MS/MS (top 12). Foram determinados os seguintes parâmetros operacionais: resolução Full MS: 70.000; resolução MS/MS: 17.500; scan range: 300 a 2000 m/z; loop count: 10; isolation window: 2.0 m/z; íons exibindo carga +2, +3 ou +4; exclusão dinâmica: 60 segundos; modo positivo de ionização.
Os softwares Xcalibur 3.0.63.3 e MaxQuant 1.5.2.8 (Luber et al., 2010) foram utilizados para aquisição e análise dos dados, respectivamente. Realizou-se a busca de proteínas contra o banco de dados contendo o proteoma de Rattus norvegicus (30091 sequências) depositado no UniProtKB (UniProt Knowledgebas) adotando-se os seguintes parâmetros: perda de dois sítios de clivagem; modificação fixa: carbamidometilação; modificações variáveis: oxidação de metionina e acetilação do N-terminal; tolerância de massas: 4,5 ppm; isotope match tolerance: 2 ppm; minimum peak length: 2; False Discovery
Rate (FDR) and Peptide Sequence Match (PSM): 0.01; minimum ratio count: 2. A abundância
relativa das proteínas foi obtida a partir de dados de LFQ (Label-Free Quantification)
intensity utilizando unique + razor peptides.
4.3.4.2. Análise estatística e categorização das proteínas
A análise estatística foi realizada com o software Graph Pad Prism (versão 6.01). Para cada proteína identificada, a análise da expressão diferencial entre os grupos para cada tempo de exposição ao peptídeo PR-11 foi realizada com t test e nível de significância (p) < 0,01. Foram consideradas como proteínas identificadas aquelas que exibiram um p value, obtido com ao menos duas determinações de LFQ intensity para cada um dos grupos controle e PR- 11 ou em um único grupo para cada tempo de exposição. Proteínas diferencialmente
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expressas foram categorizadas a partir de banco UniProtKB (disponível em www.uniprot.org) de acordo com suas funções biológicas.