BHA Design Modelling

A especificidade foi demonstrada por meio das soluções placebo. Não houve formação de halo de inibição do crescimento bacteriano quando os orifícios dos templates foram preenchidos com soluções placebo. Portanto, o teste não sofre interferência do excipiente e os resultados são decorrentes apenas do antimicrobiano em estudo.

A seletividade, comprovada pelo teste de ANOVA, comparando as inclinações das curvas analíticas obtidas com FLU-SQR e amostra, demonstrou valor de Fcalc e Ftab de 0,051

e 7,71, respectivamente, comprovando que não há interferência do excipiente nas análises.

5.1.8. Cálculo da potência de flucloxacilina sódica em cápsulas

A potência foi calculada em quatro dias consecutivos utilizando a equação de Hewitt, conforme apresentado na seção 5.1.5.2 e está apresentada na Tabela 5.8.

Tabela 5.8. Potência de flucloxacilina sódica em cápsula, pelo método de difusão em ágar Dia Valor encontrado (mg/cápsula)* Potência* (%) Potência média (%) CV (%)**

1 464,55 92,91

94,48

2 474,95 94,99 1,64

3 482,10 96,42

4 468,10 93,62

* média de seis determinações; **CV (%) = coeficiente de variação percentual. 5.1.9. Discussão

No desenvolvimento do método por difusão em ágar para FLU sódica foram realizados testes preliminares, e os resultados encontrados nestes ensaios demonstraram que:

9 M. luteus com as concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0% e os meios de cultura ágar nº

1 para antibióticos e meio nº 11 de Grove-Randall apresentou crescimento bacteriano uniforme na placa, porém, os halos de inibição de crescimento foram pequenos sem

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diferença de tamanho entre eles, mesmo quando houve aumento da concentração do fármaco em solução, utilizando solução tampão fosfato pH 6,0 e pH 8,0.

9 S. epidermidis com as concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0% os meios de cultura

ágar nº 1 para antibióticos e nº 11 de Grove-Randall apresentou crescimento bacteriano homogêneo na placa, mas os halos foram pequenos, quando utilizada solução tampão fosfato pH 6,0 e 8,0.

9 S. aureus com a concentração de 0,5% utilizando o meio de cultura ágar nº 1 para

antibióticos apresentou crescimento bacteriano não homogêneo na placa, e não houve formação de halos de inibição de crescimento. Com inóculo a 1,0%, o crescimento bacteriano na placa foi homogêneo e, houve diferença de tamanho entre os halos de inibição de crescimento quando utilizado solução tampão fosfato pH 6,0, entretanto, não houve diferença no tamanho dos halos quando utilizada solução tampão fosfato pH 8,0. Quando o inóculo foi utilizado a 1,5 e 2,0%, houve crescimento bacteriano muito denso na placa e os halos de inibição de crescimento não foram bem definidos, pois havia colônias nos halos. Ao empregar o meio nº 11 de Grove-Randall, houve crescimento bacteriano uniforme na placa, e, os halos de inibição de crescimento foram pequenos quando empregado solução tampão fosfato pH 6,0 e pH 8,0.

Diante dos resultados, foi padronizado S. aureus em concentração de 1,0% para o inóculo, meio de cultura ágar nº 1 para antibiótico, solução tampão fosfato pH 6,0 para diluição das soluções SQR e amostras. Estes resultados concordam com a Farmacopeia Brasileira 5ª edição (FB 5, 2010) que preconiza S. aureus, meio nº 1 de Grove-Randall como camada de superfície para doseamento microbiológico de outras isoxazolilpenicilinas. A Farmacopeia Brasileira 5ª edição (FB 5, 2010) preconiza meio nº 2 de Grove-Randall para camada base, mas foi utilizado o meio nº 1, pois, os testes preliminares mostraram bons resultados com uso deste meio para ambas as camadas.

Foram determinadas as concentrações 1,5; 3,0 e 6,0 μg/mL, uma vez que demonstraram a melhor resposta frente ao micro-organismo e mantiveram correlação entre a dose e a resposta da substância em análise, como preconizado no ensaio geral para antibióticos pela Farmacopeia Brasileira 5ª edição (FB 5, 2010).

A fim de assegurar a validade do ensaio microbiológico pelo método de difusão em ágar na determinação da potência de FLU sódica, foram utilizadas três concentrações diferentes para a amostra, idênticas às da solução FLU-SQR, em delineamento 3 x 3. Estas doses estão em progressão geométrica (razão 2).

A linearidade do método foi comprovada pelos componentes de paralelismo, coeficiente de correlação e análise de variância dos dados da curva analítica. A análise estatística demonstrou que não há desvio da linearidade e de paralelismo nas curvas

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analíticas originadas da FLU-SQR e amostra. Os coeficientes de correlação são 0,9997 e 0,9999 respectivamente, para a SQR e cápsula, e foram satisfatórios.

A seletividade foi comprovada pela ANOVA para comparar as inclinações das curvas analíticas obtidas com a FLU-SQR e cápsulas. Os valores de Ftab e Fcalc foram 7,71 e 0,051,

respectivamente, demonstrando que o excipiente presente na cápsula não interfere nas análises, corroborando com os resultados dos ensaios de especificidade no qual não houve halo de inibição de crescimento bacteriano quando utilizada a solução de placebo.

O coeficiente de variação percentual dos halos de inibição de crescimento obtidos no doseamento da amostra foi, em média, de 1,63% para repetibilidade e 1,30% para precisão intermediária, menor que o recomendado de 5% (BRASIL, 2003a).

A quantidade de FLU sódica presente nas amostras analisadas, 94,48%, está de acordo com o compêndio oficial que é de 92,5 a 110,0% (BP, 2010c).

A exatidão do método foi comprovada pelo ensaio de recuperação, sendo a recuperação média de 98,96%.

O método mostrou-se robusto quando alteradas as condições de tempo de incubação. Entretanto, ao variar o volume da camada semeada, o método foi robusto quando alterado para menor volume, demonstrando que deve haver muito cuidado ao colocar a camada semeada na placa, pois maior volume do que o estabelecido pode acarretar alterações nos resultados, por haver maior espessura da camada semeada, dificultando a difusão da substância e acarretando em halos menores e, também por haver maior quantidade de micro-organismo inoculado.

Os parâmetros estudados para a validação do método microbiológico por difusão em ágar atenderam às especificações para validação, descritas na Farmacopeia Brasileira 5ª edição (FB 5, 2010), comprovando o uso do método para a adequada quantificação de FLU sódica na forma farmacêutica cápsula.

Publicação obtida com os resultados deste estudo:

FIORENTINO, F.A.M.; SALGADO, H.R.N. Development and validation of a stability- indicative agar diffusion assay to determine the potency of flucloxacillin sodium in capsules.

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