Bevisvurdering

Nos mamíferos adultos, o microambiente da medula óssea é definido pela fina interação entre as células derivadas de progenitores mesenquimais e células derivadas de progenitores hematopoiéticas. A influencia que uma população de células tem sobre a outra tem sido muito estudada, sendo estabelecido que, as stem cells hematopoiéticas (HSCs) requer suporte das células estromais (AGUILA; ROWE, 2005; VISNJIC et al., 2004). Dentro dos componentes estromais, a linhagem osteoblástica tem capacidade de interagir com as HSCs, podendo ser um dos principais tipos celulares responsáveis pela geração e manutenção do nicho hematopoiético (AGUILA; DAVID, 2005).

Durante a ossificação endocondral, os condrócitos hipertróficos secretam VEGF para que a vascularização seja estabelecida, trazendo para o local componentes hematopoiéticos que, inicialmente diferencia em osteoclastos para degradam a cartilagem mineralizada. Este gatilho ativa a osteoblastogenese a partir das células progenitoras mesenquimais, culminando com a produção da matriz óssea e medular (FRANCIS-WEST; TICKLE, 1996;

OLSEN; REGINATO; WANG, 2000). Durante os estágios iniciais do desenvolvimento, coordenadamente, a formação óssea e as células hematopoiéticas interagem ativamente e o rompimento de uma das partes é deletério para a sobrevivência. Um fato interessante é que, o início da ossificação endocondral precede o aparecimento de HSCs no microambiente da medula óssea, sugerindo que, a geração da hematopoiese primária pode estar finamente ligada a osteogênese (DENIS; CHARBORD, 2002).

O avanço no sistema da cultura primária de estroma da medula óssea para obtenção de células mesenquimais tem resultado na geração de culturas ricas em células osteoblast-like (TAICHMAN, 1994; TAICHMAN; REILLY, 1996; NELISSEN et al., 2000) que, expressam da fosfatase alcalina pelas células e da expressão gênica do colágeno tipo I, osteopontina, sialofosfoproteína óssea (BSP) e osteocalcina. Este tipo de cultura tem permitido avaliar as interações entre osteoblasto e os precursores hematopoiéticos, bem como a habilidade para definir o potencial do osteoblasto em modular a hematopoiese. Os trabalhos pioneiros de Taichman e Emerson (TAICHMAN; EMERSON, 1994 e 1996, TAICHMAN; REILLY; EMERSON, 1996; TAICHMAN; HAUSCHIKA, 1992; TAICHMAN et al., 1992; NELISSEN et al., 2000) demonstram que, os osteoblastos produzem uma variedade de citocinas, importantes para a hematopoiese e a proliferação das HSCs. Assim, em cultura, os osteoblastos expressam: fator estimulatório de colônia de granulócitos (G-CSF) (TAICHMAN, EMERSON, 1994), GM-CSF (TAICHMAN; EMERSON, 1996), IL- 1 (TAICHMAN; HAUSCHIKA, 1992), IL-6 (TAICHMAN et al., 1997), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), TGF-β e o fator inibitório de leucócitos (LIF) (Malaval; AUBIN, 2001. Os osteoblastos também expressam integrinas com propriedades de se ligarem a células progenitoras hematopoiéticas (CLOVER; DODDS; GOWEN, 1992; CLOVER et al., 1997). Já in vivo, a influência da osteoblastogenese na hematopoiese tem sido observada em camundongos deficientes para Cbfa1/RUNX2, cuja característica fenotípica principal é ausência de medula óssea, indicando que osteoblastos são necessários para iniciar o desenvolvimento da hematopoiese óssea. Além disso, a análise da hematopoiese embrionária desses animais mutantes mostrou desenvolvimento da hematopoiese extramedular normal no fígado e no baço até aos 17,5 dias, porém e aos 18,5 dias ambos os órgão exibiram excessiva hematopoiese

(DEGUCHI et al., 1999). Por outro lado, animais deficientes para VEGF também apresentaram extrema alteração fenotípica na hematopoiese (CARLEVARO et al., 2000; GERBER, 1999)

Neste contexto, o endotélio microvascular é também uma parte essencial para manutenção da homeostasia e integridade óssea. Em meio de cultura condicionadas com células endoteliais obtidas da veia umbilical de humanos (HUVEC) ocorre um aumento na proliferação células estromais da medula óssea (HBMSC) e quando HBMS e HUVEC estão em co-cultura in

vitro, ocorre a expressão e atividade precoce de marcadores de células

osteoblásticas, como fosfatase alcalina (ALP) (VILLARS et al., 2000). Além disso, ambas HBMS e as células endotelial expressa conexina-43 (Cx43) uma proteína específica de junção gap, permitindo a comunicação entre esses dois tipos celulares (VILLAR et al, 2002). Controversamente, Meury, Verrier e Alini (2006), mostraram que as HUVEC pode inibir a indução da diferenciação das BMSC em osteoblastos por dexametasona in vitro, inibindo a expressão do fator de transcrição de osteoblasto, o Osterix (OSX), fazendo com que, as BMSC se diferenciem até o estágio pré-osteoblástico. Assim, o grau de diferenciação das HBMSC para osteoblastos pode ser controlado pelas células endoteliais, iniciando o recrutamento de células osteoprogenitoras no local da remodelação óssea e mantendo-as em estágio de pré-osteoblastos para evitar a deposição de mineral dentro dos vasos. Desta forma, os pré-osteoblastos têm de migrar para os vasos em direção ao local de remodelação/formação óssea e rapidamente diferenciar em osteoblastos maduros depositando a matriz osteóide e posteriormente a mineralização.

Para o recrutamento de osteoclastos para as áreas de reabsorção, precursores de osteoclastos necessitam aderir e migrar através do endotélio em um fino e regulado mecanismo similar processo de transmigração de leucócitos e monócitos (IMHOF; DUNON, 1997). Atualmente, tem sido proposto que, o endotélio pode direcionar os precursores de osteoclastos para áreas específicas do tecido ósseo, ajudando a controlar o processo reabsortivo (PARTIFF, 2000). Assim, alterações na rede microvasculatura poderia afetar a fina regulação dos eventos que envolvem a reabsorção óssea e levar a diminuição da formação óssea, regeneração e reparo, bem como alterar a

osseointegração de implantes ortopédicos e dentais (GLOWACKI, 1998; BURKHARDT et al., 1987)

Baseado nas evidências encontradas na literatura, este trabalho tem como objetivo correlacionar os eventos celulares e teciduais com a expressão das proteínas VEGF, BMP, RANKL e OPG durante a osteogênese esctópica e ortotópica, induzida pela matriz óssea e dentinária quando implantadas em sítio ectópico e ortotópico. Além de verificar possíveis diferenças quanto o perfil de formação óssea relacionado ao tipo de matriz alogênica implantada.

3 PROPOSIÇÃO

Com objetivo de caracterizar e esclarecer as diferenças na osteogênese induzida pela matriz óssea e dentinária alogênica, propomo-nos a implantá-las em sítio ectópico, entre as fascias musculares, e ortotópico em defeito ósseo craniano de ratos e a partir das análises das radiográfica, morfológica, morfométrica, imunoistoquímica e de extratos protéicos pelo western blotting avaliaremos comparativamente para cada sítio e tipo de implante:

1) a presença de tecido mineralizado na região do enxerto nos implantes ectópicos e o grau de fechamento do defeito ósseo;

2) o grau de reabsorção das matrizes e a reorganização morfoestrutural do tecido ósseo neoformado;

3) os eventos celulares e teciduais envolvidos na formação do novo tecido ósseo;

4) a expressão temporal da proteína BMP-7 e a morfodiferenciação dos tipos celulares e teciduais envolvidos na ossificação.

5) a expressão da proteína VEGF e o padrão de vascularização e ossificação; 6) a expressão das proteínas RANKL e OPG e a reabsorção da matriz alogênica e do tecido ósseo neoformado;

Com os resultados dessas análises verificaremos a participação e a possível interrelação entre as proteínas BMP-7, VEGF, RANKL e OPG no grau de formação e na qualidade do tecido ósseo e medular produzido durante o processo de osteogênese induzida por matriz alogênica óssea e dentinária.