Beskrivelse av modellene

Em todas as determinações seroimunológicas foram analisados soros controlos positivo e negativo, em paralelo com as amostras de soros em estudo.

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2.1.8.1. Imunofluorescência Indirecta

Preparação de antigénio figurado de L. infantum

O antigénio figurado foi preparado a partir de formas promastigotas de L.

infantum em cultura como descrito em 2.1.2. Retiraram-se 50 ml da cultura e

centrifugaram-se a 425 g durante 10 minutos a +4ºC. O sobrenadante foi rejeitado e lavaram-se os promastigotas com soro fisiológico 0.9%. Os parasitas foram contados em hemacitómetro de Neubauer e a suspensão foi ajustada de modo a se obter uma

concentração de 2x106 promastigotas/ml. O antigénio 10 l/círculo foi depositado nas

lâminas com 10 círculos (Bio Mérieux Portuguesa, Portugal), que se colocaram em estufa a +37ºC na presença de um ventilador, para facilitar a evaporação rápida do líquido, mantendo a distribuição uniforme dos promastigotas no círculo. Após secagem o antigénio foi conservado a -80ºC.

Técnica de Imunofluorescência Indirecta

A IFI foi realizada segundo o método descrito por Abranches, 1984. As lâminas com antigénio conservadas a -80ºC foram colocadas à temperatura ambiente, e após secagem fixou-se o antigénio com acetona. Os soros a testar foram diluídos em progressão geométrica em PBS a pH 7.2, aplicados a cada círculo (25 l) e incubados a + 37ºC, em câmara húmida, durante 30 minutos. Após o tempo de incubação, as

lâminas foram retiradas da câmara e,após rejeição do excesso de soro, colocadas em

PBS a pH 7.2, durante 30 minutos. Depois de secar colocou-se 25 l de conjugado (gama-globulinas anti-IgG de cão; Sigma) diluído em solução de azul de Evans (Sigma) (1:100000 de azul de Evans em PBS). Procedeu-se a lavagem e incubação em câmara húmida, durante meia hora, finda a qual se rejeitou o excesso de conjugado e colocou-se em PBS durante 10 minutos. Após montagem com glicerina tamponada (1:10) e lamela, procedeu-se à leitura em microscópio de fluorescência, no comprimento de onda 475.

Consideraram-se positivos os soros com fluorescência em diluições iguais ou superiores a 1/64.

85 2.1.8.2. Contraimunoelectroforese

Preparação de antigénio solúvel de L. infantum

O antigénio solúvel foi preparado a partir de formas promastigotas de L.

infantum em cultura como descrito em 2.1.2.1.

Técnica de Contraimunoelectroforese

A CIE foi realizada segundo o método descrito por Monjour et al. (1978) e Campino (1998). Procedeu-se à electroforese em tampão barbital sódico 0.08 M, pH 8.2 (16 gr barbital sódico (Merck), 1000ml de água destilada, HCL 1N), utilizando tiras de acetato de celulose gelificado (Cellogel, Itália), e uma corrente de 75 V/cm, durante duas horas a +4ºC (equipamento Sebia), O soro a testar (15 l) foi depositado nas tiras no lado do ânodo e 15 l de antigénio (50 mg/ml) no lado do cátodo, distando 1,5 cm entre ambos. Após lavagem com soro fisiológico a 0.9%, as tiras foram coradas numa solução de azul brilhante de Coomassie (Sigma) (5 gr de azul brilhante de Coomassie + 1000 ml de solução descorante, constituída por 500 ml de metanol p.a. (Merck), 400 ml da água destilada e 100 ml de ácido acético glacial p.a.) durante 10 minutos, e posteriormente, colocadas na solução descorante, até ao aparecimento dos arcos de precipitação.

Consideraram-se positivos todos os soros que, revelaram pelo menos, um arco de precipitação (Campino, 1991; 1998).

2.1.8.3. Testes Imunocromatográficos Rápidos Teste rápido com rK39

O antigénio recombinante rK39, consiste numa proteína

predominantemente expressa pela forma amastigota, a quinesina, altamente conservada no complexo L. donovani pelo que a sua utilização como molécula de diagnóstico apresenta uma elevada sensibilidade e tenha valor predictivo no aparecimento da fase sintomática da doença (Badaró et al.,1996; Gomes et al.,2008).

O teste rK39 foi realizado segundo o método descrito pelo representante (Inbios International, USA). Após a adição, no local com as setas indicadoras, de 20 l do soro a testar, colocou-se a tira na posição vertical, no interior de um poço de microplacas fundo em U, com as setas dirigidas para baixo. A leitura do teste fez-se nos 10 minutos subsequentes à adição de 100-150 l do tampão do “kit”.

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Teste protótipo “Lateral-flow test for the diagnosis of dog visceral leishmanio- sis”

O teste foi realizado segundo o método descrito pelo representante (Bordier Affinity Products SA, Suiça). Trinta segundos após a adição de 5 l do soro a testar, na janela da plaqueta colocaram-se duas gotas do tampão de eluição. Uma nova gota foi adicionada quatro minutos mais tarde. A leitura do teste fez-se 10 minutos após. 2.1.8.4. Técnica de ELISA

A técnica de “enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA) foi realizada de acordo com as instruções fornecidas (Bordier Affinity Products SA). Antes de se aplicarem os soros a testar, procedeu-se à lavagem, durante 15 minutos à temperatura ambiente, dos 96 poços de fundo plano da placa previamente sensibilizada com antigénio solúvel de L. infantum. O tampão de lavagem TBS-Tween foi previamente

diluído 1:10. Após remoção do tampão foram adicionados 100 µl das amostras-

padrão (controlo negativo, controlo com fraca positividade e controlo fortemente positivo fornecidos pelo fabricante) e das amostras a testar diluídas 1:200 em TBS- Tween. Todas as amostras foram testadas em duplicado e incubadas durante 30 minutos a +37ºC. Depois de 4 lavagens, foram adicionados 100 l/poço de proteína alcalina A, diluída a 1:50 em TBS-Tween marcada com fosfatase. Após incubação durante 30 minutos a +37ºC, procedeu-se a 4 lavagens e à adição e incubação durante

30 minutos do substrato. A reacção foi então bloqueada com a adição de 100 µl de

solução de bloqueio (K3PO4) e a absorvância lida a 405 nm em espectrofotómetro de

microplacas. Considerou-se como limiar de significância a absorvância do controlo com fraca positividade.

2.1.8.5. Teste de Aglutinação Directa

Ao antigénio liofilizado (5x107 _{parasitas/ml) (KIT Biomedical Research,}

Holanda) adicionou-se 5 ml da solução de diluição: soro fisiológico a 0.9% contendo 0.1M β-mercapto-ethanol (Sigma).

Foram colocados 100 µl/poço da solução de diluição na primeira coluna de

microplacas de 96 poços, fundo em V (DeltaLab, Espanha), e 50 µl/poço nas colunas

seguintes. Após adicção de 1 µl do soro a testar no primeiro poço de cada linha

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12ª coluna foram utilizados como controlo negativo. Em cada poço colocou-se 50 µl

do antigénio reconstituído. Incubou-se à temperatura ambiente durante 18 horas. No final da incubação fez-se a leitura, a olho nú, sobre um fundo branco.

Consideraram-se positivos os soros com reacção de aglutinação na diluição igual ou superior a 1:400.

2.1.9. Estudos da Imunidade Celular