As leveduras foram identificadas em nível de espécie através de características micromorfológicas e bioquímicas (identificação fenotípica), sendo esta identificação confirmada por estudos moleculares (identificação genotípica).
3.2.1- Avaliação da pureza e viabilidade das amostras
As amostras armazenadas a -70° C foram semeadas em meio cromogênico seletivo CHROMagar Candida® (Microbiology Paris), para certificação da pureza do cultivo e viabilidade das colônias. Após 48 h de incubação a 35° C, foram selecionadas as colônias d e mesma cor, sendo em seguidas subcultivadas, com 2 repiques sucessivos após 48 h de incubação a 35° C cada, em ágar Sabouraud dextrose (enzimatic d igest casein 20 g/L, dextrose 40 g/L, ágar bacteriológico15 g/L e cloranfenicol 0,05 g/L- Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA)para posterior identificação.
3.2.2- Perfil fenotípico
A identificação inicial do gênero foi baseada em aspectos micro e macromorfológicos da colônia. A identificação fenotípica em nível de espécie foi baseada em resultados de testes bioquímicos de assimilação e fermentação
N° da coleção de cultura de origem Espécie CBS 2530 T. asahii var. asahii
CBS 2479 T. asahii var. asahii
CBS 7625 T. mucoides CBS 5585 T. inkin CBS 7556 T.ovoides CBS 2481 T. asteroides ATCC 90028 C. albicans ATCC 6258 C. krusei ATCC 22019 C. parapsilosis * Centraalbureau voor Schimmelcultures
de carboidratos e assimilação de compostos nitrogenados. Para a interpretação do perfil bioquímicos das culturas, na busca de identificação de espécie, utilizamos os resultados resumidos na Tabela 3 que foi constituída com dados obtidos pelo trabalho de Rodriguez-Tudela, et al., 2005 e na base de dados do CBS (http://www.cbs.knaw.nl/databases).
3.2.2.1- Avaliação de características morfológicas
Sob o ponto de vista macroscópico, observaram-se colônias com aspecto cerebriforme. Na análise microscópica destas culturas foram pesquisadas a presença de: artroconídios, blastoconídios, formação de apressoria, células gigantes apicais e células em forma de barril. Para tanto, foi realizado microcultivo: com auxílio de alça de platina, a colônia de levedura suspeita de Trichosporon spp. foi semeada em três estrias paralelas em placa de Petri contendo o meio ágar fubá adicionado de Tween 80 (fubá 40 g, Tween 80 - Inlab 10 mL, água destilada q.s.p. 1.000 mL), para estimular a produção de conídios e filamentação. As estrias foram cobertas com lamínula estéril e em seguida as placas foram incubadas a 30° C, durante 48-72 h. Após o período de incubação, as placas foram observadas ao microscópio óptico (Olympus) em aumentos de 100 X e 400 X de magnificação sendo realizada a pesquisa de hifas hialinas artrosporadas, artroconídios, blastoconídeos e apressoria (Hazen, 1995; Sidrim, Rocha, 2004).
M at er ia l e M ét o d o s 23 Espécies
Testes T.asahii T.asteroides T.cutaneum T.inkin T.ovoides T.mucoides T. dermatis T. jirovecci
Prova da urease + + + + + + + + Assimilação de L-Arabnose + v + - - + + + Assimilação de Galactitol - - - - - + v + Assimilação de Inositol - + + + - + + + Assimilação de Melibiose - - + - - + + + Assimilação de Raffinose - - + - v + + + Assimilação de Rhamnose + v + - + + + + Assimilação de Ribose v - + - - + + v Assimilação de Xylitol v v + - v + + v Crescimento a 37°C + v - + v + + - Formação de Apressoria - - - + + - - -
(+) teste positivo; (-) teste negativo; (v) teste variável; N/I não informado.
3.2.2.2- Características bioquímicas da levedura
a) Assimilação de carboidratos e de Nitrogênio (auxanograma)
Para o teste de assimilação de carboidratos, foi utilizado meio C (sulfato de amônio 5 g; fosfato de potássio monobásico 1 g; sulfato de magnésio 0,5 g; ágar bacteriológico 20 g - Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA e água destilada – q.s.p. 1000 mL) destituído de qualquer fonte de Carbono, ao qual foi adicionada suspensão da levedura a ser testada, com turbidez previamente ajustada à escala n° 0,5 de McFarland. Após a solid ificação do meio, alíquotas de diferentes açúcares foram distribuídas de forma eqüidistante sobre o ágar. Para controle positivo do teste utilizou-se dextrose. As placas de Petri foram incubadas a 30° C por 72 horas, por um período de a té 2 semanas. De forma complementar, foram realizadas as provas de assimilação de Nitrogênio e aminoácidos, utilizando-se a mesma metodologia previamente descrita para o teste de assimilação de carboidratos, utilizando-se o meio N (dextrose 20 g; fosfato de potássio monobásico 0,5 g; ágar bacteriológico 16,5 g; água destilada q.s.p. 100 mL) e adicionado de alíquotas de compostos nitrogenados, onde foram realizadas leituras seqüenciais a cada 24 horas por um período de até 1 semana. Para controle positivo do teste utilizou-se peptona (Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA). A positividade para ambos os testes foi avaliada pelo surgimento de halo de turbidez na área correspondente a cada substrato adicionado (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha, 2004).
b) Fermentação de açúcares (zimograma)
Para a realização dos testes de fermentação, foi utilizado um meio basal (extrato de levedura 0,5 g; peptona 0,5 g; 1 g do açúcar; água destilada 100 mL; indicador de pH púrpura de bromocresol, 100 µL a 1,6 % - Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA) isento de qualquer fonte de Carbono dispensado em 6 diferentes tubos de ensaio contendo tubos de Durham submersos e invertidos adicionados de um carboidrato diferente em cada tudo. Foram utilizados seis substratos: dextrose, maltose, sacarose, lactose, galactose e trealose. Em seguida, foram acrescentados 200 µL de solução inóculo de leveduras em concentração ajustada à escala n° 5 de McFarland a tubo contendo 4 mL do meio basal acrescido do açúcar (descrito
anteriormente). Os tubos foram incubados a 30° C po r até três semanas. Foram realizadas leituras seqüenciais a cada 24 horas na 1° semana, e 2 leituras por semana posteriormente. A positividade do teste foi avaliada pela presença de bolhas de gás na parte superior dos tubos de Durham indicando ter ocorrido fermentação de carboidratos (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha, 2004).
c) Prova de hidrólise da uréia
O teste da urease foi realizado utilizando-se o meio de Christensen – Probac do Brasil (peptona 1 g; cloreto de sódio 5 g; fosfato de potássio monobásico 2 g; glicose 5 g ágar bacteriológico 20 g - Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA; água destilada - q.s.p. 100 mL). As amostras foram semeadas no referente meio com o objetivo de se observar produção de urease. A ocorrência de hidrólise da uréia foi observada através da mudança da coloração do ágar, do amarelo para róseo intenso, indicado pelo vermelho de fenol (indicador de pH) devido à alcalinização do meio de cultura. Os tubos foram incubados a 30° C e observados por até 48 hor as (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha, 2004).