O estresse oxidativo foi analisado perante análise de algumas enzimas e proteínas no tecido cardíaco. Para essas dosagens, foram utilizados fragmentos homogeneizados do coração de cada animal.
3.6.1. Determinação de proteínas totais
A dosagem de proteínas totais foi realizada através do homogeneizado das amostras do tecido cardíaco pelo Método de Bradford (Bradford, 1976). O reagente de Bradford contém como principal componente o corante Coomassie brilhante azul, que em solução ácida se liga às proteínas da amostra, alterando sua absorbância de 465 nm para 595 nm, medida através do leitor de ELISA (Bio-Rad mod. 550, Hercules, EUA). Esta concentração foi representada em mg/mL.
3.6.2. Atividade da Superóxido dismutase- SOD
A superóxido dismutase é uma enzima antioxidante que catalisa a dismutação do superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Sua atividade foi medida no tecido cardíaco de acordo com o método de Marklund e colaboradores (Marklund, S & Marklund, G, 1974) que se baseia na capacidade da enzima SOD em inibir a auto- oxidação do pirogalol. Os reagentes de trabalho utilizados foram: fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4), Pirogalol, MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2H]-2,5-difenilterazolio) e DMSO (dimetilsulfóxido). Para a realização da dosagem, fragmentos de 0,5 mg do tecido foram homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato (50mM), pH 7,0, em seguida, centrifugados por 10 minutos a 12.000 RPM a 4 °C. O sobrenadante foi coletado e utilizado como amostra biológica. A confecção das dosagens nas amostras utilizando placas de Elisa de 96 poços de baixa sensibilidade, seguiu a sequência de adições de reagentes, conforme o quadro abaixo:
Poço Amostra Tampão MTT Pirogalol
Branco _ 144 µl 6 µl _
Padrão _ 127 µl 6 µl 15 µl
Amostra 30µl 99 µl 6 µl 15 µl
As amostras foram então incubadas por 5 minutos em estufa a 37 °C. Logo após, 150 µL de DMSO foram adicionados às mesmas para parar a reação. As absorbâncias foram lidas no leitor de ELISA em um comprimento de onda de 570 nm. Para o cálculo da atividade de SOD, foi subtraído o resultado obtido da amostra pelo valor encontrado do branco e, a seguir, foi dividido esse valor pelo encontrado da subtração do padrão pelo branco. Esta concentração foi representada em U/mg de proteína.
3.6.3. Atividade da Catalase
A atividade da CAT foi mensurada a partir da taxa de decréscimo de peróxido de hidrogênio a uma absorbância de 240nm, representada por U/mg de proteína (Aebi, 1984), que consiste na decomposição do H2O2 pela enzima observada durante 1 minuto por espectrofotometria a 240 nm. Para a preparação da amostra biológica, 100 mg do tecido cardíaco foram homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) e em seguida, foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 RPM a 4 °C. O sobrenadante foi coletado e utilizado como amostra biológica. Em um tubo de polipropileno, foi adicionado 50 µL de tampão fosfato 0,1 mM (pH 7,2) e 40 µL de água destilada, o qual foi mantido em banho-maria a 30 ºC por 1 minuto. Em seguida, foram adicionados 10 µL da amostra e 900 µL de H2O2 (10 mM). As absorbâncias foram lidas, exatamente a cada minuto, durante 3 minutos. A água destilada é utilizada como branco. A atividade
da CAT foi calculada segundo a lei de Lambert Beer. A absorbância utilizada nessa expressão é o delta obtido da primeira e da última absorbância lida (absorbância final - absorbância inicial). O coeficiente de extinção molar utilizado foi o do H2O2 (39,4 M-1 cm-1 ). Esta concentração foi representada em U/mg de proteína. Uma unidade de catalase é equivalente a hidrólise de 1 µmol de H2O2 por minuto.
3.6.4. Proteínas Carboniladas
A oxidação de proteínas por EROs leva à formação de derivados carbonílicos, que podem ser mensurados por métodos sensíveis, particularmente aqueles que utilizam o 2,4- dinitrofenilhidrazina (DNPH), gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada espectrofotometricamente. Para determinar da concentração de proteína carbonilada utilizamos o método descrito por (Levine et al., 1994). Para a reação foi utilizado um homogeneizado de tecido cardíaco dos camundongos pertencentes à linhagem C57BL/6, em solução de KPE na concentração de 100mg/ml, onde 0,5ml dessa solução foram precipitadas com 0,5ml de TCA a 1% e centrifugado a 5000 RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi então descartado e foi adicionado ao pellet 0,5ml de DNPH em HCL para que esse sistema permanecesse em incubação por 1 hora com passagens no vórtex a cada 15 minutos. Em seguida foram adicionados 0,5ml de TCA a 1% e levado para nova centrifugação. Ao pellet foi acrescentado 1 ml de solução 1:1 de etanol/acetato de etila e levado novamente para centrífuga. A seguir 1 ml de solução de SDS a 6% foi adicionado ao tubo e centrifugado. Desta vez foi descartado o pellet e o sobrenadante foi levado para leitura em espectrofotômetro em cubeta de quartzo.
3.6.5. Substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico- TBARS
As concentrações de TBARS, assim como de proteína carbonilada funcionam como marcadores indiretos de danos oxidativos a lipídeos e proteínas, respectivamente.
A determinação da concentração de TBARS foi baseada na capacidade do ácido tiobarbitúrico em se ligar a lipídeos oxidados, formando malondialdeído. Essa dosagem foi realizada conforme descrito por Buege & Aust (1978). Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato, ph 7,4 e em seguida, centrifugado por 10 minutos a 10.000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica. Em um tubo foram adicionados 500 μL de homogeneizado, 230 μL de ácido tricloroacético (TCA) 28% p/v dissolvido em ácido clorídrico (HCL) 0,23N, 230μL de TBA 1% dissolvido em ácido acético 1:1 e 123 μL de BHT 5 Mm dissolvidos em etanol. Em seguida, o tubo foi levado ao vórtex e colocado em banho-maria a 95°C por 15 minutos. Após serem resfriados em banho de gelo, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10000 g e o sobrenadante retirado foi lido no espectrofotômetro a 535 nm, zerado com água destilada. A concentração de TBARS foi determinada utilizando o coeficiente de extinção molar ( = 1,56x 105 L x mol-1 x cm-1), seguindo a lei de Lambert Beer. Essa concentração foi representada em nmols/mL