III.5.1 Biologia da topoisomerase
A topoisomerase é uma enzima ubiquitária, presente em todas as células, que permite a clivagem e o desenrolar das cadeias de ADN, necessárias à sua replicação, recombinação e transcrição do mesmo (Sandri et al., 1996; Burden & Osheroff, 1998). É um dos biomarcadores utilizados em oncologia, especialmente na escolha do tratamento a utilizar em tumores de mama. Um biomarcador pode ser definido como um indicador de um processo biológico, doença ou medida de resposta a um tratamento (Ramos‐Vara & Borst, 2017). A sua ação faz, portanto, a clivagem temporária nas cadeias de ADN (Burden & Osheroff, 1998; Wang, 2002; Damiani et al., 2016), após a qual promovem a passagem da cadeia complementar pelo espaço criado, permitindo o desenrolar da cadeia. Posteriormente, a topoisomerase que formava o complexo de clivagem com o ADN clivado, religa as extremidades livres, libertando-se (Ferreira, 2008) (Figura 5).
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Figura 5 – Mecanismo de ação das TOPII (adaptado de Nitiss, 2009).
Legenda: A Topoisomerase II interage com as duas cadeias de ADN. A enzima faz uma quebra numa cadeia, designada por segmento G, e permite a passagem de uma segunda cadeia (segmento T), pelo espaço criado.
São conhecidas cinco topoisomerases nas células humanas, divididas em 3 grupos: grupo IA, das topoisomerases IIIα e IIIβ; grupo IB, com a topoisomerase I (nuclear e mitocondrial) e grupo IIA, com as topoisomerases IIα e IIβ. As mais estudadas são sem dúvida as topoisomerases I e IIα, pelo que serão as mais detalhadas nesta revisão (Wang, 2002).
A topoisomerase tipo I (TOPI), cliva apenas uma das cadeias de ADN, enquanto que a topoisomerase tipo II (TOPII) cliva as duas cadeias (Wang, 2002). As TOPII são também essenciais para a condensação e descondensação dos cromossomas e o seu arranjo durante a segregação cromossómica (Romero et al., 2012; Damiani et al., 2016).
III.5.2. Tipos de TOPII
Existem duas isoformas descritas de TOPII: α (170 kDa) e β (180 kDa), que diferem na sua localização celular, propriedades bioquímicas e suscetibilidade aos fármacos (Jarvinen, Kononen, Pelto-Huikko & Isola, 1996; Sandri et al., 1996; Jarvinen et al., 1998). Estas duas isoformas de TOPII são codificadas por genes diferentes localizados nos cromossomas 17q e 3p, respetivamente (Jarvinen et al., 1996; Romero et al., 2012).
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A expressão da proteína topoisomerase IIα (TOPIIA) (produzida pelo gene TOPIIA) é muito elevada em células com crescimento exponencial (isto é, está dependente do estado de proliferação celular) e em menor grau em células quiescentes, podendo ser por isso considerada um marcador de proliferação celular como o Ki-67 (Figura 6). A expressão da TOPIIA aumenta no fim da fase S e durante a fase G2 e fase M, e diminui após a mitose. A topoisomerase IIβ (TOPIIB) por outro lado, encontra-se largamente expressa, tanto em células que se encontram em divisão como em células quiescentes (Boege, Andersen, Jensen, Zeidler & Kreipe, 1995; Sandri et al., 1996; Hajduk, 2009a; Hong, Sang, Shang, Xue & Liu, 2012; Romero et al., 2012).
Enquanto que o papel da TOPIIA é reconhecido no metabolismo do ADN, em funções como replicação e divisão de cromossomas na divisão celular, o papel da TOPIIB é pouco conhecido e pensa-se que pode não ter um papel importante na proliferação celular, mas estar principalmente envolvida na transcrição de genes (Jarvinen et al., 1998; Romero et al., 2012).
Figura 6 - Modelo da TOPIIA humana (adaptado de McCledon & Osheroff, 2007).
III.5.3. Importância clínica da TOPIIA
A TOPIIA é considerada o alvo terapêutico de vários fármacos utilizados em quimioterapia, tanto em humanos como nos animais, dada a sua função de clivagem e rearranjo das cadeias de ADN (Boege et al., 1995; Sandri et al., 1996; Jarvinen et al., 1998; Di Leo et al., 2001; Arriola et al., 2007; Hajduk, Olszewski & Smietana, 2009b; Romero et al., 2012). O gene que codifica esta enzima, funciona como alvo para variados fármacos quimioterapêuticos e várias mutações neste gene têm sido associadas ao aparecimento de resistência a fármacos (NCBI - National Center for Biotechnology Information).
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Contudo a importância clínica da TOPIIA ainda não está bem definida. Embora seja reconhecido como benéfico o uso de antraciclinas em tumores mamários com amplificação de TOPIIA (maior sensibilidade a antraciclinas) (Di Leo et al., 2001; Arriola et al., 2007; Schindlbeck et al., 2010; Heestand et al., 2017), alguns estudos afirmam que a TOPIIA não tem valor preditivo na resposta ao tratamento com antraciclinas, limitando a sua utilização como fator de prognóstico (Jarvinen et al., 1998).
Vários autores associam a localização dos genes HER-2 e TOPIIA no mesmo cromossoma 17 (região q12-q21) (na mulher) à sua co-amplificação (Jarvinen, Tanner, Barlund, Borg & Isola, 1999; Jarvinen et al., 2000; Arriola et al., 2007). Não é claro como o HER-2 poderia influenciar a sensibilidade às antraciclinas, sendo que não é o alvo destes fármacos. Contudo, essa suposta sensibilidade seria devido à proximidade do gene TOPIIA no cromossoma 17 (na mulher) (Oakman, Moretti, Galardi, Santarpia & Di Leo, 2009). Foi demonstrado que tumores com amplificação do gene HER-2 têm igualmente amplificação do gene TOPIIA sugerindo a sobreexpressão de TOPIIA como marcador de sensibilidade às antraciclinas em conjunto com o HER-2 (Jarvinen et al., 1996), ou seja, o valor preditivo do HER-2 na resposta ao tratamento com antraciclinas, dever-se-ia sobretudo à amplificação do gene da TOPIIA, o que acontece em cerca de 40% dos casos (Jarvinen et al., 1999; Fountzilas et al., 2012). Mais ainda, que células tumorais com amplificação dos genes HER-2 e TOPIIA são sensíveis às antraciclinas, enquanto que a amplificação de HER-2 e deleção de TOPIIA mostra resistência às antraciclinas (Jarvinen et al., 2000).
No geral, os tumores mamários com sobreexpressão de TOPIIA têm sido correlacionados com elevada proliferação celular, pobre diferenciação histológica, pior prognóstico, maior agressividade, além de ausência de recetores hormonais (Jarvinen et al., 1996; Sandri et al., 1996; Fritz et al., 2005; Biesaga, Niemiec, Ziobro, Wysocka & Kruczak, 2011; Romero et al., 2011). Foi também demonstrado que a expressão da TOPIIA varia muito consoante o subtipo molecular do tumor mamário, estando mais sobreexpressa em tumores mais proliferativos como o tipo basal, luminal B e HER-2 positivo (Romero et al., 2011).
Daí a hipótese de testar a TOPIIA como forma de prever a resposta do paciente ao tratamento de quimioterapia com antraciclinas, pois a baixa expressão da TOPIIA pode determinar resistência à terapêutica. Caso seja provado não existir associação entre a expressão de TOPIIA e resposta à terapêutica com antraciclinas, isto pode levar ao desinteresse pelo estudo desta proteína como marcador em oncologia.
Embora na mulher o gene TOPIIA esteja localizado no cromossoma 17, assim como como o HER-2 (Figura 7), o mesmo não acontece na cadela. Nesta espécie o gene HER-2 encontra-se no cromossoma 1 (Escobar, Becker, Bullerdiek & Nolte, 2001; Ferreira, Bertagnolli, Gobbi &
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Cassali, 2014) enquanto que o gene TOPIIA está presente no cromossoma 9 (NCBI Gene). Por isso, não se sabe se a amplificação da TOPIIA está relacionada com a amplificação do HER-2, ou se a sua expressão está relacionada com outro mecanismo biológico ou alteração genómica (Romero et al., 2012).
Figura 7 - Cromossoma 17 (Humano): Região 17q12 a 17q21, onde se encontram respetivamente os genes do HER-2 e TOPIIA (adaptado de Romero et al, 2012).
III.5.4. Determinação da TOPIIA
A expressão da TOPIIA pode ser determinada a nível de ARN ou a nível proteico por diversas técnicas. Tanto a avaliação da expressão do gene por microarrays e PCR são métodos fiáveis. A IHQ (método utilizado neste estudo) avalia a expressão da proteína, e é considerada uma técnica mais subjetiva, além de que ainda não foram estabelecidos parâmetros de classificação que permitam concluir se o paciente beneficiará ou não com o tratamento de antraciclinas. Outras técnicas a ter em consideração são as de hibridização in situ fluorescente (FISH - fluorescent in situ hibridization) e cromogénica (CISH - chromogenic in situ hibridization) que permitem a avalição do número de genes presentes.
A determinação da topoisomerase em tecidos tumorais pode ser feita em material incluído em parafina, tanto por IHQ como FISH, o que permite uma análise retrospetiva dos tumores (Hajduk, 2009a).
III.6. Imunohistoquímica