4.1 - MORFOLOGIA COLONIAL
Após 48 horas de incubação, havendo crescimento nas placas inoculadas com as amostras, as colônias com características pertencentes ao Streptococcus grupo mutans, foram observadas sob luz refletida com o auxilio de um microscópio esteroscópico (Zeiss), seguindo os padrões descritos para o meio SB20 segundo DAVEY e ROGERS (1984), os quais caracterizam as colônias como firmes e opacas, de coloração branco- acinzentada ou creme-amarelada, com superfície granular semelhante ao vidro moído e circundadas por um halo branco leitoso. Apresentam com freqüência uma gotícula cintilante de polissacarídeo no topo e quando tocadas com a agulha de platina não se desintegram, apenas deslocam-se facilmente (Figura 3).
A seguir foram contadas utilizando um contador eletrônico digital (Phoenix) (Figura 4). Posteriormente, cerca de seis colônias com morfologia típica, crescidas em diferentes pontos da superfície do meio, foram coletadas e transferidas individualmente para tubos contendo 5 mL de caldo de BHI esterilizado. Estes foram incubados em jarras de anaerobiose em 37o C por 24 horas para posterior identificação bioquímica das espécies.
Figura 3: Colônias de Streptococcus grupo mutans. A- Microscópio óptico aumento de 10x. B- Microscópio óptico aumento de 40x. C- Microscópio óptico aumento de 70x, visualização da gota de polissacarídeo no topo da colônia.
Figura 4: A- Contador eletrônico digital (Phoenix). B- Colônias de S. mutans em meio de cultura para realização da contagem.
A
B A
Antes da realização das provas bioquímicas, as espécies isoladas foram subcultivadas em BHI a 37o C por 24 horas e posteriormente em SB- 20, para avaliação da pureza da amostra.
4.2 - Provas Bioquímicas
As provas bioquímicas foram realizadas para identificação das cepas de Streptococcus grupo mutans, seguindo-se os critérios adotados no Manual de Bergey’s (HARDIE, 1986), utilizando-se as provas de fermentação de manitol, sorbitol, melibiose e rafinose, hidrólise de arginina, produção de peróxido de hidrogênio e sensibilidade a bacitracina. As inoculações foram realizadas a partir de culturas recentes (24 horas) em BHI. Para identificação das espécies de Streptococcus grupo mutans a tabela das características bioquímicas determinada por HARDIE em 1986 foi observada (ANEXO 1 - Tabela 1).
4.2.1 - FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS
Para a realização desta prova bioquímica foi utilizado um meio base constituído por caldo de tioglicolato sem dextrose ou outro açúcar (24g/L), adicionando ágar (15g/L) e púrpura de bromocresol diluído em álcool (0,016g/L). Após dissolução dos componentes em água destilada, o pH foi acertado para 7,0. A esterilização do meio foi realizada a seguir a 121o C por
15 minutos, e resfriado até 40o C acrescentando solução do açúcar específico para cada teste (manitol, sorbitol, melibiose e rafinose) numa concentração final de 1%.
Com o auxilio de um Replicador de Steer (Craft Machine, Chester, P.A, USA) (Figura 5), alíquotas de 50µL das culturas recentes (24 horas), crescidas em BHI, foram inoculadas no meio sólido contendo os diferentes carboidratos. Este replicador torna possível a identificação de 25 amostras em cada uma das placas contendo o meio, as quais foram incubadas em jarra de anaerobiose, por um período de 48 horas a 37o C. As leituras foram realizadas após 24 e 48 horas.
O teste foi considerado positivo quando ocorreu a viragem do indicador de pH da cor púrpura para amarela, caracterizando a fermentação do açúcar com produção de ácidos (SHKLAIR e KEENE, 1974) (Figura 6).
4.2.2 - PRODUÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO
Esta prova bioquímica foi realizada segundo Whittenbury (1964), utilizando um meio base composto de 0,5 g de extrato de carne (DIFCO); 0,5 g de extrato de levedura (DIFCO); 0,05 mL de Tween 80 (Synth); 0,01 g de sulfato de manganês (DIFCO); 1,5g de ágar e água destilada q.s.q. 90 mL, o qual foi ajustado em pH 7,2, autoclavado a 121o C por 15 minutos e resfriado a uma temperatura próxima de 45o C. Posteriormente foi adicionado 5,0 mL de uma mistura de sangue desfibrinado de carneiro e água destilada
esterilizada, em partes iguais, acrescentando uma solução de 0,1 g de orto- dianisidina (SIGMA) a 2% em 5,0 mL de água destilada esterilizada. O meio total foi aquecido em banho-maria fervente por 15 minutos e distribuído em placas de Petri esterilizadas.
A semeadura foi realizada a partir das culturas recentes das cepas em BHI, consistindo de três inoculações próximas (tipo “picada”), realizadas com agulha de platina diretamente no meio de cultura. As placas foram incubadas em jarra de anaerobiose, por um período de 48 horas a 37oC.
A produção de peróxido de hidrogênio foi detectada pelo aparecimento de um halo marrom-escuro ou preto em torno das inoculações. Este teste, quando positivo, indica que as cepas presentes são S. sobrinus (Figura 7).
4.2.3 - RESISTÊNCIA A BACITRACINA
Ao meio base utilizado no teste de fermentação de manitol, após resfriamento até cerca de 45o C, foi adicionado bacitracina (0,0037%) esterilizada. As amostras foram semeadas utilizando o Replicador de Steer (Craft Machine, Chester, P.A, USA), como descrito anteriormente, e incubadas em jarra de anaerobiose por 48 horas a 37o C. O crescimento do microrganismo indica sua resistência ao antibiótico presente no meio, observada com a mudança do pH da cor púrpura para amarela, indicando a fermentação do manitol (SHKLAIR e KEENE, 1974) (Figura 6).
4.2.4 - HIDRÓLISE DE ARGININA
Esta prova bioquímica foi preconizada por Niven Junior et al. (1942), sendo fundamentada na produção ou não da enzima arginina-desaminase pelo microrganismo, a qual libera amônia ao agir sobre o substrato arginina.
O meio de cultura utilizado para crescimento das amostras foi composto por 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de triptona, 0,2% de fosfato dipotássio, 0,05% de glicose, 0,3% de D-arginina HCl, para cada 100 mL de água destilada. Posteriormente ao crescimento de cultura jovem (24 horas), 25µL de cada cepa semeada foi inoculada em tubos contendo o meio de cultura, os quais foram incubados a 37o C por 48 horas. Após este período, foram adicionadas duas gotas do reativo de Nessler a cada tubo (ANEXO 4). A presença de amônia na cultura, evidenciada pelo aparecimento de coloração alaranjada, indica reação positiva enquanto que a coloração amarela indica prova negativa. Este teste, quando positivo, indica que as cepas presentes são S. rattus (Figura 8).
Figura 6: Prova de fermentação de carboidratos e resistência a bacitracina. A mudança da cor púrpura para amarela indica que o teste é positivo.
A B
B
A
FIGURA 5: A- Replicador de Steer. B- Esquema ilustrativo para semear as amostras no meio de cultura utilizando o Replicador.
Figura 7: Prova do peróxido de hidrogênio. A presença do halo escuro indica que o teste é positivo.
Figura 8: Prova da hidrólise da arginina. Com a adição do Reativo de Nessler ocorre a mudança para cor alaranjada.