B ASILEA III

Os estudos com o vírus Juruaçá tiveram início em 1982, quando o mesmo foi isolado em camundongos albinos suíços recém- nascidos. Nessa época, foram realizados teste sorológicos para a caracterização viral; no entanto, esses ensaios não foram suficientes para indicar uma classificação completa do vírus analisado. Araújo, em 2006, realizou novas metodologias, como microscopia eletrônica, imunomarcação, técnicas moleculares e o uso de culturas primárias de células do SNC para desenvolver um estudo experimental mais amplo a cerca do vírus Juruaçá.

A partir desses experimentos, pode-se indicar as características morfológicas; o tropismo por células do SNC, principalmente micróglias; e a classificação taxonômica provisória desse vírus na família Picornaviridae no gênero Enterovirus. Além disso, os resultados do trabalho de Araújo (2006) sugeriram que as lesões causadas nos animais infectados com o vírus Juruaçá ocorriam não somente pela ação do agente viral, mas principalmente pelo desenvolvimento de uma intensa resposta imune. Essa hipótese foi o que nos levou a desenvolver esta dissertação no intuito de verificar se a mesma teria fundamento, e se o vírus em estudo levaria os animais ao óbito pela exacerbação da resposta imune no SNC.

Para isso, foi realizada análise histológica com a finalidade de verificar se haveria diferença nas alterações anátomo-patológicas caso os animais fossem inoculados por via i.n. e a linhagem de camundongos suíços fosse substituída pela linhagem BALB/c. Foram também realizados testes histoquímicos e de imunofluorescência em culturas primárias de células do SNC e imunohistoquímico em secções de encéfalo com o intuito de confirmar a presença de antígenos virais e analisar aspectos morfológicos das micróglias que indiquem diferentes estágios de ativação celular. Além disso, foi analisada a produção de citocinas, NO e ROS para traçar um perfil da resposta imune ao vírus Juruaçá.

6.1 PATOGÊNESE

Dentre os patógenos que podem provocar encefalites, os vírus são os agentes patogênicos que mais causam doenças infecciosas no SNC, apresentando uma incidência global de 6,34 por 100 000 pessoas de todas as idades (FURR; MARRIOTT 2012; JMOR et al., 2008). Ano após ano, vem sendo demonstrado a importância do estudo das encefalites causadas por vírus, tanto pela diversidade de espécies que acometem o SNC, como também

pela variedade de lesões e pelas altas taxas morbi- mortalidade em humanos e em animais doméstico, de importância comercial e ecológica.

A co-evolução dos agentes virais com o sistema nervoso de mamíferos demonstra um duelo constante pela sobrevivência (CHAKRABORTY et al., 2010). A maioria das infecções virais no SNC é transitória, mas algumas podem resultar em incapac idade ou morte. Diversos vírus de RNA e DNA entram no SNC por meio do transporte axonal do sistema nervoso periférico (SNP) (ABDELMAGID, 2012; DENIZOT et al, 2012) e podem induzir injúria no tecido nervoso por replicação direta e lise das células do hospedeiro, por ativação do sistema imune inato e adaptativo resultando em apoptose ou por indução de autofagia (ABDELMAGID, 2012; AMOR et al, 2010; BERTH, et al., 2009; DELEIDI; ISACSON 2012). Em outros casos, os vírus podem entrar no SNC por via hematogênica, devido às alterações nas células endoteliais dos vasos sanguíneos que permitem a passagem do vírus através da barreira hematoencefálica diretamente ou pelo interior das células infectadas que atravessam o endotélio (BERTH, et al., 2009; JOHNSON; CUNNINGHAM 2011; DELEIDI; ISACSON 2012; VERMA et al, 2009).

Citamos na sequência alguns exemplos de patógenos virais importantes por sua virulência ou pelas sequelas determinadas pela intensa resposta imune contra os mesmos estabelecida no SNC. Jurgens e colaboradores (2012) afirmaram que a maioria das pessoas consegue se recuperar completamente da infecção causada pelo vírus influenza, porém, existem casos em que esse vírus pode provocar danos significativos a curto e longo prazo no SNC, devido à neuroinflamação ind uzida por infecção viral periférica.

O vírus Nipah, um paramyxovirus identificado em 1999, está associado à morte por encefalite aguda em 40% a 75% dos casos registrados. Dos indivíduos que conseguem sobreviver à infecção por esse vírus, cerca de 20% apresentaram sequelas neurológicas e um pequeno número desenvolve encefalite de início tardio (FURR; MARRIOTT 2012; TYLER, 2009).

A encefalite japonesa (VEJ) é uma das arboviroses mais temidas que ocorre em humanos. Entre os flavivirus clinicamente importantes, o VEJ tem a maior taxa de mortalidade que varia de 30% a 50% e permanece como um importante problema de saúde pública em várias regiões da Ásia (FURR; MARRIOTT 2012; GUPTA; RAO 2011; SOLOMON, et al., 2003). Além de causar uma doença aguda com altas taxa s de mortalidade, o VEJ pode deixa alguns sobreviventes com sequelas, como paralisia de membros inferiores e deficiência mental (GUPTA; RAO 2011).

Na família Picornaviridae existem quatro gêneros que contem vírus neurotrópicos. O poliovirus, coxsackievirus, echovirus e outros membros do gênero Enterovirus se replicam no trato digestivo e são resistentes a pH ácido. O gênero Cardiovirus inclui o vírus da encefalomiocardite (VEMC) que causa paralisia flácida em camundongos e o VEMT, o qual possui diferentes cepas que provocam tanto uma doença semelhante à poliomielite em camundongos quanto uma doença desmielinizante crônica similar à esclerose múltipla. Os membros do gênero Parechovirus estão associados à paralisia flácida e encefalite, e o teschovirus suíno, do gênero Teschovirus, está relacionado ao desenvolvimento de polioencefalite em porcos (RACANIELLO, 2008).

Nesse trabalho, resolvemos usar dois parâmetros diferentes daqueles utilizados por Araújo (2006). O primeiro foi o uso da linhagem BALB/c, que foi e scolhida como modelo experimental devido a algumas dificuldades com relação à imunodetecção de moléculas específicas de células do sistema imune e de citocinas anteriormente realizadas em camundongos albinos suíços; e o segundo foi a via de inoculação i. n., pois queríamos reproduzir uma infecção mais próxima do natural. Com essas duas mudanças, observamos de imediato um aumento de cinco dias no tempo de sobrevida dos animais, que passou de sete para doze dias. O uso de uma linhagem isogênica, que em princípio deveria ser mais sensível à infecção, não demonstrou diminuição no tempo de sobrevida dos camundongos. Isso se deve provavelmente à via de inoculação, pois, a saturação dos receptores do sistema olfatório por partículas virais limita a quantidade de vírus que entram nas células do SNC; enquanto que na inoculação i. c., além dos vírus terem acesso direto, a quantidade de partículas virais que chegam ao sistema nervoso é maior, pois não dependem de receptores de um grupo específico de células.

No estudo de Araújo (2006), as alterações anátomo-patológicas em camundongos infectados com o vírus Juruaçá demonstraram no 4º d.p.i. alterações principalmente no cérebro dos animais, apresentando leve espongiose com vasos proeminentes e presença de células neuronais com aspecto apoptótico; com oito d.p.i. observou-se intenso aspecto espongiótico com comprometimento do parênquima cerebral associado à proeminência vascular, necrose e apoptose neuronal, além de infiltrado inflamatório polimorfonuclear. A análise por imunohistoquímica mostrou que o padrão de imunomarcação foi difuso, acometendo tanto corpos neuronais quanto células gliais em todas as regiões encefálicas, entretanto com nítida preferência por áreas onde predomina os achados de nódulos gliais e maior intensidade de infiltrado inflamatório.

Nossos resultados demonstraram alterações semelhantes àquelas descritas acima, com algumas diferenças. As lesões foram menos evidentes no 4º d.p.i. e se intensificaram a partir do 8º d.p.i., finalizando no 12º d.p.i. com intensa destruição da região cortical e ativação microglial, que demonstra maior susceptibilidade das células neurais ao vírus e consequentemente maior ativação microglial nessa região do encéfalo (Figuras 14, 15, 16, 18, 19 e 20).

Infecções por enterovírus no SNC podem estar associadas à paralisia flácida aguda (SOLOMON; WILLISON 2003; SOLOMON et al., 2010), mielite disseminante aguda e mielite transversa aguda (AGIN et al., 2010). De acordo com Rhoades e colaboradores (2011), a infecção por enterovírus pode comprometer a função do plexo coróide, uma estrutura importante que está envolvida na produção do líquido cefalorraquidiano e na regulação imune; além disso, é observada a presença de células apoptóticas em ratos infectados que apresentam paralisia. Nos camundongos infectados com o vírus Juruaçá, foram observadas alterações nos plexos coróides, como infiltrado leucocitário e congestão vascular e a presença de células apoptóticas foi bastante evidenciada principalmente no 12º d.p.i. (Figuras 14, 15 e 16). No entanto, não foi evidenciado grande acometimento dessa região, como descrito no estudo de Rhoades e colaboradores (2011), apesar do vírus Juruaçá pertencer ao gênero Enterovirus.

Na infecção causada pelo vírus Theiler, os camundongos inoculados desenvolvem polioencefalite uma semana após a inoculação, caracterizada pelo envolvimento da substância cinzenta cerebral e da medula espinhal, com presença de infiltrado leucocitário mononuclear perivascular e subaracnóide constituído de linfócitos, monócitos e macrófagos. Embora haja infiltrado linfocítico de leptomeninges e córtex cerebral, a inflamação está concentrada na substância cinzenta subcortical, principalmente na região do diencéfalo (tálamo, hipotálamo e epitálamo), no hipocampo e no gânglio basal. Na medula espinhal, a inflamação está localizada no corno anterior (OLESZAK et al., 2004). Diferentemente do que foi observado no estudo de Oleszak e colaboradores (2004), nossos resultados, mostraram que o maior acometimento ocorre na região cortical, onde foi observada intensa destruição do tecido neural. Em relação às demais áreas do encéfalo, poucas alterações foram observadas, embora antígenos virais tenham sido detectados em todo o SNC, inclusive na porção anterior da medula espinhal (Figuras 16 e 17).

6.2 RESPOSTA IMUNE NO SNC

Os patógenos pertencem a um grupo muito diverso de microrganismos e a sua detecção provoca grandes mudanças no sistema imune, um complexo de processos bioquímicos que permite a destruição de microrganismos patogênicos que ameaçam a viabilidade do hospedeiro (DUNKELBERGER; SONG 2010; MACHADO et al., 2004;

MELCHJORSEN et al., 2009).

De maneira sistêmica as defesas do hospedeiro contra infecções são iniciadas pelo sistema imune inato, que promove o reconhecimento dos microrganis mos patogênicos, como protozoário, fungos, bactérias e vírus, por meio da ligação dos PAMPs com seus respectivos RRP, tais como os TLR, induzindo a produção de citocinas pró- inflamatórias por células efetoras, como neutrófilo, macrófagos, células NK, células gliais, e iniciando o processo de morte celular programada (KAWAI; AKIRA 2006; KIRKMAN et al., 2010; KOYAMA et al., 2008; MELCHJORSEN et al., 2009; PICKUP; FRCPAHT 2004; ZHU, Z. et al., 2007). Em sequência, como um processo interligado ao sistema imune inato, ocorre a ativação do sistema imune adaptativo, que utiliza os receptores de linfócitos T e B para reconhecer de forma mais específica os patógenos e eliminá- los, além de promover a memória imunológica de longa duração contra reinfecção (DUNKELBERGER; SONG 2010; JOHNSEN, 2009; KIRKMAN et al., 2010; WANG, J. et al., 2012).

O desenvolvimento da resposta imune antiviral envolve a organização de uma rede complexa de células das respostas imunes inata e adaptativa. O controle das infecções virais é realizado inicialmente por meio da produção e liberação dos IFNs do tipo I – IFN α e IFN β – por macrófagos e células NK, destruindo as células infectadas com o agente viral e protegendo aquelas que ainda não entraram em contato com o vírus. Também ocorre a síntese de IFN-γ – IFN do tipo II – que atua ativando macrófagos e intensificando a ação citotóxica de células NK (BIACCHESI et al., 2009; JOHNSEN, 2009; MACHADO et al., 2004; MENACHERY, 2010; ROBBINS et al., 2007). Na imunidade adaptativa contra infecções virais, ocorre a ativação de células T CD8+ que reconhecem os antígenos virais via MHC de classe I e exercem citotoxicidade nas células infectadas; além disso, células T CD4+ são ativadas e colaboram com as células B na síntese de anticorpos (KOTILLIL et al., 2003; MACHADO et al., 2004).

As interações entre o sistema imunológico e o SNC constitui a rede reguladora mais complexa e interativa em mamíferos. A resposta imune no SNC diante de uma infecção em princípio deve ser um processo rápido, rigorosamente controlado que reduza de forma eficaz a

disseminação do agente infeccioso, resultando em danos mínimos ao cérebro e prevenindo uma reposta auto- imune (CHAKRABORTY et al., 2010). A resposta imune no SNC depende da ação das células neuronais e de outras células residentes – células gliais – capazes de distinguir as células do hospedeiro das proteínas neurotóxicas, células apoptóticas e agentes patogênicos (FARINA et al., 2007; GRIFFITHS, 2009, 2010; LEVITE et al., 2008).

As células microgliais são os sensores de infecções virais no SNC e desempenham um papel fundamental na geração de resposta imune inata. Durante as fases iniciais da infecção viral, essas células atuam como importantes mediadores de processos neuroinflamatórios e representam a primeira linha de defesa antes da infiltração de linfócitos no cérebro por meio da produção e secreção de inúmeros moduladores imunes (ARAVALLI et al., 2005; FURR; MARRIOTT 2012; MESTRE et al., 2006; STELLA, 2009).

Alguns estudos mostram que o vírus HSV-1 afeta particularmente neurônios e células gliais e pode induzir uma resposta imune pela ativação de micróglias mediante a sinalização por TLR-2 e TLR-9, resultando na produção de citocinas, como TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-1β e IL-6, e quimiocinas que provocam dano neuronal por estresse oxidativo e apoptose (ABDELMAGID, 2012; MARQUES et al., 2008; SCHACHTELE et al., 2010; SERGERIE et al., 2007).

Outros trabalhos mostraram que as micróglias podem ser ativadas pela presença do VEMT por meio do reconhecimento do agente viral pelos diferentes tipos TLR, promovendo o aumento da produção de citocinas pró- inflamatórias e quimiocinas; além de induzir a expressão elevada de moléculas co-estimulatórias e do MHC de classe II, o que demonstram o importante papel da micróglia como célula apresentadora de antígeno (OLSON; MILLER 2004). Astrócitos e oligodendrócitos também podem auxiliar na indução da resposta imune no SNC (ALOISI et al., 1998).

Durante a infecção no SNC, o VEJ inicia uma intensa resposta inflamatória com desenvolvimento da resposta imune inata, ativação do sistema complemento e de células NK, ativação microglial e presença de infiltrado leucocitário, resultando na produção de diversas citocinas pró- inflamatórias e anti- inflamatórias, incluindo IL-1β e IL-18, as quais tem um papel importante na febre, choque séptico e doenças inflamatórias (DAS, et al., 2011; GUPTA; RAO 2011; KAUSHIK et al., 2012).

Assim como foi evidenciado nos trabalhos de Abdelmagid (2012), Aloisi e colaboradores (1998), Olsen e Miller (2004) e outros autores, em camundongos inoculados com o vírus Juruaçá, objeto desse trabalho, foi observado que as células do SNC, especialmente micróglias, astrócitos e oligodendrócitos, são susceptíveis à infecção por esse

vírus, uma vez que foram encontrados antígenos virais no citoplasma desses tipos celulares (Figuras 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 17). Em decorrência disso, as células gliais do SNC dos camundongos infectados, principalmente micróglias, estão envolvidas na resposta imune e, consequentemente, na intensa lesão do parênquima cerebral, uma vez que estas células foram detectadas por imunohistoquímica no córtex, apresentando morfologia compatível com o estágio mais avançado de ativação (aspecto amebóide) (Figuras 18, 19 e 20). Esses achados são semelhantes àqueles demonstrados por Gupta e Rao (2011), Marques e colaboradores (2008), Olson e Miller (2004) e Schachtele e colaboradores (2010), nos quais foram observados ativação microglial diante de uma infecção por vírus.

Nesses animais infectados foram detectadas, por ensaios imunoenzimáticos, as citocinas pró- inflamatórias IL-12p40, IL-6, TNF-α, IFN-γ e IL-1β, em concentrações bastante

elevadas (Figuras 23, 24, 25, 26 e 27), além das citocinas anti- inflamatórias IL-4 e IL-10, assim como foi observado nos trabalhos de Kaushik e colaboradores (2012), Olson e Miller (2004) e Sergerie e colaboradores (2007). As citocinas IL-10 e IL-4, no entanto, foram detectadas em níveis cada vez menores a medida que a infecção progride ao longo do período de sobrevivência dos camundongos (Figuras 28 e 29). Essa redução se deve muito provavelmente ao aumento da produção das citocinas pró-inflamatórias por células residentes do SNC, principalmente micróglias altamente ativadas, na tentativa de eliminar o patógeno. Células dos poucos infiltrados leucocitários encontrados podem também ter contribuído para produção destes mediadores inflamatórios.

As citocinas tem um papel fundamental na indução e regulação da resposta imune contra vírus neurotrópicos. Em alguns casos a eliminação de vírus do SNC requer a migração de células do sistema imune para o local da infecção e envolve a proliferação e a diferenciação de células efetoras; todos esses processos são mediados por citocinas e quimiocinas produzidas por leucócitos, micróglias e astrócitos (MARTINEY et al., 1998; OLESZAK et al., 2004; WANG et al., 2012). As citocinas são importantes tanto para intensificar e propagar a resposta imune antiviral, quanto para regular a resposta inflamatória após a eliminação do vírus (CHANG et al., 2000; OLESZAK et al., 2004; THEIL et al., 2000).

Esses mediadores inflamatórios estão envolvidos na patogênese de diversas doenças, inclusive na infecção causada pelo VEMT, modulando tanto a fase aguda quanto a fase crônica dessa doença que são caracterizadas por diferentes aspectos patológicos (OLESZAK et al., 2004). Em decorrência da resposta imune desencadeada no SNC após invasão pelo HSV-1, tem-se cogitado que a patogênese da encefalite herpética (EH) esteja ligada ao papel

deletério que a liberação descontrolada de mediadores inflamatórios desempenha sobre o tecido cerebral (ROZENBERG et al., 2011, SAITO, 2011).

Uma dessas citocinas, a IL-12, é essencial para a geração da resposta do tipo Th1 e é

produzida principalmente por macrófagos, células dendríticas, astrócitos, micróglias e linfócitos B. É negativamente regulada pela IL-4 e IL-10, que são potentes citocinas indutoras da resposta do tipo Th2 (BUXBAUM; SCOTT 2005; TRIPATHI et al., 2007). No SNC, a

expressão da citocina IL-12 tem sido associada a diversas respostas inflamatórias como EM, EAE em ratos e camundongos e na endotoxemia murina (PAGENSTECHER et al., 2000). Durante a resposta imune inata no SNC, a IL-12 induz a produção de IFN-γ e, em retorno, o IFN-γ estimula o aumento da produção de IL-12 (feedback positivo), contribuindo para a defesa local contra agentes infecciosos (KORNELISSE et al., 1997; KOMATSU et al., 1998; REISS; KOMATSU 1998; IRELAND et al., 2005).

Juntamente com infiltrado de macrófagos, a micróglia tem sido indicada como fonte principal de IL-12 em condições inflamatórias (BECHER et al., 2000; HANISCH, 2002). In vitro, micróglias expressam mRNA de IL-12p35 e p40 e secreta IL-12p70 bioativa após exposição ao IFN-γ juntamente com LPS (ALOISI, 2005; HANISCH, 2002). Essas células também expressam receptor de IL-12 funcional, cuja estimulação induz a produção de citocinas e de NO, o que sugere que IL-12 pode também promover ativação da micróglia (ALOISI, 2005).

A IL-6 é um importante ativador de processo inflamatório e dirige a transição da resposta imune inata para a adaptativa (JONES, 2005; RUBIO et al., 2011). Essa citocina pode ser induzida em astrócitos pela infecção causada por diferentes agentes virais, tais como o VSV e VEMT (RUBIO et al., 2011); e a sua presença é um indicativo da origem infecciosa de alguns doenças auto- imunes (VAN-HETEREN et al., 2008).

De acordo com Rubio e colaboradores (2011), culturas de astrócitos infectadas co m VEMT – um vírus responsável por causar uma doença desmielinizante em camundongos susceptíveis é usado como modelo de esclerose múltipla – apresentam alta expressão e produção de IL-6, sugerindo que essa citocina pode estar associada à desmielinização por meio do recrutamento de células imunes para o local da infecção. Outros trabalhos relatam a habilidade de culturas primárias de micróglias e astrócitos de responder a infecções causadas por vírus de RNA e DNA produzindo mediadores pró- inflamatórios, tais como TNF-α, IL-1β e IL-6 (CHAUHAN et al., 2010; FURR; MARRIOTT 2012).

Durante a infecção causada pelo vírus Juruaçá, foi observada uma produção significativamente elevada das citocinas IL-12p40 e IL-6 (Figuras 23 e 24) a partir do 8º d. p.

i. no encéfalo dos animais infectados, e mesmo sofrendo uma queda na concentração no 12º d. p. i., ainda continuaram apresentando níveis consideravelmente altos. Dados semelhantes foram encontrados nos estudos realizados por Aloisi (2005), Chauhan e colaboradores (2010), Hanisch (2000), Jones (2005) e Tripathi e colaboradores (2007), nos quais se observou a produção dessas citocinas por células do SNC, principalmente micróglias e astrócitos. Rubio e colaboradores afirmaram que a citocina IL-6 também é produzida na doença causada pelo VEMT e pode estar relacionada à doença desmielinizante provocada por esse agente viral; de acordo com esse dado, a produção de IL-6 durante a infecção causada pelo vírus Juruaçá pode ser um indicativo do desenvolvimento de uma possível doença desmielinizante nos camundongos infectados.

A citocina TNF-α é secretada por células NK, macrófagos e células T ativadas e é capaz de induzir a lise celular e apoptose, porém, pode levar a produção de mediadores inflamatórios e proteínas antiapoptóticas; esses dois mecanismos de ação do TNF- α depende do tipo de receptor (TNF-RI e TNF-RII) que está presente na maioria das células no local da infecção (KIRKMAN et al., 2010, KRISHNASWAMY et al., 2006). Além disso, essa citocina atua como um indutor na síntese de IL-6 durante o processo inflamatório induzido por infecções virais (BEVENISTE et al., 1990).

O TNF-α pode ter efeito citotóxico em diversos tipos celulares, como ocorre em EAE causando danos em oligodendrócitos. Inoue e colaboradores (1996) demonstraram a relação entre o grau de desmielinização e o aumento da expressão de TNF-α no cérebro de camundongos infectados com o vírus Theiler. Begolka e colaboradores (1998), por sua vez, demonstraram que, durante a infecção induzida pela cepa BeAn do VEMT em camundongos