1.
Empregar o software de transferência de método de CLAE para CLUE na análise
simultânea de cremes contendo clotrimazol e dexametasona acetato e otimizar a
extração desses fármacos a partir de formas farmacêuticas semissólidas.
2.
Utilizar o software “ChromSword Auto Rapid” como ferramenta de desenvolvimento
de método por CLUE para análise simultânea de conservantes e corticosteroides em
coluna de núcleo sólido com 1.3 µm de tamanho de partícula.
3.
Desenvolver e validar um método cromatográfico ultrarrápido com planejamento
fatorial 3
3para análise de creme, loção, gel e pomada contendo betametasona valerato.
4.
Desenvolver um modelo de previsão de fator de retenção por QSRR para
corticosteroides em cromatografia líquida de ultra eficiência em fase reversa e aplicar
o modelo na criação de um simulador para análise simultânea destes compostos.
Capítulo 1
55Transferência de método e otimização de CLAE para CLUE para
determinação simultânea de clotrimazol e dexametasona acetato em
formulações semissólidas
1. Introdução
Dexametasona
(Figura
1)
é
um
esteróide
derivado
do
núcleo
ciclopentanoperidrofenantreno que apresenta atividade glicocorticoide e anti-inflamatória.
Apresenta massa molar de 392,47 g.mol
-1e ponto de fusão entre 268° e 271°C. É isômero da
betametasona podendo ser caracterizado como um pó cristalino branco ou quase branco e
inodoro, praticamente insolúvel em água; facilmente solúvel em etanol, acetona, dioxano e
metanol (MARTINDALE, 1996; KOROKOLVAS e DE FRANÇA, 2001). A forma acetato
de dexametasona (DMA) é bastante utilizada em formulações de uso tópico possuindo potente
atividade antiinflamatória.
Figura 1. Estrutura química da dexametasona acetato.
Fonte: ChemSpider (ID 206624), 2016.
Clotrimazol (CLO) (Figura 2) é um derivado do imidazol que possui atividades
antifúngicas e antibacterianas. Apresenta massa molar de 344,83 g.mol
-1e ponto de fusão em
147 °C (KOROKOLVAS, 2001). Os azóis inibem as enzimas P450 fúngicas responsáveis
pela síntese do ergosterol, o principal esterol encontrado na membrana das células fúngicas. A
inibição de ergosterol altera a fluidez da membrana, interferindo na ação das enzimas
associadas à membrana. O efeito global consiste em inibição da replicação. Outra
conseqüência é a inibição da transformação das células da levedura cândida em hifas, a forma
invasida e patogênica deste microrganismo (GOODMAN & GILMAN, 2006).
Capítulo 1
56Figura 2. Estrutura química do clotrimazol.
Fonte: ChemSpider (ID 2710), 2016.
Cremes contendo a associação DMA e CLO são indicados para o tratamento de
eczemas, candidíase vulvovaginal, dermatites relacionadas à fungos entre outros processos
inflamatórios, agindo também na imunomodulação. Estas associações são apresentadas
comumente em bisnagas contendo 20, 30 ou 40 gramas de creme de uso tópico. Devido ao
sucesso no tratamento e a ampla variedade de ação farmacológica, as formulações associadas
de uso tópico contendo corticosteroides, estão entre os medicamentos mais prescritos no
mundo, com lucro estimado em 10 bilhões por ano (CARLOS; URIBE; FERNÁNDEZ-
PEÑAS, 2013).
No controle de qualidade físico-químico dessas formulações, o teor dos ativos costuma
ser determinado em corridas cromatográficas separadas, como recomendam os compêndios
oficiais (USP, 2015). As formulações farmacêuticas semissólidas são bastante complexas,
apresentam associações de excipientes gordurosos e geralmente misturas de mais de um tipo
de ativo. O preparo de amostra para extração destes compostos antes da injeção no
cromatógrafo líquido de alta eficiência também ocorre de maneira desgastante e tediosa
(SMITH; HAIGH; KANFER, 1985). É necessário retirar todos os interferentes antes da
injeção no equipamento. Os compêndios oficiais recomendam a extração de betametasona e
clotrimazol através de uso de tampões, seguido de aquecimento, resfriamento e centrifugação,
fazendo com que a análise de rotina seja bastante onerosa (USP, 2015). Rimawi e
colaboradores (2010) desenvolveram um método por CLAE para determinação simultânea de
betametasona e clotrimazol em cremes. Nesse estudo, o preparo de amostra foi realizado de
maneira mais simples que a recomendada pela Farmacopéia Americana, pois utilizou apenas a
dissolução da amostra em metanol. No entanto, os cromatogramas apresentaram a presença de
Capítulo 1
57picos interferentes que comprometeram a qualidade analítica, além do tempo de corrida por
injeção ser de oito minutos o que proporcionou elevado consumo de solvente na fase móvel.
Um método cromatográfico para determinação simultânea de compostos com
propriedades físico-químicas diferentes torna-se um desafio, uma vez que as separações em
fase reversa apolar requerem solutos no estado não-ionizado (LIN; WU, 1999).
Sabe-se que a transferência de métodos de CLAE para CLUE tem sido uma alternativa
ao desenvolvimento de novos métodos em CLUE. A transferência de métodos já
desenvolvidos e métodos oficiais vêm ganhando destaque uma vez que as análises em CLUE
oferecem maior rapidez, utiliza menor volume de amostra, maior número de amostras podem
ser analisadas em função do tempo e é obtido menor custo em rotina, não necessitando de
gastos para um desenvolvimento específico para CLUE. Essas vantagens vêm possibilitando o
aumento da produtividade em vários laboratórios analíticos de rotina. No entanto, é
recomendado que os métodos só sejam transferidos se os mesmos estiverem validados e após
a transferência, a otimização deverá seguir os critérios definidos por aQbD, ou seja, os
parâmetros cromatográficos deverão estar dentro da zona de robustez delimitada pelo Design
Space (VOGT & KORD, 2011).
2. Objetivos
O presente capítulo tem como objetivo:
- Empregar o software de transferência de método de CLAE para CLUE na análise
simultânea de cremes contendo clotrimazol e dexametasona acetato.
- Otimizar a extração desses fármacos.
- Otimizar o método em CLUE após a transferência.
3. Materiais e métodos
3.1. Materiais
3.1.1. Matéria-prima, solventes e outros materiais
Acetonitrila (grau HPLC) - Merck
® Metanol (grau HPLC) - Merck
®Capítulo 1
58 Cremes manipulados contendo a associação DMA e CLO
Cremes genéricos contendo DMA e CLO
Foram utilizados padrões de trabalho adquiridos da Farmacopeia Brasileira (padrão-
primário) e pelo fornecedor de matéria-prima Zhejiang Xianju Pharmaceutical
®, China
(padrão secundário), com pureza entre 98 e 100%. São eles:
1. Clotrimazol (CLO)
2. Dexametasona acetato (DMA)
3.1.2. Equipamentos e materiais de laboratório
Agitador Vortex QL – 901 BIOMIXER
®; Balança analítica GEHAKA
®– AG200;
Balões volumétricos - VIDROLABOR
®; Cromatógrafo Líquido de Ultra-eficiência, modelo UFLC XR
®(Shimadzu, Japão)
constituído pelos seguintes módulos: detector de arranjo de fotodiodos (SPD-20A),
forno para coluna (CTO-20A), auto injetor (SIL-20AHT), degaseificador de fase
móvel on-line (DGU-20A3), sistema controlador (CBM-20A), duas bombas (LC-
20AD) e sistema de dados (software) LC-Solution;
Pipetas automáticas de volume variável EPPENDORF
®Research
Pipetas volumétricas VIDROLABOR
® Ponteiras descartáveis EPPENDORF
®–amarelas (2 – 200 μL) e azuis (50 – 1000 μL);
Seringas descartáveis (1, 3, 5 e 10 mL) – BD
®. Sistema de purificação de água ultrapura Milli-Q, MILLIPORE
®;
Tubos descartáveis (0,1 – 2,0 mL) EPPENDORF
® Ultra-som UNIQUE
®1400;
Unidade filtrante descartável, 0,22 μm de poro, MILLIPORE
®;
Vials de tampa rosqueada (1,5 mL de capacidade) - SHIMADZU
® Provetas de 500mL
Coluna Shim-pack XR-ODS, totalmente porosa, partículas de 2,2 µm esféricas com
sílica de alto grau de pureza ligadas ao grupamento octadecilsilano (C18), suportam
variação de pH de 2,0 a 7,5 e temperatura máxima de 80 °C. Dimensões: 2,0 mm de
diâmetro x 50 mm de comprimento.
Capítulo 1
593.2. Métodos
3.2.1. Preparo das soluções estoque e padrão de trabalho
As soluções estoque de DMA e CLO foram preparadas separadamente. Inicialmente
os padrões foram pesados em balança analítica previamente calibrada e em seguida o volume
foi completado com diluente para a concentração final de 1 mg/mL para DMA e 5 mg/mL
para CLO. A solução diluente consistiu em metanol:ácido acético na proporção de 99:1.
As soluções de trabalho foram obtidas de diluições da solução estoque até a
concentração final de 0,2 mg/mL para DMA e 0,5 mg/mL para CLO.
3.2.2. Preparo da fase móvel
A fase móvel consistiu na mistura de solução tampão acetato de amônio (10 mM),
metanol e acetonitrila, na proporção de 27:33:40, respectivamente. Todo o conteúdo foi
filtrado em membrana de nylon com 0.22 µm de diâmetro de poro e degaseificada antes de
circular no sistema cromatográfico.
3.2.3. Preparo das amostras de creme
As amostras foram divididas em três grupos:
- Grupo 01: Placebo (creme manipulado sem ativos)
- Grupo 02: Creme placebo fortificado com padrões DMA e CLO de concentração conhecida
- Grupo 03: Cremes comerciais (manipulado e genérico), contendo 0,4 mg/g de DMA e 10
mg/g de CLO.
Todas as amostras foram preparadas da seguinte maneira: pesou-se 1,5 g de creme,
adicionou-se de metanol: ácido acético (99:1), conforme recomendado por Rimawi (2010),
agitou-se em agitador magnético em um Bécker de 50 mL e em seguida o volume foi
transferido para um balão volumétrico e o volume completado para 50 mL com o diluente.
Nas amostras de creme fortificadas, foram adicionadas quantidades conhecidas dos padrões
para a obtenção da concentração final de 12 µg/mL para DMA e 300 µg/mL para CLO. A
curva de calibração foi realizada nas amostras fortificadas nas concentrações de 5 – 200
µg/mL para DMA e 50 – 450 µg/mL para CLO.
Capítulo 1
603.2.4. Condições analíticas
As análises foram realizadas em cromatógrafo líquido de ultra eficiência, modelo
Shimadzu Prominence UFLC-XR® (Shimadzu, Japan), equipado com duas bombas LC 20-
ADXR, autoinjetor (SIL-20ACXR), degaseificador (DGU-20A3), forno de coluna (CTO-
20AC) e detector com arranjo de fotodiodos (SPD-M20A). Coluna cromatográfica em fase
reversa ShimPack XR-ODS (2.1 x 50 mm) com tamanho de partícula de 2.2 µm. Fase móvel
isocrática, tampão acetato de amônio, metanol e acetonitrila, na proporção de 27:33:40,
respectivamente. Fluxo 0,8 mL/min e comprimento de onda em 254 nm.
3.2.5. Transferência de método
Para análise simultânea da associação DMA e CLO, método desenvolvido para CLAE
por Rimawi e colaboradores (2010) foi escolhido como método de partida. Após inserir os
dados de entrada no software Shimadzu Method Transfer, foi calculado quais seriam os
parâmetros ideiais para análise em CLUE. A fase móvel isocrática foi mantida. O software
sugeriu a alteração do fluxo de 1,5 mL/min para 0,8 mL/min. A coluna em fase reversa passou
de 4,6 mm de diâmetro para 2,1 mm e o comprimento de 250 mm para 50 mm. O tamanho de
partícula de 5 µm, utilizada em CLAE, foi sugerido o uso de 2.2 µm de tamanho para CLUE.
O volume de injeção recomendado após a transferência do método foi 1 µL. O comprimento
de onda foi mantido em 254 nm. O software não faz ajuste de temperatura do forno de coluna,
portanto, se necessário, é recomendado que esse parâmetro seja ajustado pelo analista. As
condições do método após a transferência de CLAE para CLUE estão apresentadas na Figura
3.
Capítulo 1
61Figura 3. PrintScreen da tela do Software Shimadzu Method Transfer, mostrando as
condições cromatográficas iniciais e após a transferência de método.
Fonte: adaptado de Shimadzu
®, 2015.
4. Resultados e Discussão
Na primeira corrida cromatográfica realizada com o método proposto pelo software,
foi observada interferências de constituintes das formulações. O método foi então otimizado
por intervenção do analista através da mudança do fluxo, de 0,8 mL/min para 0,6 mL/min.
Houve também a necessidade de ajuste da temperatura do forno da coluna para uma melhor
separação dos componentes da amostra (Figura 4).
Capítulo 1
62Figura 4. Transferência do método de CLAE para CLUE, após ajuste e otimização do fluxo
da fase móvel e temperatura do forno da coluna.
Fonte: adaptado de RIMAWI, 2010.
Sabe-se que o ajuste da temperatura da coluna é um parâmetro imprescindível em
cromatografia líquida de ultra eficiência. A utilização de colunas empacotadas com partículas
muito pequenas em altas velocidades de fase móvel gera pressões muito altas e como
consequência, o atrito da fase móvel através da coluna induz o calor. Este fenômeno é
conhecido como aquecimento por fricção e pode ser prejudicial para o desempenho da
separação. O calor gerado dissipa ao longo da coluna cromatográfica induzindo a formação de
gradientes de temperatura, tanto de maneira radial, como longitudinal. Dessa forma, a ultra
pressão do sistema requer um pré-aquecimento da fase móvel e elevada temperatura da coluna
para diminuição da viscosidade, diminuição da fricção e consequente diminuição da pressão
do sistema e melhoria da separação. A maioria das colunas desenvolvidas para uso em CLUE
suportam temperaturas que podem chegar a 80 °C. Nessa metodologia, entre as temperaturas
testadas, a temperatura de 70 °C proporcionou uma melhor separação com estabilidade da
pressão do sistema.
O preparo de amostra em metanol ocasionou o aparecimento de picos interferentes no
cromatograma, além de picos com base larga devido à dispersão dos analitos. Optou-se
portanto, por um solvente de força eluotrópica menor ou igual à fase móvel, de acordo com a
teoria cromatográfica. O cromatograma dos analitos extraídos pela fase móvel apresentou
picos mais concentrados com base estreita, mostrando que a otimização no preparo de
amostra interfere diretamente na qualidade da separação cromatográfica (Figura 5). O preparo
Capítulo 1
63de amostra nesse estudo é considerado simples quando comparado aos métodos oficiais (USP
33).
Figura 5. Cromatogramas em segunda dimensão mostrando as amostras de creme diluídas
em metanol (A), em que os analitos estão mais dispersivos; e diluídas na fase móvel (B),
mostrando analitos mais concentrados.
Fonte: autoria própria, 2015.
A linearidade do método foi determinada para DMA (R
20.9998) e CLO (R
20.999)
apresentando boa correlação linear entre a concentração do analito e a área do pico. Em
seguida foi determinado o teor dos ativos nas formulações comerciais manipuladas e
genéricas (Figuras 6 e 7). Os cromatogramas apresentaram boa resolução e simetria. A análise
foi considerada rápida (2 minutos), quando comparado ao método de referência (8 minutos).
O método obtido por CLUE, também apresentou uma economia de solvente: em CLAE são
gastos 12 mL por cromatograma e em CLUE apenas 1,6 mL de fase móvel.
A
Capítulo 1
64Figura 6. Cromatograma do creme manipulado contendo DMA e CLO após transferência de
método de CLAE para CLUE.
Fonte: autoria própria, 2015.
Figura 7. Cromatograma do creme genérico contendo DMA e CLO após transferência de
método de CLAE para CLUE.
Fonte: autoria própria, 2015.
1.0
2.0
3.0
4.0
min
0
10
20
30
40
mAU
240nm,4nm (1.00) D e x a C lo tr i 1.0 2.0 3.0 min 0 10 20 30 mAU 240nm,4nm (1.00) D e x a C lo tr iCapítulo 1
655. Conclusão do capítulo 1
O método obtido a partir de transferência de CLAE para CLUE, seguido de pequenos
ajustes para otimização, possibilitou a determinação simultânea de DMA e CLO em amostras
comerciais de cremes. O método foi obtido de maneira rápida, seguindo a recomendação
aQbD, utilizando ferramenta de planejamento antes da execução do método. Houve portanto,
pouco gasto de solvente durante a otimização do método por CLUE, além do preparo de
amostra ser simples e rápido. O método ofereceu vantagens, quando comparado à CLAE, em
relação ao tempo e consumo de solventes, reforçando a importância do CLUE em análises de
rotina.
Capítulo 2
67Determinação simultânea de corticosteróides e conservantes em coluna
empacotada com partículas de núcleo sólido com 1,3 µm de tamanho
através de desenvolvimento por software simulador
1. Introdução
Corticosteroides de uso tópico são utilizados para o tratamento de uma variedade de
enfermidades na pele. Estas formulações são comumente apresentadas como creme, loção, gel
e pomada, em formas associadas ou não. A quantificação simultânea de ativos torna-se uma
necessidade uma vez que a crescente rotina dos laboratórios analíticos buscam alternativas
eficazes para redução de tempo e consumo de solventes (GUILLARME et al., 2007). As
técnicas cromatográficas estão entre as mais utilizadas nos laboratórios de controle de
qualidade. A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica bastante pelas agências
regulatórias, aplicando-se em diversas determinações dentro do campo farmacêutico, como
identificação e quantificação de fármacos, metabólitos, impurezas e produtos de degradação.
Entretanto, possui como enorme desvantagem o alto consumo de solventes tóxicos usados
rotineiramente, gerando resíduos prejudiciais à saúde do analista e ao meio ambiente. Nesse
sentido, o CLUE está ganhando popularidade e aceitação nos laboratórios analíticos, uma vez
que o foi desenvolvido com o objetivo principal de diminuir o tempo de análise e o consumo
de solventes. O CLUE utiliza colunas com pequeno tamanho de partículas capazes de
aumentar a eficiência de separação para um número superior a 1.000.000 de pratos teóricos
(GRITTI; GUIOCHON, 2013). Recentemente lançada no mercado, a coluna de núcleo sólido
com tamanho de partícula de 1.3 µm promete separações mais eficientes e mais rápidas que as
colunas convencionais de núcleo sólido utilizadas em CLUE. (Figura 1).
Capítulo 2
68Figura 1. Gráfico de VanDeemter comparando a eficiência das colunas com partículas de
núcleo sólido de diferentes tamanhos disponíveis no mercado.
Fonte: Phenomenex
®, 2015.
A principal diferença entre colunas com partículas de núcleo sólido e partículas de
núcleo poroso, é que esta ultima apesar de promover análises rápidas, apresenta maior
alargamento na base do pico quando comparada à primeira (Figura 2).
Figura 2. Comparação entre partícula de núcleo sólido (à esquerda) e partícula de núcleo
poroso (à direita): alargamento da base e menor eficiência encontrada na partícula porosa.
Fonte: Agilent Technologies
®, 2015.
A facilidade de travessia do analito pela partícula de núcleo sólido é explicado pelo
termo “A” ou coeficiente de dispersão de Eddy que revela as diferenças de velocidade do
analito de acordo com a velocidade da fase móvel devido às diferenças existentes nas rotas
intra-partícula e inter-partícula (GRITTI; GUIOCHON, 2012; PLENIS, 2014). Ainda existem
poucos dados na literatura relacionados à análise e comportamento de diferentes compostos
em colunas com 1.3 µm de tamanho de partícula.
Capítulo 2
69Métodos cromatográficos com suporte e simulação computacional estão em constante
desenvolvimento e evolução. Como estratégia aQbD, a simulação de retenção de compostos
em um determinada condição cromatográfica permite que o método seja desenvolvido de
maneira mais rápida e planejada, sem a necessidade de gasto de solventes e material de
laboratório. Entre os softwares simuladores disponíveis no mercado, que atendem ao aQbD,
destaca-se o ChromSword
®, desenvolvido pela Merck
®(HEWITT; LUKULAY;
GALUSHKO, 2006). Neste software é possível que um novo método seja desenvolvido com
apelas três corridas cromatográficas. O mesmo permite a otimização virtual das separações
cromatográficas usando modelos de retenção físico-química ou através da utilização empírica
de dados CLAE reais. Isto é feito mediante vários procedimentos de simulação e otimização
inteligentes que visam melhorar a resolução de pico ideal em menor tempo de análise.
2. Objetivo
O presente capítulo tem como objetivo:
Utilizar o software
“ChromSword Auto Rapid” como ferramenta aQbD de
desenvolvimento de método por CLUE para análise simultânea de conservantes e
corticosteroides em coluna de núcleo sólido com 1.3 µm de tamanho de partícula.
Investigar a eficiência e seletividade da coluna de núcleo sólido com 1.3 µm de
tamanho de partícula comparando com outras colunas para uso em CLUE.
3. Materiais e métodos
3.1. Materiais
3.1.1. Matéria-prima, solventes e outros materiais
Acetonitrila (grau HPLC) - Merck
® Metanol (grau HPLC) - Merck
®Foram utilizados padrões de trabalho adquiridos da Farmacopeia Brasileira (padrão-
primário) e pelo fornecedor de matéria-prima Zhejiang Xianju Pharmaceutical
®, China
(padrão secundário), com pureza entre 98 e 100%. São eles:
Capítulo 2
70 Desonida (DS)
Dexametasona (DM)
Betametasona (BM)
Clobetasol (CB)
Metilparabeno (MP)
Propilparabeno (PB)
3.1.2. Equipamentos e materiais de laboratório
Agitador Vortex QL – 901 BIOMIXER
®; Balança analítica GEHAKA
®– AG200;
Balões volumétricos - VIDROLABOR
®; Cromatógrafo Líquido de Ultra-eficiência, modelo UFLC XR
®(Shimadzu, Japão)
constituído pelos seguintes módulos: detector de arranjo de fotodiodos (SPD-20A),
forno para coluna (CTO-20A), auto injetor (SIL-20AHT), degaseificador de fase
móvel on-line (DGU-20A3), sistema controlador (CBM-20A), duas bombas (LC-
20AD) e sistema de dados (software) LC-Solution;
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
– Merck Hitachi, com software
ChromSword Auto Rapid.
Pipetas automáticas de volume variável EPPENDORF
®Research
Pipetas volumétricas VIDROLABOR
® Ponteiras descartáveis EPPENDORF
®–amarelas (2 – 200 μL) e azuis (50 – 1000 μL);
Seringas descartáveis (1, 3, 5 e 10 mL) – BD
®. Sistema de purificação de água ultrapura Milli-Q, MILLIPORE
®;
Tubos descartáveis (0,1 – 2,0 mL) EPPENDORF
® Ultra-som UNIQUE
®1400;
Unidade filtrante descartável, 0,22 μm de poro, MILLIPORE
®;
Vials de tampa rosqueada (1,5 mL de capacidade) - SHIMADZU
® Provetas de 500mL
Coluna Shim-pack XR-ODS, totalmente porosa, partículas de 2,2 µm esféricas com
sílica de alto grau de pureza ligadas ao grupamento octadecilsilano (C18), suportam
variação de pH de 2,0 a 7,5 e temperatura máxima de 80 °C. Dimensões: 2,0 mm de
diâmetro x 50 mm de comprimento.
Capítulo 2
713.2. Métodos
3.2.1. Preparo das soluções estoque e padrão de trabalho
As soluções estoque dos analitos HS, DS, DM, BM, CB, MP e PB foram preparadas
separadamente. Inicialmente pesou-se o ativo em balança analítica previamente calibrada e
em seguida o volume foi completado com diluente para a concentração final de 1 mg/mL para
todos os analitos.
As soluções de trabalho foram obtidas de diluições da solução estoque, obtendo uma
concentração final de 50 ppm para os analitos.
3.2.2. Preparo da fase móvel
A fase móvel consistiu inicialmente em metanol: água ou acetonitrila: água. Todo o
conteúdo foi filtrado em membrana de nylon com 0.22 µm de diâmetro de poro e
degaseificada antes de circular no sistema cromatográfico.
3.3.3. Condições analíticas
Inicialmente as análises foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência,
modelo Merck-Hitachi com software ChromSword Autorapid
®. A mistura com os sete
analitos foram injetadas em coluna para CLAE, Inertsil C18 (250 mm x 4,6) que estava
presente na base de dados e foi solicitada do software (Figura 3). Após o desenvolvimento em
CLAE, o método foi transferido para o CLUE.
Em seguida, as análises foram realizadas em cromatógrafo líquido de ultra eficiência,
In document
Inkluderende utelek
(sider 54-57)