a homo-fenilalanina é o aminoácido requerido para o reconhecimento enzimático. A inibição da babesipaína-1, para 2.12a e 2.12b (R2 = Phe e R3 = Ph) e 2.12c e 2.12d (R2 = hPhe e R3 = Ph) relativamente à inibição das duas proteases de cisteína anteriores (FP-2 e CP-1), apresenta resultados diferentes. Os híbridos com a Gly, 2.12a, e com a Leu, 2.12c, em R1, originam uma melhor inibição da FP-2 (IC50 = 16,5 µM e 4,95 µM,
respectivamente), porém relativamente à CP-1 e babesipaína-1, não se verificou este comportamento. Na inibição da CP-1 e da babesipaína-1 foi obtida uma melhor inibição para os híbridos 2.12b e 2.12d, ambos com o aminoácido Phe em R1. Esta variação na inibição destas proteases, parece indicar a existência de diferenças estruturais nestas três proteases de cisteína.
2.1.7 - Avaliação da estabilidade
A estabilidade dos híbridos C10-oxa em tampão fosfato isotónico pH 7,4 e
plasma humano foi estudada por HPLC com detector de UV. A metodologia utilizada está descrita no capítulo da Parte Experimental.
Foi utilizada a mistura de solventes água/acetonitrilo para o eluente de HPLC- UV, sendo este o sistema mais referido na literatura, utilizado quer em sistema isocrático ou em gradiente, para este tipo de compostos 269- 273. Devido à artemisinina não ter funções ionizáveis, o pH da fase móvel não afecta o comportamento em relação
ao tempo de retenção, o mesmo ocorrendo nos híbridos finais. Na Tabela 2.9 é possível verificar os sistemas de eluentes utilizados para estes híbridos C10-oxa do ácido
artelínico e os respectivos tempos de retenção (tr). O comprimento de onda escolhido
(λ=220 nm) para estes estudos de HPLC-UV foi obtido com base no espectro de UV traçado para os compostos.
Tabela 2.9 - Tempos de retenção obtidos para os híbridos C10-oxa, em função do eluente
utilizado (λ= 220 nm, fluxo 1ml/min, coluna RP18 250×4 mm, 5µm).
Híbrido
Eluente
tr /min
% H2O % ACN
2.12a 25a/30b 75a/70b 5,55a/6,48b
2.12b 25a,b 75 a,b 7,44 a,b
2.12c 25 a,b 75 a,b 8,26 a,b
2.12d 25 a,b 75 a,b 8,06 a,b
2.12e 25 a,b 75 a,b 6,18 a,b
2.12f 25 a/30b 75a/70b 6,46a/7,81b
ª - eluente utilizado nos ensaios em PBS
b
- eluente utilizado nos ensaios em plasma humano
O estudo da estabilidade dos compostos em tampão fosfato isotónico, pH 7,4 e em plasma humano, a 37ºC, pretende avaliar a susceptibilidade química e enzimática destes híbridos em condições fisiológicas.Da análise dos cromatogramas, conseguiu-se visualizar o desaparecimento do pico referente ao híbrido em questão, mas nunca se conseguiu identificar o aparecimento de outro pico, como resultado de uma possível reacção química ou enzimática nos estudos em PBS ou plasma, respectivamente. O pico referente à unidade da artemisinina, por esta não conter qualquer cromóforo identificável no UV, não foi visualizado, porém a unidade dipeptidilvinilsulfona, apesar de conter sistemas aromáticos, também não foi visualizada no HPLC, possivelmente por sair na frente do eluente. As constantes de velocidade (kobs) para a hidrólise destes
híbridos foram calculadas a partir da diminuição da área do pico correspondente ao substrato ao longo do tempo em tampão fosfato e em plasma. Na Tabela 2.10
apresentam-se os valores de kobs e tempo de semi-vida (t½) para os híbridos C10-oxa
Tabela 2.10 - Valores de kobs e t½obtidos para os compostos em tampão fosfato isotónico pH 7,4 e plasma humano, a 37ºC e respectivos valores de log P.
Híbrido kobs/ h -1 t½ / h log Pa PBS Plasma Humano PBS Plasma Humano 2.12a Estável 2,4×10-2 > 300 29 4,94 2.12b Estável 1,8×10-2 > 300 39 5,96 2.12c Estável 1,1×10-2 > 300 54 6,08 2.12d Estável 1,4×10-2 > 300 48 6,26 2.12e Estável 8,4×10-3 > 300 83 5,34 2.12f Estável 1,9×10-2 > 300 36 5,55
a - log P calculado através do programa ALOGPS 2.1 251
Para o híbrido 2.12c foi calculado o valor de kobs em plasma, obtido por HPLC-MS,
como resultado da detecção da massa molecular do composto e o valor obtido de
1,3×10-2 h-1 é semelhante ao obtido por HPLC com o detector de UV (kobs = 1,1×10-2 h-1). O mesmo estudo foi efectuado em água para este híbrido e
analisado por HPLC-MS e verificou-se não existir hidrólise significativa, como determinado anteriormente em PBS por HPLC-UV. A reacção de hidrólise em PBS foi seguida durante cerca de 15 dias e não havendo alteração significativa nas áreas referentes ao pico do composto, concluiu-se que os compostos eram estáveis, não havendo qualquer distinção entre os híbridos. Em relação ao estudo em plasma, pode-se verificar que os híbridos apresentam um tempo de semi-vida menor comparativamente ao PBS, o que sugere uma possível hidrólise enzimática. Foi também efectuado o estudo por HPLC-MS, para a identificação dos possíveis metabolitos resultantes da hidrólise enzimática em plasma para o híbrido 2.12c. Apesar das várias condições utilizadas, entre as quais se efectuaram variações no eluente e nos potenciais e modo de ionização, conseguiu-se verificar o desaparecimento do pico referente ao híbrido 2.12c, mas não se conseguiram identificar as massas moleculares relativas os metabolitos prováveis. É de referir que o estudo por HPLC-MS na tentativa de identificar os possíveis metabolitos resultantes da estabilidade do híbrido 2.12c em plasma contínua em desenvolvimento.
Foi estudada a correlação entre os valores das constantes de velocidade obtidas experimentalmente e a lipofilia para os híbridos e não existe correlação linear entre os dois parâmetros (Gráfico 2.2). Verificou-se deste modo que a velocidade de hidrólise
enzimática destes compostos é independente da lipofilia dos compostos. Pode-se apenas afirmar que o híbrido 2.12a, sendo o menos lipofílico (log P = 4,94), é o que apresenta maior constante de velocidade e consequentemente menor tempo de semi-vida.
Gráfico 2.2 - Gráfico que correlaciona o log kobs em função de log P para os híbridos C10-oxa
derivados do ácido artelínico.
2.2 - Híbridos baseados no ácido artesúnico
2.2.1 - Síntese dos híbridos de ácido artesúnico e dipeptidilvinilsulfonas
Muitos derivados foram sintetizados a partir da dihidroartemisinina, principalmente devido às suas propriedades físico-químicas. A necessidade de compostos mais solúveis em água e as vantagens inerentes à sua administração intravenosa, levou ao desenvolvimento do hemisuccinato da dihidroartemisinina, o artesunato de sódio, 1.7, que na sua forma ácida se apresenta como o ácido artesúnico,
2.15 24. O O O O CH3 C H3 CH3 O O OH O Linker 2.15 -2,5 -2 -1,5 4,5 5 5,5 6 6,5 lo g kob s log P 2.12a 2.12e 2.12f 2.12b 2.12c 2.12d
O ácido artesúnico, ou o sal sódico, artesunato de sódio, é mais activo do que a própria artemisinina e é actualmente um dos fármacos mais utilizado na terapia combinada. Este fármaco exibe elevada eficácia quando administrado por via sistémica, porém a sua actividade diminui quando administrado por via oral. Devido a este facto têm sido sintetizados vários derivados ésteres da dihidroartemisinina, mais lipofílicos e incorporando estruturas químicas farmacologicamente vantajosas, como o adamantano, fluoreno ou bifenilo, com elevada actividade antimalárica 274.
Este facto levou-nos ao design e síntese de compostos híbridos contendo a unidade do ácido artesúnico covalentemente ligada à unidade dipeptidilvinilsulfona e com um linker diferente, relativamente aos híbridos do ácido artelínico. Estes compostos contendo a função química éster conjugada com o acetal, permitem estudar diferenças na estabilidade química e enzimática, comparativamente aos compostos híbridos C10-oxa sintetizados anteriormente.
Relativamente ao método de síntese, após obtenção do derivado com a função ácido carboxílico, o procedimento é igual ao descrito para o ácido artelínico, ou seja, o acoplamento da unidade dipeptidilvinilsulfona. No Esquema 2.6 está indicada a síntese para o ácido artesúnico, resultante da reacção da dihidroartemisinina com o anidrido succínico na presença do catalisador 4-dimetilaminopiridina (DMAP).
O O O O O O OH O O O O O CH3 OH i)