Avsluttende sammenfatning og diskusjon

Com o objetivo de confirmar a diversidade genética dos isolados de P. aeruginosa do HBDF, evidenciada pelo uso da técnica RAPD, as amostras, com diferentes perfis de resistência a antibióticos, foram submetidas à macro-restrição, mediante digestão do DNA cromossomal com a enzima de restrição XbaI (50U - TCTAGA – Promega) e separação dos fragmentos por PFGE.

Os procedimentos laboratoriais basearam-se na técnica preconizada por Struelens et al. (1993), mediante algumas modificações. As amostras foram cultivadas em meio de TSA, incubadas durante 18h a 37ºC, com agitação de 240 rpm. A densidade do meio foi ajustada para 109células/mL em tampão NaP [2% (p/v) sodium hexametaphosphate, para o pH 8,5 mediante solução de carbonato de sódio (Na2CO3)]. Para prevenir danos às moléculas de

DNA altamente frágeis, 500μL de solução contendo o número de células intactas obtidas foram embebidas em igual volume de agarose de baixa temperatura de fusão a 1,4% (Low

Melting Point Agarose - Invitrogen), liquefeita.

Após a homogeneização, a mistura foi distribuída em moldes para formar plugs, incubada a 4ºC, por 30 minutos. Depois da solidificação, os blocos foram colocados em 1mL de Tampão de Lise: 0.5 M EDTA, 1% SDS e 1 mg de pronase/mL (Streptomyces griséus -

Fluka). As amostras foram incubadas por 48h, em banho a 37ºC. Durante a incubação, e após 24h, acrescentou-se mais 1mg de proteinase K/mL (Tritirachium álbum - Sigma-Aldrich).

A solução de lise foi, então, descartada e os blocos de agarose incubados a 37ºC, duas vezes, por 1h, com TE-PMSF (10 mM Tris [pH8.0], 0.1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride - PMSF) e duas vezes em TE (Tris-EDTA), também por 1h, com o objetivo de eliminar quaisquer traços de proteinase K remanescentes. A seguir, foram incubados em 1μL de TE, overnight. Após os procedimentos de incubação, os blocos foram estocados em Tampão de Estocagem (10mM Tris, pH8.0, 50 mM EDTA, pH 8.0) a 4ºC, ou preparados para a digestão enzimática.

Os blocos de agarose para a etapa da digestão foram colocados em solução de volume final 400μL, contendo tampão apropriado da enzima, para a concentração final de 1X, e seroalbumina bovina (BSA) à concentração final de 0.1mg/mL, sem a adição da enzima de restrição, tendo sido incubados por 12 horas. As amostras selecionadas foram digeridas, overnight, com a enzima XbaI (50U - TCTAGA - Promega), tendo sido adicionado tampão e BSA, para o volume final de 400μL. Dessa forma, a fase de digestão dos moldes de DNA ocorreu a 37ºC, por 32h. Após o referido período, as amostras foram lavadas em TE, durante 1h, de forma a remover possíveis resíduos da digestão, favorecendo a expressão dos fragmentos no PFGE.

Após a digestão enzimática, as amostras de DNA nos plugs de agarose foram inseridas nos géis pelo corte dos plugs de forma a ajustar tamanho e largura aos poços do gel preparado ou liquefeitas a 55 ºC e aplicadas cuidadosamente, por meio de pipetas com ponteiras de abertura larga, em gel de agarose a 1% (100mL de TBE 1X, 1g de agarose, Grau Pulsed Field

Cromossomal, 100g – Bio Agency), com tampão TBE 0,5X (110mL de TBE 10X, 2.090mL

de H2O MilliQ), utilizando-se marcador de alto peso molecular (Bid Range II PFG Markers –

Biolabs).

Os fragmentos da macro-restrição foram separados por eletroforese de campo pulsado (PFGE), técnica utilizada para identificar DNAs de cromossomos de alto peso molecular, alternando campos elétricos em pares de eletrodos distintos, reorientando e movendo os fragmentos de DNA, a diferentes velocidades, através dos poros do gel de agarose.

Para otimização da técnica, foi utilizado gel de agarose à concentração de 1%, pois concentrações abaixo desta, embora sejam úteis para separar fragmentos de DNA de alto peso molecular, proporcionam bandas um pouco mais difusas. As concentrações entre 1,2% e 1,5% são tipicamente utilizadas para separar bandas muito próximas, entretanto o tempo de corrida se eleva expressivamente. Ao considerar que amostras de DNA podem ser afetadas não apenas pela concentração de agarose, como também pela concentração e temperatura do tampão, este foi mantido a 14°C para manter a nitidez das bandas, pois o aumento de temperatura, embora aumente a mobilidade do DNA, compromete a resolução do gel obtido ao final do experimento. A concentração comumente utilizada para a solução tampão é de 0.5x de TBE, sendo também possível utilizar o tampão TAE (tris-acetate buffer) em concentração 1.0x, podendo resultar, entretanto, em maior migração das moléculas de DNA.

A migração das moléculas de DNA ao longo do gel de agarose também é influenciada por outros fatores, como: intervalo dos pulsos, ângulo do campo pulsado e tempo de corrida. Na eletroforese de campo pulsado as moléculas de DNA mudam de direção e se reorientam no gel a cada pulso gerado. Os fragmentos maiores demoram mais para se reorientarem, tendo conseqüentemente menor tempo para se moverem durante o pulso, migrando assim mais lentamente que as moléculas menores. Assim, quanto maior o tamanho do DNA, mais elevados deverão ser os pulsos programados, pois a resolução é diretamente proporcional ao deslocamento das moléculas no gel, critério também utilizado no presente estudo, adotando uma evolução dos pulsos gerados de 4 a 8 segundos para 10 a 15 segundos, no período de 12 horas subsequente.

O aumento da voltagem promove uma maior migração do DNA no gel, podendo promover um decréscimo na especificidade (nitidez) das bandas. Para algumas amostras de DNA de alto peso molecular (> 3mb), a corrida com 6V/cm pode não ser adequada. No entanto, para a análise dos isolados de P. aeruginosa realizada neste trabalho, segundo o protocolo descrito por Struelens et al. (1993) e com ajuste dos demais fatores que influenciam a migração do DNA, a voltagem de 6V/cm proporcionou resultados positivos.

O sistema CHEF-DRIII permite a separação de fragmentos em qualquer direção no plano do gel (90 - 120°). Com dois vetores, a resolução de moléculas de DNA de cerca de 1mb é independente do ângulo do vetor selecionado. Para moléculas de pequeno peso

molecular, a adoção do ângulo de 94° aumenta a velocidade de migração, reduzindo no entanto, a resolução das bandas expressas. A análise de amostras de P. aeruginosa foi realizada com um ângulo de 120°, em razão de seu alto peso molecular.

Considerando que o tempo de corrida da eletroforese é determinado pela taxa de migração das moléculas de DNA no gel, o presente estudo utilizou tempo de corrida de 12h com pulsos crescentes de 4 a 8 segundos, acrescido de mais 12h com tempos de 10 a 15 segundos, conforme descrito por Struelens et al (1993), como mescanismo de ajuste aos fatores determinantes da técnica.

O sistema CHEF-DRIII (Bio-Rad), utilizado neste estudo, permitiu a separação de fragmentos grandes e pequenos de DNA com uma melhor resolução e acuracidade do que os métodos de campo pulsado inicialmente desenvolvidos. Este sistema, utilizando 24 eletrodos, dispostos em uma geometria hexagonal, permite evitar distorções por eventuais mudanças de tipo de tampão, espessura do gel, temperatura, proporcionando um resultado de alta resolução.

O aparelho CHEF-DR III SYSTEM foi programado para tempo de pulsos crescentes de 4 a 8 segundos, por 12h, a 6V/cm, num ângulo constante de 120º e em temperatura de 14ºC. O gel correu por mais 12h, com tempo de pulsos crescentes ajustados para 10 a 15 segundos, tendo sido mantidos os demais parâmetros, conforme recomendado por Struelens et al. (1993). Os géis foram corados em solução de brometo de etídio (0,5 μg/mL), por 15 minutos, sendo descorados em água destilada, por 30 minutos, e por fim fotografados por meio de um sistema computadorizado para a análise de gel, o qual utiliza luz Ultra-Violeta (Kodak Digital Science 1D - Kodak).