Os animais avaliados neste estudo eram provenientes da casuística do Serviço de Cirurgia de Pequenos Animais do Departamento de Cirurgia da FMVZ da Universidade de São Paulo, e consultados, após triagem, no Hospital Veterinário (HOVET). A presente pesquisa foi realizada de forma prospectiva com acompanhamento clínico dos animais e retornos posteriores aos procedimentos terapêuticos indicados. Os proprietários estiveram de acordo com a realização dos procedimentos de rinoscopia, tomografia, quimioterápicos e cirúrgico, quando recomendado e os pacientes foram acompanhados até o óbito. A casuística utilizada não refere a totalidade dos casos atendidos pela instituição, portanto estas informações não devem servir de base para um levantamento epidemiológico. Também, todos os procedimentos nos animais foram realizados após a aprovação do protocolo na CEUA da FMVZ-USP e com o consentimento esclarecido por escrito do proprietário (Anexo).
Os cães de raça mista ou SRD (40%) foram os mais acometidos e está ocorrência pode estar relacionada a predominância destes animais presentes na casuística do HOVET. De acordo com a distribuição dos casos, por sexo, o resultado foi conforme descrito em outros estudos sendo os cães machos mais afetados A maioria dos animais avaliados foram machos (56%), com idade média de 10,1 anos (DP = 2,7 anos). Apesar do tempo de sobrevida entre os sexos não ter apresentado resultados significativos pela estatística, as fêmeas apresentaram em média 41 dias a mais de sobrevida que os machos, e em sua maioria, animais com conformação craniana do tipo dolicocefálico e mesaticefálico (LANA; WITHROW, 2001; COHN, 2014).
As manifestações clínicas observadas vão ao encontro das apresentadas na literatura, com progressão rápida da afecção e de forma destrutiva, onde a maioria dos animais apresentaram mais de uma forma clínica da afecção (LANA; WITHROW, 2001; McCARTHY, 2005; GIEGER et al., 2013; COHN, 2014), sendo as esternutações com sangramento nasal, secreção nasal e distrição respiratória as principais manifestações (100%) seguindo para epistaxe (88%), epífora (60%), deformidade facial (60%), envolvimento da cavidade oral (32%) e manifestações neurológicas como confusão mental, desequilíbrio e convulsão (32%). Os animais
com distrição respiratória apresentavam algum grau de obstrução nasal caracterizada por dificuldade inspiratória e ruídos.
Nos animais com deformidade facial, o tempo de remissão foi menor estatisticamente (p= 0,05), e o mesmo ocorreu na presença de epistaxe (p=0,023), apresentando resultados significativos estatisticamente, com tempo mediano até remissão de 438 dias naqueles sem epistaxe e sem deformidade facial, e 119 dias que apresentaram epistaxe e deformidade facial.
De acordo com os testes estatísticos os animais com epistaxe demonstraram menor tempo de sobrevida. Nos casos de epistaxe em média 232 dias e sem: 580 dias, sendo significativos estatisticamente (p=0,015). Estes resultados corroboram com o outro estudo (RASSNICK et al., 2006) onde, cães com epistaxe, demonstraram maior risco de óbito comparado aos cães que não tiveram epistaxe. Neste estudo o tempo médio de sobrevivência de 22 animais foi em média 232 dias, porém com tratamento, já no estudo de Rassnick et al. (2006) em 107 cães com epistaxe o tempo médio de sobrevida foi de 88 dias, sem nenhum tratamento.
Epífora e deformidade facial também influenciaram no tempo de sobrevida, onde estes animais demonstraram um tempo menor em relação aos que não apresentaram estas manifestações, apesar desta influência, os resultados não foram significativos estatisticamente.
Os animais classificados nos estágios mais avançados, apresentaram resultados estatísticos significativos em relação ao tempo de sobrevida, ou seja, conforme o aumento da classificação do estadiamento, menor o tempo de sobrevida e também maior o risco óbito (5,86 vezes maior). Pelas imagens tomográficas, os resultados encontrados demonstraram que 72% (n=18) dos pacientes já apresentavam estágio avançado do tumor, dos quais foram classificados pelo estadiamento entre o estágio T4 e T5, corroborando com os resultados de Geiger et al. (2013) e Mason et al. (2014). No estudo de Mason et al. (2014) foram classificados 59% (45/76) dos casos como T4, e nos achados de Gieger et al. (2013) 60% dos animais com carcinomas (15/26) foram também classificados como T4. Estes autores utilizaram sistema semelhante ao utilizado neste trabalho, de classificação de tumores sinonasais em cães (ADAMS et al., 1998). Kondo et al. (2008), desenvolveram outro modelo de classificação tumoral, e também obtiveram em seus resultados maior índice nos cães entre o estágio III (32/112) e IV (40/112). Já no estudo de Langova et al. (2004) os animais avaliados foram classificados em
sua maioria entre o estágio T2 (4/8) e T3 (1/8). Em outro estudo com 94 cães (ADAMS et al., 2009) os cães com tumores unilaterais sem lise óssea além dos turbinados, obtiveram maior tempo de sobrevida daqueles que apresentaram envolvimento da placa cribiforme. Neste estudo, não houveram animais entre os estágios iniciais, mas aqueles no estágio menos avançado viveram mais, em média 444 dias, e no estágio avançado (T5) a sobrevida foi em média 184,6 dias.
No presente estudo, o número de animais avaliados pelo estadiamento, por meio da TCC foi menor, comparado aos outros estudos pois nem todos os cães atendidos contemplaram os critérios de inclusão, e não por falta de casuística. O tempo de segmento e tratamento que os demais autores utilizaram, também foram diferentes, sendo na maioria estudos de levantamento de dados, ou seja, estudo retrospectivo o que aumenta o número de casos (KONDO et al., 2008; ADAMS et al., 2009; GIEGER et al., 2013; MASON et al., 2014), o que difere deste estudo, do qual foi prospectivo. Pode se dizer que para a realização deste estudo o sistema de estadiamento que empregamos, apresentou resultados satisfatórios, principalmente, como fator prognóstico, onde seus resultados foram comprobatórios na questão do grau de extensão da afecção em relação ao tempo de sobrevida, o que pode trazer informações mais concretas sobre a sobrevida deste paciente em relação ao grau da afecção, porém, as alterações avaliadas não influenciaram na resposta ao tratamento ou na remissão da afecção de acordo com os resultados estatísticos.
Não houve relação com resultados estatisticamente significativos neste estudo entre os achados histopatológicos em relação ao grau do estadiamento, mas observou-se que os animais acometidos por tumores epiteliais foram em sua maioria classificados como T5 (6/15) e aqueles com tumores mesenquimais como T4 (5/10), porém, a casuística dos tumores epiteliais foi 20% maior.
O emprego do exame de rinoscopia foi satisfatório em todos os casos para a conclusão diagnóstica, possibilitando visibilizar o acometimento das cavidades nasais e nasofaringe por proliferações teciduais, assim como descrito por outros autores (WILLARD; RADLINSKY, 1999; NELSON; COUTO, 2001; NOONE, 2001; McCARTHY, 2005; VENKERVAN HAAGEN, 2005; PIETRA et al., 2010; AULER et al., 2015). Não foi possível avaliar pela rinoscopia o tipo tumoral, e também não se realizou nenhum teste comparativo entre os achados endoscópicos, com estudo histopatológico e sobrevida. No entanto, em cinco animais (caso 2,11, 13, 14 e 16)
em que realizou-se controle do estadiamento após o tratamento de quimioterapia sem intervenção cirúrgica, observou-se diminuição do tumor por meio da rinoscopia.
A coleta de material realizada durante o procedimento endoscópico ocorreu de forma direta e minimamente invasiva sem intercorrências dignas de nota (McCARTHY; McDEIRMAN, 1990; DAVIDSON et al., 2004; MALINOWSKI, 2005; McCARTHY, 2005; VENKERVANHAAGEN, 2005; PIETRA et al., 2010; AULER et al., 2015). De acordo com estes resultados considera- se a rinoscopia, além de excelente método de diagnóstico, apto para coleta de material de forma minimamente invasiva, onde em apenas um animal foi necessário nova coleta de biópsia por meio de incisão cirúrgica.
Os resultados estatísticos deste trabalho mostram que os animais submetidos ao procedimento cirúrgico em conjunto com a quimioterapia, alcançaram maior tempo de sobrevida, mas quando calculado tempos medianos de sobrevida dos animais operados, este resultado não foi significativo para o teste estatístico. Entretanto, pelo cálculo da média de sobrevida dos animais submetidos ao tratamento quimioterápico em conjunto com a cirurgia (335 dias), o tempo médio foi maior do que nos animais tratados apenas com o protocolo quimioterápico isolado (204 dias). No entanto, o número dos animais tratados por quimioterapia foi maior.
Baseando-se no tempo médio de sobrevida de 95 dias sem nenhum tratamento (MORRIS et al., 1994; RASSNICK et al., 2006), pode se dizer que a sobrevida dos animais tratados com os protocolos utilizados neste trabalho foi maior. No estudo realizado por Langova et al. (2004) utilizando o mesmo protocolo quimioterápico, com administração de piroxicam, sem intervenção cirúrgica, relatam como resultados remissão completa do quadro (4/8), remissão parcial (2/8) e doença estável (2/8), porém dentre estes animais, a remissão completa de dois casos ocorreu em cães classificados pelo estadiamento de Adams (1998) como T2, sendo apenas um animal classificado como T3 e o outro como T4. A remissão completa citada pelos autores permaneceu nestes cães em média 285,7 dias, e dos demais animais que apresentaram melhora parcial de 290 dias e daqueles com doença considerada estável foi de 617, 5 dias. Os autores referem-se aos animais com remissão completa, após controle tomográfico durante o tratamento, onde observou- se redução tumoral significativa, no entanto, houve recidiva da doença nasal diagnosticada com base nas manifestações clínicas e posteriormente confirmada pela TCC em todos os casos, e naqueles em que houve morte, a causa foi
relacionada com a recorrência da afecção (LANGOVA et al., 2004). Campos et al. (2013) realizaram em um cão com diagnóstico histopatológico de adenocarcinoma papilar sinonasal, procedimento cirúrgico adjutoriamente com tratamento quimioterápico com cloridrato de gencitabina e carboplatina, relatando aumento da sobrevida do paciente em 420 dias, entretanto, apesar de bom resultado, é apenas relato de um animal.
De acordo com as análises histopatológicas as neoplasias de origem epitelial (60%) foram mais freqüentes, como os carcinomas, adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas, e os outros 40% restantes de origem mesenquimal, representado pelos condrossarcomas, fibrossarcomas, hemangiossarcoma e osteossarcomas. Estes resultados corroboram com os descritos por outros autores (MADEWELL et al., 1976; LANA; WITHROW, 2001; LEFEBVRE; LANGOVA et al., 2004; KUEHN; WORTINGER, 2005; KONDO et al., 2008; COHN 2014). Os resultados comparativos entre tempo de sobrevida global, de remissão e os tipos tumorais não foram estatisticamente significativos.
Neste trabalho os cães com tumores epiteliais demonstraram como média de sobrevida 280 dias, sendo o mínimo 71 dias e o máximo 725 dias (caso 16) do qual manteve-se livre da doença durante 210 dias. Neste caso o tratamento preconizado foram as sessões de quimioterapia, em conjunto com a cirurgia, sendo administrado piroxicam durante quatro meses consecutivos. Neste estudo não foi comparado o uso do piroxicam com o tempo de sobrevida, pois a maioria dos cães não se adaptaram a medicação. Em ambos os casos os animais foram classificados no estágio T3, sendo que o paciente com o tempo de sobrevida menor foi submetido a eutanásia por opção do proprietário, antes de finalizar todas as sessões. Os animais com tumores de origem mesenquimal alcançaram em média 264 dias de sobrevida, onde o menor tempo foi 30 dias e o maior 458 dias, lembrando que foram inclusos os dois animais com neoplasias de origem mista, pois de acordo com o exame histopatológico as prevalências das células tumorais eram de origem mesenquimal.
O caso de menor tempo de sobrevida fora classificado por meio do estadiamento em T5 com invasão do tumor a nível cerebral (caso 24) em que se realizou apenas uma sessão de quimioterapia, vindo a óbito em decorrência de episódios convulsivos intermitentes, e o de maior tempo de sobrevida (caso 6), foi submetido a três intervenções cirúrgicas, com cerca de quatro meses entre um procedimento e outro. Além do paciente que faleceu 30 dias após o diagnóstico,
outros dois animais com neoplasias mesenquimais não foram submetidos ao procedimento cirúrgico, em um deles devido à localização e extensão tumoral contra-indicando o procedimento cirúrgico (caso 5) e em outro animal preferiu-se manter algumas sessões do tratamento quimioterápico antes de realizar a cirurgia (caso 15). O tempo de crescimento deste tumor em comparação ao de origem epitelial foi mais rápido e a resposta ao tratamento quimioterápico foi menor, entretanto, não se realizou a comparação entre o tempo de crescimento dos tipos tumorais. A radioterapia vêm sendo o tratamento de escolha para as neoplasias nasais malignas, pois de acordo com a literatura apresentam maior sobrevida e controle da afecção. São vários os protocolos descritos na literatura (LANA; WITHROW, 2001; TUREK; LANA 2007; ELLIOT; MAYER, 2009; GIEGER et al., 2013). Entretanto, quando somados os resultados referentes ao tempo médio de sobrevida de algumas pesquisas (cerca de 377 dias) (ADAMS et al., 1998; KONDO et al., 2008; ADAMS et al., 2009; SONES et al., 2012; GIEGER et al., 2013) não se nota diferença tão expressiva aos resultados deste trabalho na questão de tempo médio de sobrevida dos animais tratados com quimioterapia e cirurgia (335 dias), porém os resultados não foram comparados ao número de animais e ao tempo de segmento dos demais trabalhos, e nem foram realizados testes estatísticos entre os trabalhos.
Os animais submetidos ao procedimento cirúrgico demonstraram resultados significativos, porém, o tempo de controle da afecção entre as modalidades terapêuticas utilizadas nesta pesquisa, não apresentou resultados significativo, mas o tempo de sobrevida global dos pacientes foi maior com resultados significativos naqueles animais que demonstraram remissão (p=0,001).
Em relação aos marcadores tumorais (VEGF, EGFR, COX-2, Ki67, PCNA e p53), não houve correlação em relação ao sexo, idade e raça, e também entre as manifestações clínicas e estadiamento tumoral. Apesar de pouca relação entre os tipos tumorais, não houve resultados estatísticos significativos entre as neoplasias e a expressão dos marcadores.
A expressão do VEGF neste estudo foi detectada em 80% das amostras, e em 100% das amostras de origem epitelial, resultados semelhantes aos do estudo de Shiomitsu et al. (2009), sendo em sua maioria expressão considerada forte. Já nos tumores mesenquimais a expressão foi visibilizada em 50% das amostras destes tipos histológicos, onde sua graduação variou mesmo dentre os subtipos
tumorais comuns como nos condrossarcomas, osteossarcomas e nos tumores mistos. Em relação ao tempo de sobrevida e remissão, a expressão do VEGF, não demonstrou nenhum resultado estatístico significativo, de acordo com os testes utilizados. Embora existam vários estudos demonstrando a expressão positiva do VEGF nas células tumorais utilizando metodologias distintas e analisando algumas outras variáveis, não foram encontrados resultados que confirmem a possível relação entre a expressão da proteína VEGF e outros fatores prognósticos, o que não possibilitou comparar a ausência de correlação significativa aqui observada entre a expressão tumoral de VEGF com o tempo de sobrevida e remissão da afecção, visto que 58% dos tumores epiteliais e 50% expressaram fortemente o VEGF.
As amostras avaliadas demonstraram a expressão do EGFR em 38% dos tumores avaliados com graduação diversificada entre os tipos e subtipos tumorais, entretanto com maior ocorrência nos epiteliais. Este resultado demonstra que o EGFR pode estar presente em neoplasias malignas de cães com origem mesenquimal e epitelial assim como observado em outros estudos (GAMA et al., 2009; SHIOMITSU et al., 2009; SELVARAJAH et al., 2012; CAMPOS et al., 2014; GUIMARÃES et al., 2014; HANAZONO et al., 2015). O índice de positividade do EGFR entre as amostras avaliadas em comparação com outros estudos foi menor (SHIOMITSU et al., 2009; HANAZONO et al., 2015), este resultado pode estar relacionado ao número de amostras avaliadas ou ao tempo de fixação do tecido que podem influenciar na imunoreatividade deste marcador (SHIOMITSU et al., 2009). Quanto a ausência do marcador nos osteossarcomas nasais, o resultado foi semelhante ao do estudo realizado por Selvarajah et al. (2012), onde cães com osteossarcoma com expressão de EGFR fraca ou ausente demonstraram pior prognóstico. Estes resultados podem justificar a contradição entre os testes estatísticos que demonstram a influência da expressão do EGFR, onde na avaliação estimativa dos tempos medianos, o tempo de remissão foi menor naqueles animais em que a expressão foi moderada e forte, mas pelo teste multivariado (Cox) o que influenciou no tempo de remissão foi a expressão fraca ou ausente.
Os resultados foram significativos estatisticamente, na expressão moderada ou forte do EGFR em relação ao menor tempo de remissão da afecção pelos pacientes. Outros estudos não conseguiram correlacionar estatisticamente os resultados com a expressão do EGFR e o segmento clínico da afecção
(SELVARAJAH et al., 2012; HANAZONO et al., 2015). Assim como a participação do VEGF no prognóstico, a escassez de estudos de expressão de EGFR também é notória, o que impossibilita uma confrontação de resultados mais produtiva.
A detecção da expressão pela COX-2 em neoplasias nasais já foi descrita por outros autores em graus forte e moderado (BORZACCHIELLO; PACIELLO; PAPPARELLA, 2004; IMPELLIZZERI; ESPLIN, 2008; BELSHAW, 2010; CAMPOS et al., 2013). Neste estudo esta expressão foi detectada em cerca 62% das amostras. Já no estudo de Impellizeri e Esplin (2008), a expressão de COX-2 foi evidenciada em 95% dos casos. Belshaw et al. (2010), também alcançaram resultados semelhantes em 42 biópsias, onde 90% foram positivas para o COX-2. No entanto, em ambos os estudos, foram consideradas nas amostras além da marcação citoplasmática, a marcação nuclear, o que foi desconsiderado nas amostras avaliadas para este trabalho, sendo consideradas apenas expressão em membrana citoplasmática. Os resultados estatísticos que avaliaram a expressão da COX-2 foram significativos em relação ao tempo de sobrevida, onde os animais que demonstraram expressão considerada forte, obtiveram menor tempo de sobrevida em relação a aqueles com marcação ausente ou fraca, sendo diferente dos resultados descritos por Belshaw et al. (2010) dos quais não obtiveram resultados significativos entre o tempo de sobrevida e a expressão da COX-2 nos tecidos de carcinomas intranasais. Outros estudos não fizeram a correlação com o tempo de sobrevida e a expressão deste marcador em tumores intranasais, sendo apenas estudos em que comprovam a presença da COX-2 nestes tipos de tumores (CAMPOS et al., 2013). Entretanto, o resultado desta expressão não foi estatisticamente significativo na correlação com o tempo de remissão da doença, e também não houve associação estatisticamente significativa entre a expressão de COX-2 e o tipo histológico, diferentemente dos resultados demonstrados em outro estudo de neoplasias malignas em mama (HELLER et al., 2005).
O Ki67 e PCNA demonstraram marcação em todas as neoplasias malignas avaliadas. Altos níveis de PCNA em amostras tumorais de cães são geralmente associadas ao menor tempo de sobrevida e a resistência ao tratamento. No caso de tempo de sobrevida, neste trabalho os resultados não foram aos encontrados na literatura (NEWMAN, 2003). Já o Ki67, quando esteve presente em maior quantidade nos tecidos indicou menor tempo de sobrevida, pior prognóstico nos animais avaliados corroborando com a literatura (NEWMAN, 2003). No estudo,
realizado por Fu et al. (2014), apesar da expressão do Ki67 detectada nos núcleos das células avaliadas, não houve resultados estatisticamente significativos com a sobrevida, entretanto, os autores observaram que os animais com maior índice de expressão demonstraram menos tempo de sobrevida e menor resposta ao tratamento. Apesar de superexpressão dos marcadores Ki67 e PCNA, não foi possível correlacionar estes achados com o tempo de sobrevida e a remissão por meio dos testes estatísticos utilizados, porém, quando se calcula a média do tempo de sobrevida entre o grupo 1 e o grupo 2, nota-se, maior tempo de sobrevida entre aqueles que expressaram o Ki67 em menor quantidade (grupo 1), mas não houve relação com a resposta ao tratamento. Esta observação também esteve presente entre os grupos que expressaram o marcador PCNA.
A expressão do gene p53, foi visibilizado em apenas cinco animais, sendo possível de quantificar em apenas três animais, sendo dois tumores epiteliais e outro mesenquimal, diferentemente dos resultados de Gamblin et al. (1997) que observaram superexpressão deste anticorpo em adenocarcinomas nasais. Este resultado pode estar relacionado com a fixação do tecido ou baixo índice de apoptose nas células das amostras avaliadas. Neste estudo não foi possível correlacionar estatisticamente os resultados da expressão do p53 com o tempo de sobrevida e remissão da afecção.
Apesar da existência de inúmeros estudos sobre as expressões de marcadores, na espécie humana, os resultados relacionados com o prognóstico e a utilização de terapias dirigidas sob a expressão de marcadores, ainda permanece controverso. Na Medicina Veterinária, as pesquisas ainda são escassas, mas com o aumento da expectativa dos animais e o avanço da especialidade oncológica, a necessidade de desenvolvimento de mais pesquisas vem aumentando, sendo cada vez mais importante a investigação de indicadores que possam colaborar com novas terapias. No entanto, se na espécie humana, o comportamento tumoral é distinto em vários processos e desigual em várias de suas interações, o desafio é ainda maior no âmbito veterinário, por abranger um número maior de espécies, e dentro das espécies inúmeras raças.
Os resultados do presente estudo revelaram-se promissores no sentido em que demonstraram a expressão dos marcadores VEGF, EGFR, COX-2, Ki67, PCNA e p53 nos tumores epiteliais e mesenquimais de cavidade nasal e seios paranasais, inclusive resultados significativos quanto ao tempo de sobrevida e tempo de
remissão como indicadores de prognóstico. Em relação as manifestações clínicas, outro dado importante referente a sobrevida e remissão, do qual foi principalmente a presença de epistaxe, epífora e deformidade facial. Os resultados também foram promissores quanto a rinoscopia e o emprego do exame tomográfico, inclusive a utilização do estadiamento (ADAMS et al., 2009), modificado por nós, que