BIOTEC 2003, X congresso nacional de biotecnologia da Sociedade Portuguesa de Biotecnologia, Lisboa 6,7,8 de dezembro de 2003, “Purification of a Laccase Extract by
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Capítulo 3
Espetroscopia
Atómica
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3. Espetroscopia atómica
3.1. Fundamentos teóricos
O termo espetroscopia designa o estudo da interação entre uma radiação eletromagnética e a matéria. Ela é de diferentes tipos consoante o comprimento de onda (cdo) utilizado, que pode ir desde os raios gama (os mais energéticos) até às ondas de rádio (as menos energéticas).
Sabendo que o átomo de um elemento é caracterizado pelo conjunto dos seus níveis de energia, isto é, pelas diferentes energias que ele é suscetível de adotar, E1, E2, E3, E4… etc., onde E1 corresponde à energia mínima do átomo, estado fundamental, cuja energia é zero por definição. E2, E3, E4, representam os estados excitados do átomo, correspondentes a energias superiores. Quando um átomo passa do estado fundamental para o estado excitado traduz-se fisicamente pela mudança de orbital de um eletrão externo, observa-se uma variação na energia do átomo, tal como se mostra na Figura 3.1.
Figura 3.1.Níveis energéticos de Hg.
Os níveis de energia representados na Figura 3.1 correspondem aos do átomo de mercúrio (Hg) e estão expressos em eletrão-volt (eV). Se a energia for maior ou igual a 10,4 eV, observa-se a ionização do átomo, verificando-se uma variação de velocidade do eletrão (energia cinética) não quantificada.
Outro fenómeno que se pode observar é a emissão: Consideremos um átomo livre M, representado pelos seus níveis de energia E1, E2, E3,….En, que se encontre, por uma razão qualquer, no estado excitado (choque entre átomos devido à energia térmica ou outra), por exemplo E2. Ao fim de cerca de 10-8 segundos (este tempo é diferente de elemento para elemento e da transição em causa), o átomo regressa ao estado fundamental E1, libertando a
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energia excedentária sob a forma de um fotão de energia, h, equação (3.1) onde h é a constante de Plank (6,626∙10-34 J∙s) e é a frequência.
E2 – E1 = h (3.1)
Este fotão é caracterizado, do ponto de vista espetroscópico, pela sua frequência, , ou pelo seu comprimento de onda, λ ( = C / ), C é a velocidade da luz no vazio (aproximadamente 3∙105 Km∙s-1), dependendo só de E1 e E2, característicos do elemento M. Entre os diferentes estados de energia, existe um determinado números de transições possíveis, de onde resulta um conjunto de fotões específicos do átomo, que formam o seu espetro característico. Esse espetro é único para um determinado elemento M, o que permite a sua identificação sem ambiguidade.
Suponhamos agora que o átomo excitado de uma amostra emite um fotão, tal como representado na Figura 3.2.
Figura 3.2. Emissão de um fotão.
Poderá este fotão interagir com os outros átomos da amostra? Podemos ter três casos distintos, que se encontram resumidos nas Figuras 3.3 (a) (b) e (c).
21 Há emissão de um fotão de energia h= E2 –E1
Figura 3.3 (b). Fenômeno não absorção. A energia do fotão emitido é inferior à necessária para excitar o átomo. h < E2 – E1
Figura 3.3 (c). Fenômeno de não absorção. A energia do fotão emitido é superior à necessária para excitar o átomo. h E2 – E1
Figura 3.3.(d). Fenômeno de absorção.
Fig.3 a: Fenómeno de emissão
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A energia do fotão emitido é igual à necessária para excitar o átomo, o fotão é absorvido, h = E2 – E1.
O átomo pode absorver radiação luminosa, ou seja um fotão de energia, h, se ele for da mesma natureza que o átomo que o emitiu. É radiação ou transição de ressonância. Na maioria dos casos, são transições eletrónicas entre o estado fundamental e os primeiros níveis de excitação (E1, E2).
A espetroscopia atómica estuda a emissão ou absorção de luz pelo átomo livre, isto é, o átomo vê a sua energia mudar quando um dos seus eletrões passa de uma orbital para outra orbital eletrónica.
Normalmente, só são intervenientes os eletrões externos do átomo, se as energias em jogo forem moderadas, como é o caso das chamas utilizadas (alguns átomos são, no entanto, ionizados). Se as energias são elevadas, serão os eletrões internos os intervenientes e teremos a formação de Raios X.
As principais técnicas que utilizam a espetroscopia atómica são: ● Espetroscopia de emissão de arco/faísca (Qualitativa/quantitativa) ● Espetroscopia atómica de fluorescência
● Espetroscopia atómica de emissão ● Espetroscopia atómica de absorção
Estas últimas três técnicas quantitativas são, na maioria das vezes, utilizadas em conjunto para análises de múltiplos elementos com baixa concentração, enquanto a emissão de arco/faísca, sendo muito sensível, é utilizada sobretudo para efetuar análises qualitativas preliminares. A espetroscopia de emissão de arco/faísca guarda toda a sua importância por ser um ensaio rápido, uma vez que não é necessário passar para solução o elemento a quantificar (dissolução, digestão), podendo funcionar como ensaio preliminar para as técnicas de absorção e de emissão.
No contexto deste trabalho que foca principalmente a determinação de metais (neste caso o ferro) em águas para consumo humano e tendo em conta o tipo de controlo: “controlo de rotina 2” ou “controlo de inspeção”, os metais a quantificar são diferentes assim como as técnicas analíticas a aplicar (Decreto-Lei 306/2007). No “controlo de rotina 2” os únicos metais a determinar são o Fe e o Mn (Al se o tratamento na estação de tratamento de águas, ETA, for com sais desse metal), mas se for um controlo de inspeção aí serão mais metais a
23 determinar e as técnicas a implementar serão forçosamente outras. Para os seguintes metais do controlo de inspeção: antimónio, arsénio, boro, cadmio, cálcio, chumbo, cobre, crómio, magnésio, mercúrio, níquel, selénio recorremos à Flame Atomic Absorption spectroscopy
(FAAS) para os metais alcalinos e alcalinoterrosos recorre-se à Flame Atomic Emission spectroscopy (FAES) para alguns metais de transição utilizamos a Graphite Furnace Atomic Absorption Spectroscopy (GFAAS) e a Hydride Generation Atomic Absorption Spectroscopy (HGAAS) para o mercúrio.
Na espetrometria de emissão atómica por chama (FAES) em termos instrumentais a única diferença em relação à espetrometria absorção atómica com chama (FAAS) é que a lâmpada de cátodo oco (HCL) ou a de descarga elétrica é retirada sendo a própria chama a fonte de emissão.
Na espetrometria de absorção atómica com camara de grafite (GFAAS) a chama é substituída por uma camara de grafite aquecida eletricamente. A espetrometria de absorção atómica por geração de hidretos envolve uma reação química de acidificação da amostra em meio redutor (boro hidreto de sódio) para gerar um hidreto volátil do metal a determinar. O hidreto do metal é transportado por um gás inerte (árgon) para um tubo de quartzo aquecido por um forno, onde é convertido em átomos gasosos do metal (Perkin Elmer). Os principais metais determinados por esta técnica são: As, Bi, Hg, Sb, Se, Sn e Te.
3.2. Espetroscopia atómica de emissão
3.2.1 Espetroscopia atómica de emissão de chama
Na espetrometria de emissão de chama (ou de chama de emissão) a solução contendo o metal a analisar é aspirada para a chama onde uma pequena percentagem de átomos do metal é excitada à custa da energia térmica proveniente da chama. Quando regressam ao estado fundamental emitem uma radiação característica do metal de acordo com a equação (3.1). A risca mais intensa é, em cada caso, resultante da transição entre o nível excitado de mais baixa energia e o estado fundamental, geralmente chamada risca de ressonância. É este tipo de transição que dá origem as riscas características de alguns metais como a risca vermelha do lítio a 671 nm, o dupleto amarelo do sódio a 590 nm, o dupleto vermelho do potássio a 767-769 e ao singleto azul do cálcio a 422,7 nm. Por exemplo para os metais alcalinos, como o sódio, com uma chama com temperatura de 2600 K, o número de átomos no estado fundamental é de 99,98 %. Através da equação de Boltzmann, equação (3.2)
24 onde
N1 e N0 representam a população eletrónica no nível excitado e no nível fundamental, respetivamente.
g1 e g0 representam os pesos estatísticos respetivos T é a temperatura absoluta.
K é a constante de Boltzmann (1,381x10-23 J·K-1).
ΔE é a diferença de energia entre dois níveis de energia consecutivos. Verifica-se que para o estado de excitação mais baixo do átomo de sódio,
ΔE= E1-E0 = 3,371∙10-19 J/átomo Então temos:
(3.3)
O que representa menos de 0,02% de átomos no estado excitado.
Se a temperatura for, por exemplo, 2610 K a fração de átomos excitados será:
(3.4)
A fração de átomos excitados continua a ser <0,02%, mas aumentou para 100 (1,74 – 1,67) /1,67 = 4 %.
Verifica-se que uma variação de temperatura de 10 K não afeta significativamente a população de átomos no estado fundamental e consequentemente não afeta o sinal correspondente à absorção atómica. Tem, contudo, extrema importância no fenómeno de emissão que depende da população no estado excitado. Um aumento de 4% faz subir o sinal na mesma proporção, o que torna crítica a estabilidade da chama em emissão. As interferências são muitas tanto a nível espetral como químicas. A emissão de fundo depende muito do tipo de chama utilizada e da razão combustível/comburente. A espetrometria de emissão de chama é principalmente utilizada para os metais alcalinos e alcalino terrosos, onde é mais sensível.
25 O equipamento de base é o mesmo em emissão e em absorção, só muda a fonte de energia, em emissão é a própria chama e em absorção é uma lâmpada de cátodo oco (HCL) ou a lâmpada de descarga sem elétrodo (EDL).
3.2.2. Espetroscopia atómica de emissão com plasma acoplado
indutivamente
Um plasma é uma mistura gasosa condutora de eletricidade, parcialmente ionizado a alta temperatura e que contém uma concentração significativa de catiões e eletrões.
Na espetroscopia de emissão com plasma acoplado indutivamente, temos duas técnicas principais: espetroscopia de emissão com plasma acoplado indutivamente (ICP-AES) e a espetroscopia de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS). A diferença fundamental entre estas duas técnicas, consiste, respetivamente, na substituição de um espetrómetro ótico que mede a emissão de radiação eletromagnética (I = k C), onde I é a intensidade do sinal, k é uma constante e C é a concentração. Um espetrómetro de massa mede a relação massa/carga (m/z) dos elementos conseguindo até distinguir a variação isotópica desses elementos. Isto permite atingir limites de deteção e quantificação muito maiores, parte por trilião (ppt), conforme está registado na tabela 3.2 no fim deste capítulo Em espetrometria atómica o analito é atomizado numa chama, forno aquecido eletricamente ou plasma. A chama foi utilizada durante várias décadas e continua a ser utilizada, principalmente em laboratórios de ensino, mas progressivamente tem dado lugar ao forno aquecido eletricamente ou ultimamente ao plasma. O plasma acoplado indutivamente permite uma chama com uma temperatura, na zona de trabalho, duas vezes mais elevada que a chama de ar/acetileno. A alta temperatura do plasma, a sua estabilidade e atmosfera inerte de Árgon permite eliminar a maioria das interferências químicas encontradas numa chama (Harris). Uma das suas maiores vantagens é a possibilidade de fazer simultaneamente uma análise multielementar. A espetroscopia de emissão com plasma tem vindo a substituir gradualmente a FAAS. O seu principal inconveniente é ainda o preço alto do equipamento, embora tenha vindo a diminuir e só é rentabilizado com um grande número de análises. A utilização do equipamento tem também um grau de complexidade maior, o que requer uma maior habilidade do utilizador.
Em espetrometria de emissão com plasma acoplado indutivamente as amostras são introduzidas no fluxo de árgon através de um nebulizador.
A atomização ocorre a temperaturas elevadas, o que causa menos interferências químicas e o efeito de ionização devido ao excesso de eletrões que proveem da ionização do árgon é
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diminuto. A atomização ocorre num meio quimicamente inerte, o que permite aumentar o tempo de vida do analito, e impede a formação de óxidos aumentando assim a sinal analítico. O plasma é praticamente livre de radiação de fundo na zona de trabalho que se situa 15 a 35 mm acima da bobine de rádio frequência, RF. A temperatura é mais uniforme o que leva a que a auto absorção seja diminuta. A análise multielementar permite fazer até 70 elementos em simultâneo. Um dos inconvenientes maiores são as interferências espetrais devido á complexidade dos espetros de emissão e sobre posição de riscas espetrais de diferentes elementos.
27 Figura 3.6. Exemplo de espetro de massa.
Podemos ver a versatilidade da espetrometria de emissão com plasma acoplado indutivamente pelo número de elementos que permite detetar, e concluir que de fato só o preço elevado do equipamento e os custos associados ao seu funcionamento, principalmente árgon com um caudal de 5-20 L/min) não permite uma maior utilização do mesmo.
Figura 3.7. Elementos analisáveis por ICP-MS e limites de deteção.
Na espetroscopia atómica de emissão não existe uma fonte externa de energia é a própria chama ou plasma (faísca, arco elétrico) que fornece a energia necessária para o processo de
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emissão. Divide-se em dois tipos principais, emissão de chama e emissão de plasma acoplado indutivamente.
3.4. Espetroscopia atómica de absorção
3.4.1. Espetroscopia atómica de fluorescência
A espetroscopia de fluorescência atómica (AFS) é amplamente utilizada com a geração de hidretos. Este acoplamento constitui uma técnica analítica de relativa simplicidade e baixo custo comparativamente às outras técnicas da espetroscopia atómica. A AFS oferece grandes vantagens em termos de linearidade e níveis de deteção, isto devido principalmente à qualidade das lâmpadas utilizadas como fonte de excitação, o que permite um melhoramento importante do sinal. As limitações como o espalhamento e a emissão de fundo (background) dependem muito das impurezas da amostra. A deteção por AFS acoplada à geração de hidretos é equivalente à geração de hidretos com camara de grafite em termos de sensibilidade e especificidade, mas com custos reduzidos (HG-ETAAS) (Sanchez-Rodas et al). Muitos dos elementos geradores de hidretos podem ser detetados e quantificados por AFS na região do ultravioleta longínquo a 259 nm, o que é muito importante devido ao baixo valor da emissão de fundo nesta região espetral, quando uma chama fria e de baixa energia é utilizada. Para obter bons resultados ou seja, um baixo limite de deteção, é necessário uma fonte de excitação de alta intensidade sendo atualmente possível com lâmpadas do tipo
boosted discharge hallow cathode lamp, (BDHCL). A elevada sensibilidade e precisão da AFS
permite saltar etapas de pré concentração utilizadas para a AAS. Esta técnica juntamente com um sistema de Flow Injection Atomic Spectroscopy (FIAS) permite um desempenho elevado do laboratório de análises de águas assim como o processamento de um elevado número de amostras (Morena-Pineiro et al). É uma técnica de análise elementar que envolve o uso de uma fonte de radiação com comprimento de onda característico para excitar átomos livres na forma de vapor. A excitação dos átomos do analito é seguida por um processo de relaxamento, que envolve a emissão de radiação de fluorescência de comprimento de onda igual ao fornecido pela fonte, portanto a energia emitida como radiação fluorescente pela amostra é proporcional à radiação ressonante absorvida. Na espectrometria de fluorescência atómica com geração de hidretos, o atomizador utilizado na decomposição do hidreto é uma chama de difusão, rica em radicais H que atua facilitando o processo de atomização dos hidretos. A instrumentação básica de um AFS é semelhante à de AAS e AES, exceto a fonte de luz e o detetor que são colocados em ângulo reto, como mostra a figura 3.8.
29 Figura 3.8. Representação esquemática do equipamento de fluorescência atómica.
Devido a sua sensibilidade e seletividade a AFS é muito utilizada em análises ambientais, biológicas e da área da medicina, para determinar elementos importantes nestas áreas, tais como: Hg, As, Se, Sb, Bi, Te, Pb e Cd.
As principais interferências encontradas em AFS são principalmente espetrais e químicas, tais como as observadas em AAS. Com a evolução tecnológica das últimas décadas e o desenvolvimento da radiação laser surgiu a laser induced fluorescence (LIF) que permite atingir valores da ordem do “ato” grama (10-18 g) (Cai Y.).
3.4.2. Espetroscopia atómica de absorção com geração de hidretos
Com início na revolução industrial de fim do seculo XIX, mas com um desenvolvimento exponencial nos pós II Guerra Mundial, nos pais desenvolvidos, a poluição tem vindo a ser cada vez mais intensa devido às diversas atividades humanas. Grandes quantidades de produtos químicos perigosos são despejadas nos diversos ecossistemas, aquático, terrestre e atmosférico, provenientes da indústria, agricultura e mesmo dos resíduos urbanos (Fernandez Z.H. et al). Dentro de uma lista de poluentes muito diversificadas, os metais pesados em quantidades vestigiais ocupam uma posição de destaque devido a sua alta toxicidade mesmo com concentrações baixas e á sua não degradabilidade tanto química como biológica. Estes metais ficam acumulados ao longo dos anos nos seres vivos, entram para a cadeia alimentar, e vão causar doenças graves. Entre outros o Pb, Cd e Hg são considerados cancerígenos pela OMS, provocando doenças pulmonares, renais e até neurológicas no caso do Hg. A existência de normas internacionais, muito rígidas, no que diz respeito à concentração de metais pesados nos diversos ecossistemas, fizeram com que fossem desenvolvidas técnicas analíticas de grande sensibilidade que permitem quantificar com muito rigor esses metais. É neste contesto que se enquadra o desenvolvimento da “Hydride Generation Atomic Absorption
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Specroscopy”, HG-AAS, e da sua variante para a determinação do Hg a “Cold Vapor Atomic Absorption Spectroscopy”, CV-AAS.
A geração química de vapor é uma técnica analítica bastante sensível na qual os analitos são vaporizados sob a forma de átomos ou moléculas gasosas através de uma reação química, geralmente a temperatura ambiente, com posterior transporte desses vapores por um gás vetor para o local onde ocorre a atomização e quantificação. Há a considerar 2 métodos: - A Geração de Hidretos (HG) para determinação de elementos tais como, As, Bi, Pb, Sb, Se, Te, Hg e Sn.
- Vapor Frio (CV) para determinação do Hg por ser um metal cuja tenção de vapor é extremamente alta à temperatura ambiente.
A técnica de HG envolve uma reação química entre a amostra acidificada que contém o metal a analisar e um agente redutor, sendo o mais utilizado o borohidreto de sódio, NaBH4. O borohidreto reage em meio ácido gerando um hidreto metálico volátil conforme a reação:
(3.5)
(3.6)
E é o analito e m e m+ representam o metal na sua forma respetiva.
O hidreto formado na reação é transportado para uma célula de quartzo por um gás vetor que geralmente é o árgon. Na célula o hidreto é atomizado e transformado num átomo gasoso. Acredita-se que a atomização do hidreto ocorre por colisão com o radical livre do hidrogénio. Na célula os átomos do analito vão absorver a radiação monocromática proveniente da fonte HCL ou EDL, proporcionalmente a sua quantidade o que permite a respetiva quantificação. Há que ter o cuidado de a solução redutora ser preparada de fresco para ter toda a sua reatividade, e os reagentes utilizados serem de pureza elevada por estarmos a determinar quantidades vestigiais. Normalmente esta técnica está associada a um sistema de injeção em fluxo (FIAS) o que permite a sua automatização.
31 Figura 3.9. Representação de um sistema de injeção em fluxo (FIAS).
A mistura da solução acidificada da amostra com o redutor vai para um separador gás/líquido, sendo importante controlar rigorosamente o caudal do gás transportador assim como o nível do líquido no separador para não perdermos amostra para o dreno. Este processo de geração de vapor apresenta algumas vantagens: o vapor formado é homogéneo o que permite a separação do analito a partir da matriz da amostra e pode ser acoplada a diferentes técnicas (AAS, ICP-MS, ICP-OES). Os inconvenientes são: a primeira etapa é uma reação química sujeita a interferências, o estado de oxidação e forma do analito são críticos, o pH e concentração podem ser críticos e os concomitantes da solução podem impedir a geração de hidretos e liberação do vapor. Existe ainda uma outra técnica específica para o Hg que consiste na formação de uma amálgama do mercúrio numa uma rede de ouro ou platina e a sua posterior libertação para a célula de quartzo.