A velocidade de sedimentação eritrocitária (VS) reflete a presença de uma resposta inespecífica do organismo a uma agressão, embora seja útil para auxiliar e identificar um processo inflamatório, infecioso ou neoplásico, avaliar a extensão e atividade da doença, bem como a resposta à terapêutica. Um resultado normal não exclui a existência de doença [104].
A VS é definida pela distância, em milímetros, que os RBC percorrem por ação da gravidade num determinado período de tempo, geralmente 1h [104].
Na presença de doença inflamatória verifica-se o aumento de proteínas de fase aguda no plasma, nomeadamente do fibrinogénio. Como possuem carga positiva são atraídas para a superfície dos RBC, neutralizando as cargas repulsivas. Deste modo, os eritrócitos tendem a agregar-se com formação de rouleaux, aumentando a massa celular o que consequentemente leva ao aumento da VS. No entanto, patologias que levam a anomalias na forma dos eritrócitos levam à diminuição da VS, por interferir com a formação de rouleaux. Na insuficiência hepática e cardíaca, no uso de anti-inflamatórios e na hipofibrinogenémia, a VS está diminuída por dificuldade de agregação celular [104].
Por outro lado, em situações de anemia, leucemia, policitémia, no decurso de neoplasias malignas, bem como nos recém-nascidos, a VS está aumentada, por diminuição das forças repulsivas que mantêm as células em suspensão [104].
No laboratório, a medição da VS é feita num equipamento automatizado: Equipamento: Alifax Test 1 THL (Figura 15)
Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3. Método: Fotometria capilar de fluxo.
O sangue é aspirado para um capilar o qual é centrifugado a 20g, a uma temperatura de 37ºC e a leitura é feita por fotometria de infravermelhos a 950nm. Os impulsos elétricos captados por um detetor de fotodíodos estão diretamente relacionados com a concentração de eritrócitos no capilar. O número de impulsos medidos, por metade do tempo, é usado para delinear a curva de sedimentação para cada amostra. Estes valores são depois convertidos para valores comparados ao Método de Westergreen (método de referência) [105].
Valores de Referência: 0 - 20mm/h.
8.2. Hemoglobina Glicada
O doseamento da hemoglobina glicosilada ou glicada (HbA1c) é um indicador de grande
utilidade clínica, principalmente nos doentes diabéticos, pois permite obter uma retrospetiva dos níveis médios de glicémia dos últimos 120 dias [106]. O seu doseamento é efetuado na seção
de hematologia por uma questão de logística do próprio Serviço de Patologia Clínca.
A HbA1c resulta de uma reação não enzimática, lenta e irreversível (glicação), que
ocorre entre a glucose que circula no sangue e os grupos amina livres existentes na hemoglobina A (HbA) dos eritrócitos. Esta reação varia em função da concentração da glucose a que os eritrócitos são expostos, ao longo do seu tempo de vida [106, 107]. As vantagens do seu doseamento
prendem-se como facto de [107]:
Os indivíduos não necessitarem de estar em jejum para efetuar a colheita, podendo ser feita a qualquer hora do dia;
Refletir a concentração de glucose no sangue dos últimos 3-4 meses;
A sua concentração predizer o desenvolvimento de complicações microvasculares da diabetes;
Orientar o tratamento.
Tem como desvantagens a possibilidade de o resultado ser falseado pela presença de hemoglobinopatias ou outras doenças que alterem o tempo de vida dos eritrócitos [107].
Equipamento: Arkray AdamsTM A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics (Figura 16)
Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3.
Método: Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC, do inglês High Performance
Liquid Chromatography).
Esta metodologia utiliza uma coluna composta por uma resina de troca catiónico de fase
reversa. As hemoglobinas (Hb), carregadas positivamente, são separadas nas diferentes componentes através da adsorção na fase estacionária (carregada negativamente), presente na coluna cromatográfica, sendo posteriormente eluída pela fase móvel [108].
A identificação das diferentes hemoglobinas baseia-se na análise dos tempos de retenção da amostra em relação aos controlos e a deteção é feita pela determinação da absorvência a 415 e 500nm. Podendo assim obter-se as seguintes frações: HbA1c, HbA1, HbF, HbA2 e hemoglobinas variantes. A HbE pode sobrepor-se à HbA2. Este aparelho é capaz de diluir,
hemolisar e remover a base de Schiff (resultado da reação responsável pela formação da hemoglobina glicosilada) automaticamente [108].
Para quantificar a hemoglobina, basta calcular a área abaixo do pico [108].
Valores de Referência: 4-6%
8.3. Eletroforese das Hemoglobinas
A hemoglobina é o principal constituinte do eritrócito e tem como principal função o transporte de oxigénio e dióxido de carbono. É uma proteína globular com estrutura tetramérica, constituída por dois pares de subunidades polipeptídicas, designadas de globinas. Cada cadeia de globina encontra-se ligada a um grupo prostético - o heme, cada um contendo um átomo de ferro, ao qual se liga o oxigénio, se se apresentar na forma ferrosa (Fe2+) [109].
Ao longo do desenvolvimento são sintetizadas quantidades variáveis de vários tipos de hemoglobina até à altura em que o seu padrão de síntese é praticamente igual ao do adulto (Figura 17) [96].
As hemoglobinopatias são doenças hereditárias caracterizadas por mutações dos genes das globinas, levando a alterações quantitativas da síntese de alguma das cadeias de globina (talassémias) ou à síntese de uma globina estruturalmente diferente - alteração qualitativa - levando à formação de uma hemoglobina anómala, comprometendo a sua função vital [111].
Figura 17. Representação esquemática da percentagem da produção de diversos tipos de hemoglobinas desde o inicio da gestação até à idade adulta [110].
Equipamento: HYDRASYS, da Sebia (Figura 18)
Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3.
Método: Eletroforese das hemoglobinas em pH alcalino (pH 8.0-9.0) e coloração com solução de negro de amido, sendo o excesso de corante eliminado com uma solução ácida [112]. A estrutura espacial da Hb e outras propriedades moleculares dependem da sua natureza e da sequência de aminoácidos que formem as cadeias. Uma mutação, que leva à substituição de aminácidos, é responsável pelo aparecimento de variantes de Hb que possuem diferentes cargas superficiais e consequentemente diferentes mobilidades eletroforéticas, dependendo do pH, força iónica do tampão e da natureza do suporte [112].
Hemoglobinas embrionárias Hb Gower 1 ζ2ε2 Hb Gower 2 α2ε2 Hb Portland ζ2γ2 Hb Fetal α2γ2 Hb adulto α2β2 α2δ2
As eletroforeses são executadas a partir do hemolisado dos eritrócitos e a separação eletroforética ocorre em gel de agarose. As hemoglobinas, carregadas negativamente, quando submetidas a um campo elétrico irão migrar em direção ao polo positivo. Posteriormente, são analisadas visualmente e avaliadas por densitometria, o que permite obter uma quantificação relativa e precisa das diferentes hemoglobinas presentes no sangue periférico. Este método permite separar e identificar hemoglobinas normais e as principiais hemoglobinas anómalas: HbS ou HbD e HbE ou HbC (Figura 19) [112].
HbS: substituição do ácido glutâmico na posição 6 da cadeia β por uma valina. HbC: substituição do ácido glutâmico na posição 6 da cadeia β por uma lisina. HbE: substituição do ácido glutâmico na posição 26 da cadeia β por uma lisina. HbD: substituição do ácido glutâmico na posição 121 da cadeia β por uma glutamina.
Valores de Referência: Adulto - HbA1≥ 96.5%; HbA2 ≤ 3.5% e HbF ≤ 2.0%
8.4. Hemostase
A hemostase é um processo fisiológico complexo que permite preservar a normal funcionalidade da circulação sanguínea, tendo um papel importante na manutenção da integridade vascular e fluidez do sangue [113].
Figura 19. Migração, em pH alcalino, das hemoglobinas normais à esquerda e as variantes mais frequentes à direita.
+
-
MigraçãoO sistema hemostático engloba cinco componentes fundamentais, os vasos sanguíneos, plaquetas, que devem ser normais em número e funcionalmente, fatores plasmáticos, seus inibidores e o sistema fibrinolítico [113].
Após uma lesão vascular ocorre uma vasoconstrição local e a exposição ao colagénio conduz à adesão e agregação plaquetária, com formação de um trombo plaquetário, e à ativação da cascata da coagulação - hemostase primária [113].
Na hemostase secundária, segundo o modelo clássico14, existem 2 vias distintas que convergem para uma via comum, com formação do coágulo de fibrina. A via intrínseca é ativada quando o quininogénio de alto peso molecular, a pré-calicreína e o fator XII entram em contacto com a superfície dos fosfolípidos das plaquetas ativadas (carga negativa), enquanto que a via extrínseca é ativada pelo fator tissular, sendo a sua expressão induzida, na superfície das células, pela lesão dos tecidos e citocinas inflamatórias (Figura 20) [113].
Toda a cascata da coagulação é regulada por vários mecanismos inibidores, que têm por objetivo limitar a extensão e a disseminação do processo da coagulação, sendo de destacar o sistema da proteína C/proteína S, a antitrombina e o inibidor do fator tissular [113].
14Foi proposto um novo conceito para a cascata da coagulação, que começa a ser cada vez mais evidente a existência de apenas
uma via para a formação do trombo de fibrina.
Figura 20. Cascata da coagulação [114].
Ambas as vias intrínseca e extrínseca convergem na ativação do fator X, que juntamente com o fator V ativado, Ca2+ e fosfolípidos irão converter o fator II a
trombina, desencadeando a formação do coágulo de fibrina. O feedback positivo amplifica o sinal, no entanto um feedback negativo promove a ativação de vários mecanismos anticoagulantes, com a inibição de diversos fatores procoagulantes pela antitrombina, inibição do complexo TF/FVIIa/FXa pelo inibidor da via do fator tissular, e inativação proteolítica do FVa e FVIIIa pela proteína C ativada. A trombina, aPC e outras proteases de coagulação regulam a inflamação e a remodelação do tecido.
TF: fator tissular (do inglês tissue factor); a: ativado; F: fator; AT: Antitrombina; TFPI: inibidor da via do fator tissular (do inglês tissue factor pathway
Por fim, segue-se a fibrinólise (hemostase terciária), importante para restaurar a integridade do vaso, sendo mediada pelo ativador do plasminogénio tissular (t-PA) que converte o plasminogénio em plasmina, que por sua vez, degrada a fibrina, podendo ser inativada pela α2-antiplasmina (α2-AP). A fibrinólise é bloqueada pelo inibidor do ativador do plasminogénio (PAI-1), produzido essencialmente pelas células endoteliais (Figura 21) [113].
É necessário que haja um equilíbrio constante entre a coagulação e a fibrinólise, tanto que uma potencial disfunção em qualquer uma das etapas pode levar ao aparecimento de hemorragias ou tromboses, sendo por isso muito importante a avaliação laboratorial da hemostase. Testes específicos devem ser efetuados sempre que se verifiquem alterações nos testes de rastreio, e são necessários para determinar a natureza do defeito.
Equipamento: STA Compact Max® (Figura 22)
Figura 21. Sistema fibrinolítico e inibidores da fibrinólise [115].
PDF: Produtos de degradação da fibrina; PAI-1: inibidor do ativador do plasminogénio, t-PA: ativador do plasminogénio tecidual; u-PA: urocinase; α2-AP: α2-antiplasmina.
Amostra: Plasma citratado, obtido por centrifugação de sangue total colhido para tubo com anticoagulante citrato trissódico 0,109M, a 1500rpm, 10 minutos. Para pedidos de coagulação especiais tem de se proceder a uma dupla centrifugação da amostra para se obter plasma pobre em plaquetas. A contagem de plaquetas é efetuada no equipamento dos hemogramas, sendo que apenas se processam os plasmas que apresentarem um valor de plaquetas inferior a 5x109/L; se o valor obtido for superior procede-se a uma nova centrifugação.
O STA Compact Max® é concebido para auxiliar no diagnóstico de distúrbios hemostáticos ou na monitorização da terapêutica anticoagulante. Possui 2 tecnologias fundamentais: o princípio de medição por cronometria e o princípio de medição por fotometria
[116].
O princípio de medição por cronometria consiste na deteção mecânica do coágulo, em que se mede a variação da amplitude de oscilação da esfera, através de sensores indutivos. Cada cuvete de reação possui uma esfera metálica que apresenta um movimento pendular obtido graças a um campo eletromagnético alternativo criado por 2 bobinas independentes. À medida que a viscosidade aumenta, devido à formação do coágulo de fibrina, a amplitude de oscilação diminui, sendo medido o tempo, em segundos, que o coágulo demora a formar-se (Figura 23)
[116].
O princípio de medição por fotometria é o principio de deteção das análises cromogénicas (reacção enzimática) ou imunoturbidimétricas. Baseia-se na determinação da absorvência (densidade ótica) de uma fonte de luz monocromática (405 ou 540nm) que posteriormente é convertida em concentração, pela aplicação da Lei de Lambert-Beer [116].
No laboratório, diversos parâmetros são determinados para avaliar a hemóstase.