5.5.4.1. Amplificação por nested-PCR do gene -giardina.
A vantagem de utilizar genes que codificam a giardina como alvo de detecção molecular de quistos de Giardia, é que estes são considerados exclusivos deste parasita (Cacció et al., 2002). A utilização de um sistema de tipagem baseado na análise da sequência de um único locus, como a - giardina, com elevada heterogeneidade sequencial, possibilita uma resolução tão alta como a tipagem de sequências multilocus (Lalle et al., 2005).
A PCR é um método muito eficaz na amplificação de sequências específicas a partir de uma mistura complexa de DNA. Permite, por exemplo, a amplificação de apenas um locus do genoma completo de um organismo e em pouco tempo, a partir de apenas uma cadeia molde, é possível obter mais de um bilião de cópias. No entanto, a capacidade de amplificar mais de um bilião de cópias também aumenta a possibilidade de amplificação de uma sequência não pretendida de DNA, mais de um bilião de vezes. A especificidade da PCR é determinada pela especificidade dos primers
utilizados na reacção. Se os primers se ligarem a mais do que um locus, no produto de PCR, aparecerão amplicões de diferentes tamanhos. Para minimizar esta possibilidade e assegurar a especificidade, usam-se frequentemente dois pares de primers, em duas fases de amplificação –
nested-PCR.
A designação nested deriva do facto de se utilizarem dois pares de primers na amplificação de um único locus: o primeiro par é usado na primeira fase desta técnica, que decorre como qualquer PCR de uma só fase; o segundo par (nested primers) liga-se aos fragmentos amplificados na primeira parte, resultando desta, amplicões de menor tamanho. A mais valia desta técnica, é que se ocorrer um erro e for amplificada uma sequência não pretendida, a probabilidade de tal voltar a acontecer, na segunda fase de amplificação, com o segundo par de primers, é muito baixa.
Os primers utilizados nas duas fases deste procedimento diferem no seu tamanho e sequência e encontram-se caracterizados no Quadro 5.
Quadro 5 – Características dos primers usados nas duas etapas de nested-PCR.
Designação do primer
Sequência nucleotídica Dimensão do amplicão (pb) Referência GIAFW1 GIARV1 5´-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3´ 5´-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3´ 753 Cacciò et al., 2002 GIAFW2 GIARV2 5´- GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3´ 5´- CTCGACGAGCTTCGTGTT-3´ 511 Lalle et al., 2005
As reacções de PCR foram optimizadas em relação às descritas por Lalle et al. (2005), através de ajustes na concentração de cloreto de magnésio e na quantidade de DNA utilizada. A preparação das misturas reaccionais, decorre numa câmara de segurança biológica, com material antecipadamente esterelizado com radiação UV e mantendo sempre os tubos no gelo.
O procedimento de amplificação -giardinafoi efectuado num volume de 50 l, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 l de 10⋅ tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM
Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura
de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 10 pmol de cada oligonucleótido iniciador (MWG Biotech), 0,02 mg de albumina do soro bovino ou BSA (sigla anglosaxónica para “bovine serum albumin”) (Sigma-Aldrich), 1,5 U de BiotaqΤΜ
DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 l de DNA genómico e água desionizada estéril, para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 3 l do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira.
Para cada uma das reacções, foi preparado um tubo de controlo negativo, no qual o DNA da amostra foi substitituido por água esterilizada, com vista à detecção de contaminações e um tubo de controlo positivo, em que a amostra foi substituída por DNA da espécie a pesquisar, de forma a testar o termociclador e os componentes da mistura reaccional. Os tubos de PCR foram colocados no termociclador e submetidos às condições térmicas de amplificação referidas no Quadro 6, tendo o passo de desnaturação inicial de dez minutos a 95ºC e o de extensão final de dez minutos a 72ºC.
Quadro 6 – Condições térmicas de amplificação por nested-PCR do gene da -giardina.
Procedimento Condições de amplificação Nº de Ciclos
-giardina
Desnaturação 95ºC, 45 seg. Ligação 49ºC, 45 seg Extensão 72ºC, 60 seg
35
Os produtos amplificados foram separados electroforeticamente em gel de agarose a 2%. As migrações electroforéticas decorreram a 80V durante 90 minutos, em tampão de corrida TAE 1x. o gel foi visualizado e fotografado (UV=246nm) sob luz ultravioleta, num transiluminador adequado (Vilbert Lourmat).
5.5.4.2. Amplificação por nested-PCR do gene SSU rRNA.
Para amplificação do fragmento da subunidade menor (SSU) do gene do rRNA ribossómico foi utilizada a técnica de nested-PCR com os seguintes primers caracterizados no Quadro 7.
Quadro 7 – Características dos primers usados nas duas etapas de nested-PCR do gene SSU rRNA.
Designação do primer
Sequência nucleotídica Dimensão do amplicão (pb) Referência CRY1 CRY2 5´-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3´ 5´- CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3´ 1325 Xiao et al., 1999 CRY3 CRY4 5´-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3´ 5´- AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3´ 831 - 838 Xiao et al., 1999
O procedimento de amplificação SSU rRNAfoi efectuado num volume de 50 l, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 l de 10⋅ tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM
Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura
de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 10 pmol de cada oligonucleótido iniciador (MWG Biotech), 0,02 mg de albumina do soro bovino ou BSA (sigla anglosaxónica para “bovine serum albumin”) (Sigma-Aldrich), 1,5 U de BiotaqΤΜ
DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 l de DNA genómico e água desionizada estéril, para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 3 l do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da BSA, que foi excluída. Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA, em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como controlo positivo da mistura reaccional, e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação, por DNA exógeno, onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril.
As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador “T1 Thermocycler” (Biometra), tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de dez minutos a 95ºC e o de
extensão final de dez minutos a 72ºC. No Quadro 8 estão descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos do gene SSU rRNA.
Quadro 8: Condições de amplificação do DNA, para o gene SSU rRNA
Procedimento Condições de amplificação Nº de Ciclos
SSU rRNA
Desnaturação 95ºC, 45 seg. Ligação 55ºC, 45 seg Extensão 72ºC, 60 seg
35
Os produtos amplificados foram separados electroforeticamente em gel de agarose a 2%. As migrações electroforéticas decorreram a 80V durante 90 minutos, em tampão de corrida TAE 1x. o gel foi visualizado e fotografado (UV=246nm) sob luz ultravioleta, num transiluminador adequado (Vilbert Lourmat).
5.5.4.3. Purificação e sequenciação dos fragmentos amplificados por PCR.
Os produtos de amplificação das PCR realizadas para submeter à técnica de sequenciação, foram purificados, através do protocolo comercial (JETQUICK PCR Product Purification Spin kit; Genomed), que permite a remoção rápida de impurezas e de contaminantes de produtos de PCR, após corrida electroforética em gel de agarose. No caso das nested-PCR, foram purificados os produtos da segunda reacção. De acordo com as instruções do fabricante, o referido protocolo consiste em quatro passos definidos: