4. DATAKAPITTEL
4.1 K APITAL - LISTEN
Foram utilizados 12 animais, mestiços Crioulos, de 2 a 5 anos de idade, fêmeas e machos castrados, pesando em média 350 Kg, hígidos e sem histórico de enfermidades locomotoras. Esses animais permaneceram em baias na semana anterior e três semanas posteriores aos procedimentos cirúrgicos, sendo soltos em piquetes nos intervalos das cirurgias. A confirmação do estado de higidez, para a inclusão dos 12 animais, selecionados para o projeto de pesquisa, foi realizada por meio dos exames físicos, laboratoriais e radiográficos. As 24 articulações femoropatelares desses 12 animais foram divididas em quatro grupos (A, B, C e D), cada grupo foi formado por seis articulações, de seis animais. Em todos os grupos, as articulações femoropatelares de ambos os membros pélvicos foram abordadas por cirurgia artroscópica para a realização de um defeito condral e submetidas a tratamento conforme o grupo: Grupo A (Membro Pélvico Esquerdo, MPE dos animais 1, 2, 3, 4, 5 e 6) receberam o tratamento apenas com microfraturas. Grupo B (MPE dos animais 7, 8, 9, 10, 11 e 12) receberam o tratamento com microfraturas associadas ao implante de células tronco mesenquimais (CTM) em gel de plasma rico em plaquetas (PRP). Grupo C (Membro Pélvico Direito, MPD dos animais 7, 8, 9, 10, 11 e 12) receberam o tratamento apenas com o implante de CTM em gel de PRP, e o Grupo D: (MPD dos animais 1, 2, 3, 4, 5 e 6) foram o grupo controle do experimento, sem a aplicação de tratamentos. Essa divisão objetivou evitar o “homing” das células tronco entre os membros.
Indução do defeito condral
O primeiro procedimento artroscópico foi considerado como tempo zero (T0) do experimento, sendo abordados todos os grupos experimentais. A lesão cartilaginosa da tróclea medial do fêmur foi realizada com o animal em decúbito dorsal e a articulação femoropatelar em semiflexão. Foram estabelecidos dois portais, de acordo com técnica descrita por MCILWRAITH (2005) [17]. Para criar a lesão foram utilizadas lâminas abrasivas motorizadas (broca circular Razek 2,9/5,5) e pinças artroscópicas, com desgaste controlado, suficiente para obter a dimensão da lesão condral desejada. As lesões foram padronizadas em aproximadamente 15 mm de diâmetro, mensuradas com
o auxílio do instrumental artroscópico e induzidas retirando a cartilagem hialina e toda a cartilagem calcificada, porém, não havendo abrasão, perfuração ou sangramento do osso subcondral (Figura 01). Ao final da indução do defeito condral em todos os grupos, foram realizados os tratamentos, no mesmo tempo cirúrgico, de acordo com cada grupo experimental. Após as cirurgias, os animais receberam a associação de penicilinas1, com dose calculada pela benzatina, de 30.000 UI/kg intramuscular, totalizando três aplicações a cada 72h; 10.000UI de soro antitetânico2 subcutâneo; 2,2 mg/kg de fenilbutazona3 intravenosa a cada 24h, totalizando três aplicações e curativo local duas vezes ao dia com digluconato de clorexidine4 0,5% em solução alcoólica até a retirada dos pontos, realizada 15 dias após as cirurgias.
Células-tronco
As CTMs foram obtidas e cultivadas a partir do tecido adiposo dos equinos que constituíram os grupos B e C, coletado 40 dias antes de T-0 (Figura 02-A). A extração da fração vascular estromal e o cultivo celular foram realizados segundo técnica descrita para equinos por YAMADA et al. (2012) e CARVALHO et al. (2013) [6, 7]. Nesses animais, o tecido adiposo foi coletado após uma incisão de cinco centímetros na região situada lateralmente à linha média da base cauda. Foi realizada a anestesia local infiltrativa com lidocaína sem vasoconstritor a 2% (Xylestesin – Cristália) e sedação dos animais com xilazina a 10% (Sedomin – Konig), 0,5 mg/kg. Foram colhidos em média 2,5 gramas de tecido adiposo para cada animal. As amostras de tecido adiposo foram submetidas a lavagens sucessivas em meio HEPES5, sendo posteriormente realizada a separação mecânica/enzimática com uma lâmina de bisturi número 24 e ação da colagenase tipo I. A solução foi homogeneizada e levada à estufa a 37o C e 5% de CO2 “overnight”. O material foi filtrado em filtro de 70µm2 e adicionado a um mesmo volume de meio DMEM-Knockout6 com 10% de soro fetal bovino7. O resultante foi centrifugado a 2.000 rpm por 10 minutos, desprezando o sobrenadante e adicionado o meio HEPES. Esse material foi transferido para placas de cultura de 25cm2, permanecendo a 370 C em estufa a 5% de CO
2, em ambiente estéril, sendo manipulado apenas em capela de fluxo laminar. O meio (DMEM- Knockout 10% de soro fetal bovino) foi substituído a cada 48 horas e, havendo confluência de 80%-90% da placa era realizada a passagem (Figura 02-B). A dose mínima utilizada no tratamento foi de 107 células por lesão tratada.
A contagem das células foi realizada em Câmara de Neubauer e a viabilidade média das células no momento da aplicação foi mensurada através da técnica de Azul de Trypan, sendo o resultado da média aritmética da viabilidade de cada garrafa de um mesmo animal, calculado por fórmula matemática. A caracterização das CTMs foi realizada segundo YAMADA et al. (2012) e CARVALHO et al. (2013) [6, 7], sendo executada após a terceira, quarta ou quinta passagem, anteriormente à aplicação dos tratamentos, pela reação antígeno-anticorpo, por citometria de fluxo e marcadores de superfície. Para estas análises foi utilizado o equipamento BD LSR Fortessa (Becton Dickinson. Mountain View, CA, USA) equipado com lasers: azul 488-nm, 100 mW; vermelho 640-nm, 40 mW e violeta 405-nm, 100 mW. As análises de citometria de fluxo foram arquivadas e avaliadas através do software FACSDiva™ software V6,2. Os marcadores positivos utilizados foram: CD908, CD1059 e CD4410. O marcador negativo utilizado foi o MHC CLASS II11. A citometria foi realizada no Centro Diagnóstico e Biotecnologia em Reprodução Animal – CERAN, no Laboratório de Citometria de Fluxo.
Ainda objetivando a caracterização, as CTMs utilizadas no tratamento foram submetidas às diferenciações, com o uso de “kits” comerciais, em tecido cartilaginoso12, ósseo13 e adiposo14, seguindo as instruções do fabricante. Os cultivos resultantes das diferenciações foram corados com Azul de toluidina e Alcian Blue para cartilagem; Alizarin Red para o tecido ósseo; e Oil Red para o tecido adiposo.
Plasma rico em plaquetas
Igualmente para os animais constituintes dos Grupos B e C, o PRP foi processado pelo método de centrifugação dupla, com sangue total coletado em tubo de citrato de sódio a 3,8%15, utilizando o seguinte protocolo: primeira centrifugação a 300g por 5 minutos, segunda centrifugação a 700g por 15 minutos, sendo descartados 75% do plasma sobrenadante apenas após a segunda centrifugação. Foi desprezada a zona de névoa (“Buffy Coat”) e toda a manipulação do plasma foi realizada sob temperatura controlada. O PRP tinha que apresentar uma contagem igual ou maior que 500.000 plaquetas/µL para a viabilidade de utilização, que foi verificado por contagem microscópica em câmara de Neubauer espelhada. Parte do PRP obtido foi destinada para a quantificação do fator de crescimento IGF-1, sem o congelamento da amostra. A quantificação de IGF-1 foi realizada através de teste imunoenzimático utilizando um
“kit” ELISA16 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) comercial, de acordo com as instruções observadas na bula do produto.
Microfraturas
As microfraturas foram realizadas em T0, imediatamente após a indução da lesão condral, nos grupos A e B. Com o auxílio de um perfurador artroscópico foram criadas seis perfurações dentro do defeito condral, com uma profundidade aproximada de 6 mm, mensuradas com o próprio perfurador, e atingindo o osso subcondral. As perfurações foram espaçadas cerca de 3 a 4 mm entre si, sem que houvesse comunicação ou pequenas fraturas entre os pontos de entrada do perfurador.
Tratamento intralesional da associação de CTM em gel de PRP
O implante intralesional das CTMs associadas ao gel de PRP para as articulações dos Grupos B e C foi realizado no mesmo momento artroscópico de T0; imediatamente após a indução da lesão para o Grupo C e após a realização das microfraturas para o Grupo B. Para cada articulação tratada do Grupo B e C, o “pellet” de células tronco mesenquimais autólogas previamente cultivadas (107 células para cada lesão tratada) foi ressuspenso em 4 mL de PRP autólogo previamente processado. No momento da aplicação do implante ao leito receptor foi adicionado para cada 1 mL do composto CTM e PRP (4 mL) 10% de cloreto de cálcio a 10%17 (para ativação do PRP) e 15% de trombina bovina18 reconstituída em água estéril para formação do arcabouço de gel de PRP (coágulo de fibrina). Em fase final de gelificação o composto foi colocado sobre a lesão induzida, com o auxílio de uma agulha 30 x 80, e a distensão articular com CO2 foi mantida até a completa secagem e fixação do gel.
Avaliação macroscópica
Após cinco meses (T150) da indução da lesão e aplicação dos tratamentos foi realizado o segundo procedimento artroscópico, que consistiu no final do experimento. Em T150, foram abordadas novamente todas as articulações para a avaliação macroscópica da cartilagem articular e coleta de amostras do tecido de reparação destinadas ao exame histopatológico, imunoistoquímico e expressão gênica. A avaliação
macroscópica da reparação da cartilagem foi realizada conforme escores estabelecidos pela Sociedade Internacional de Reparação da Cartilagem (ICRS) (Tabela 01) [18, 19]. A pontuação foi realizada através de avaliações cegas, por três avaliadores, em imagens gravadas no procedimento artroscópico realizado para cada lesão, de cada grupo em T150.
Tabela 01: Avaliação macroscópica da reparação da cartilagem segundo a ICRS
Grau de reparação da cartilagem
No mesmo nível da catilagem normal adjacente 4 75% de preenchimento da profundidade 3 50% de preenchimento da profundidade 2 25% de preenchimento da profundidade 1
sem reparação 0
Integração com a borda da lesão
Integração completa 4
Falha de integração menor que 1 mm 3 3/4 do tecido integrado, 1/4 com falha de integração maior que 1 mm 2 1/2 do tecido integrado, 1/2 com falha maior que 1 mm 1 Menos de 1/4 integrado ou nenhuma integração 0
Aparência macroscópica
Superfície intácta e lisa 4
Superfície fibrilada 3
Poucas fissuras e erosões 2
Grandes fissuras e erosões 1
Degeneração da área 0
Avaliação global do reparo
Normal 12
Próximo ao normal 11 a 8
Anormal 7 a 4
Severamente anormal/sem reparo 3 a 1
Avaliação histopatológica
Em T0 e T150, foram coletadas amostras das cartilagens saudáveis e do tecido de reparação de todas as articulações, para estabelecer o padrão normal e comparativo, respectivamente, de cada animal nas análises histopatológicas, imunoistoquímica e de expressão gênica. Em T150, as amostras para as análises histopatológicas foram coletadas na região central do defeito condral de cada lesão sendo imediatamente congeladas em Tissue-Tek® O.C.T™19. Cortes de cinco micrômetros de espessura foram obtidos dos blocos congelados e distendidos em lâminas histológicas. Esses cortes foram corados habitualmente pelos métodos de Hematoxilina-Eosina (H&E) e Azul de Toluidina. A análise das lâminas foi realizada por microscopia óptica, sem o
prévio conhecimento dos grupos a que pertenciam cada lâmina, sendo classificadas em escores tabulados e padronizados pela ICRS, utilizando a pontuação histológica de O’ DRISCOLL (Tabela 02) [18, 19]
Tabela 02: Escore histológico de O’Driscoll (modificado)
Morfologia do tecido
Maioria de cartilagem hialina 4
Maioria de fibrocartilagem 3 Maioria de fibrose 2 Exclusivamente fibrose 1 Coloração da matriz Nenhuma 1 Leve 2 Moderada 3 Intensa 4 Integridade estrutural Desintegração severa 1 Cistos e falhas 2
Sem organização de condrócitos 3
Início da organização colunar de condrócitos 4 Normal, similar à cartilagem normal 5
Agrupamento de condrócitos no local do implante
25-100% de células agrupadas 1
< 25% de células agrupadas 2
sem agrupamentos 3
Avaliação histológica da superfície
Fibrilação severa e erosões 1
Fibrilação moderada e irregularidades 2 Fibrilação discreta e irregularidades 3
Normal 4
Integração lateral do material implantado
Sem integração 1
Integração Parcial 2
Integrado em ambos os lados 3
Inflamação
Sem inflamação 1
Inflamação discreta 3
Avaliação imunoistoquímica
Em T150, as amostras para as análises imunoistoquímicas foram coletadas na região central do defeito condral de cada lesão e imediatamente armazenadas em formol para a parafinização. Cortes histológicos de cinco micrometros foram inicialmente submetidos a desparafinização em série de xilol e álcool, com posterior recuperação dos sítios antigênicos em vapor fluente (panela de valor) por 30 minutos. As lâminas foram então lavadas duas vezes por cinco minutos em agitador com tampão Tris Salino 0,1M, pH 7.5 (TBS) e posteriormente, o bloqueio da peroxidase endógena foi realizado por imersão em peróxido de hidrogênio a 1% por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, essas lâminas foram novamente lavadas em TBS (2x, por 5 minutos) e o bloqueio dos sítios não específicos foi realizado com soro normal de burro diluído em Tampão Fosfato Salino 0,2M, pH 7,4 (PBS) Após incubação overnight a 4ºC em câmara escura com os anticorpos primários (Rheabiotech Ltda, Campinas, Brasil), diluídos 1:200 em PBS, as amostras foram submetidas a repetidas lavagens em TBS contendo 0,1% de Tween 20, e em seguida incubados por 30 minutos a temperatura ambiente com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com biotina na diluição de 1:40020. Sendo esses posteriormente incubados com reagente AB (complexo avidina- biotina) por 30 minutos à temperatura ambiente21 e reveladas com DAB22 por cinco minutos à temperatura ambiente. Os cortes foram então contracorados com solução de hematoxilina. A imunomarcação foi avaliada através de microscópio ótico, em objetiva de 40x. A análise da quantidade relativa de perfis celulares por área foi obtida análise de cinco campos distintos de cada amostra.
Expressão gênica do colágeno tipo II