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Escherichia coli é uma espécie de bactéria Gram-negativa em forma de bastonete. Foi em

1885 que o médico alemão Theodor Escherich descobriu esta bactéria unicelular em fezes humanas. Primeiramente, denominou-a Bacterium coli commune devido ao facto de ter sido encontrada no cólon. Só passados alguns anos é que foi adotado o nome científico de Escherichia

coli, em honra do médico alemão (Castellani and Chalmers, 1919).

De um modo geral, as bactérias desenvolvem-se em meios hipotónicos e dada a fragilidade da membrana plasmática ocorreria lise celular se não fosse a presença de uma parede celular rígida. Esta estrutura constitui uma proteção mecânica eficaz contra a rutura osmótica da célula bacteriana em ambientes hipotónicos. A parede celular também é responsável pela morfologia bacteriana e pelo duplo comportamento das bactérias em relação à coloração de Gram. Esta coloração tem um grande significado a nível taxonómico pois permite dividir as bactérias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas. Estes dois grupos diferem drasticamente entre si na organização das estruturas fora da membrana plasmática. A E.coli, tal como as restantes bactérias Gram-negativas, não retém o corante cristal violeta utilizado na coloração de Gram. É por isso utilizada a safranina que vai tingir as bactérias Gram-negativas num tom rosa (Figura 3.1) (Parente and Sousa, 1998).

A maioria das bactérias Gram positivas tem uma espessa camada de peptidoglicano adjacente à membrana plasmática. Contrariamente, as bactérias Gram negativas apresentam uma fina camada de peptidoglicano. Para além da camada de peptidoglicano, as Gram negativas possuem uma membrana lipídica externa. Nesta membrana estão ancoradas lipoproteínas que por sua vez estão ligadas covalentemente ao peptidiglicano. A organização e dimensão da membrana externa são muito similares às da membrana plasmática. Aliás, as duas membranas aderem uma à outra em centenas de pontos, culminando em várias descontinuidades na estrutura do peptidoglicano. Na membrana externa

Figura 3.1 - Células de E. coli vistas ao microscópio após

23 estão presentes os lipopolissacarídeos

(LPS) que estão associados à

patogenicidade das bactérias Gram negativas (Salton and Kim, 1996; Parente and Sousa, 1998).

O peptidoglicano é um

heteropolímero rígido e insolúvel na água e em cada bactéria constitui uma única macromolécula. É composto por cadeias lineares de dois açúcares, o ácido

N-acetilmurâmico (NAM) e N-

acetilglucosamina (NAG), dispostos

alternadamente e unidos por ligações glicosídicas β (1→4). A cada molécula de NAM, através de uma ligação amida, ligam-se cadeias peptídicas (por norma quatro aminoácidos) (Figura 3.2). A ligação glicosídica β (1→4) entre NAG e NAM é suscetível à ação hidrolítica da lisozima. As cadeias peptídicas pertencentes a cadeias lineares vizinhas estabelecem entre si pontes interpeptídicas, usualmente entre o grupo – NH2 do terceiro aminoácido e o grupo – COOH do quarto aminoácido. O ácido meso-diaminopimélico é aminoácido pouco frequente nas bactérias Gram positivas, sendo mais frequente no peptidoglicano das bactérias Gram negativas (Parente and Sousa, 1998).

Além do peptidoglicano, outras macromoléculas participam na arquitetura da parede celular das bactérias Gram negativas. A membrana exterior é composta por uma bicamada fosfolipídica. Esta membrana é constituída por lipopolissacarídeos, fosfolípidos e proteínas. O lipopolissacarídeo é uma molécula anfifílica, com uma região polissacarídea (hidrófila) e o lípido A (hidrófoba). Esta molécula está ancorada na membrana exterior através do lípido A e a região hidrófila projeta-se para o exterior da célula, contribuindo para a carga negativa da superfície bacteriana (Figura 3.3) (Parente and Sousa, 1998). O LPS, através do lípido A, tem sido responsabilizado pelas manifestações clínicas que ocorrem durante a infeção por bactérias Gram negativas: febre, inflamação e choque séptico. O LPS participa na ativação dos macrófagos e dos linfócitos B e T (Parente and Sousa, 1998; Salton and Kim, 1996).

As diferenças estruturais entre os dois grupos de bactérias explicam a diferente coloração de Gram. O corante cristal violeta adicionado é retido nas Gram positivas devido à reduzida porosidade da espessa camada de peptidoglicano, atribuindo-lhes um tom púrpura. Em contraste, a fina camada de peptidoglicano presente nas bactérias Gram-negativas e as descontinuidades no peptidoglicano nos pontos de adesão entre as duas membranas não permitem a fixação do corante (Salton and Kim, 1996; Parente and Sousa, 1998).

Figura 3.2 – Estrutura do peptidoglicano de S. aureus. L-Ala:

L-alanina; D-Glu: ácido D-glutâmico; L-Lys: L-lisina; D-Ala: D-alanina; Gly: glicina (Parente and Sousa, 1998).

24 A temperatura ideal para o crescimento de E. coli é 37°C, daí serem parte integral da flora intestinal de vários organismos endotérmicos. Desde que as bactérias não adquiram elementos genéticos que lhes confiram fatores de virulência, estes organismos instituem uma relação de comensalismo com o hospedeiro (Salton and Kim, 1996). As células de Escherichia

coli produzem vitamina K2 (Bentley and Meganathan, 1982) e previnem o estabelecimento de bactérias patogénicas no intestino (Hudault et al., 2001; Yadav et al., 2005). As estirpes virulentas de E. coli podem causar gastroenterites, infeções no trato urinário, entre outras enfermidades (Salton and Kim, 1996). Esta espécie é considerada um anaeróbio facultativo, sendo que é capaz de crescer tanto na presença como ausência de oxigénio. Estas bactérias podem crescer utilizando vários substratos, incluindo a oxidação do ácido pirúvico, ácido fórmico e aminoácidos, e a redução de oxigénio, nitrato e fumarato (Ingledew and Poole, 1984).

A primeira sequenciação completa do genoma de E. coli (estirpe K-12) foi publicada em 1997. Tratava-se de uma molécula de DNA circular com 4.6 milhões de pares de base, contendo 4288 genes que codificavam proteínas. A sequenciação permitiu verificar que o genoma continha quantidades significativas de transposões e sequências repetitivas (Blattner et al., 1997). No presente, mais de 60 genomas de diferentes estirpes de E. coli foram sequenciados. A comparação entre as diferentes sequências mostrou que apenas 20% de cada genoma representa sequências presentes em todas as estirpes, enquanto 80% de cada genoma varia consoante a estirpe (Lukjancenko et al., 2010).

A espécie Escherichia coli é frequentemente utilizada como organismo modelo em diversos estudos. O cultivo destas bactérias em laboratório é simples e pouco dispendioso. Além disso, apresentam um rápido crescimento e os genomas de várias estirpes já foram sequenciados. Devido ao seu longo historial em experiências laboratoriais, E. coli desempenha um papel importante na indústria biotecnológica. O trabalho de Stanley Cohen e Herbert Boyer em E. coli, usando plasmídeos e enzimas de restrição para criar DNA recombinante, tornou-se um marco na

Figura 3.3 – Esquema que retrata as diferenças estruturais e moleculares entre a parede celular das bactérias

25 história da biotecnologia. Esta espécie é um dos hospedeiros mais requisitados para a produção de proteínas recombinantes. Os genes que codificam a proteína de interesse podem ser inseridos em plasmídeos e estes internalizados em E. coli. A proteína pode ser produzida em massa em fermentadores industriais. A insulina humana foi a primeira proteína recombinante a ser comercializada (Walsh, 2003).