5.1.
Princípios de Cromatografia
As técnicas cromatográficas, com os seus primórdios ainda na primeira metade do século XX, são hoje um conjunto extremamente variado de metodologias que conseguem atingir, com maior ou menor grau de pureza e precisão, uma separação total dos componentes duma dada mistura. Assim, conseguimos definir cromatografia como um processo que separa os múltiplos componentes do analito partindo de duas fases: a fase móvel e a fase estacionária (77). O princípio fundamental reside no grau variável dos componentes aderirem à fase estacionária e serem posteriormente eluídos pela fase móvel.
Os diversos métodos cromatográficos podem ter utilidade em diferentes tipos de utilização, sendo fundamentais no âmbito da toxicologia, química analítica, ciência forense, fitoquímica, farmacologia e tantas outras áreas do conhecimento. Uma descrição aprofundada dos diversos tipos fica fora do escopo deste segmento. A classificação do tipo de cromatografia é baseada nos diferentes estados físicos da fase móvel e da fase estacionária (30,78).
Conseguimos distinguir vários tipos de cromatografia, partindo da diferenciação do estado físico da fase móvel e da fase estacionária. Outras distinções podem ser aplicadas. As amostras podem encontrar-se num estado líquido, gasoso ou sólido e podem ser constituídas por uma solução dum simples componente ou uma mistura altamente complexa em matrizes elaboradas. Foi para separar pigmentos presentes em plantas que o botânico russo Tswett usou uma forma simples de cromatografia liquido-sólido. Nesta altura, a identificação da separação era visual, pela observação dos pigmentos. O termo cromatografia derivada do grego chromo-, um prefixo que designa cor embora, atualmente, a cor pouco tenha a ver com a maioria das técnicas cromatográficas (79).
Posteriormente, outros investigadores perceberam que a separação líquido-líquido também seria possível, colocando a fase móvel, água por exemplo, numa base de sílica. De seguida, verificou-se que substituir a fase móvel líquida por um gás aumentaria a velocidade da separação, com proporcional aumento da eficiência. Surge assim a cromatografia gasosa. No entanto, o seu valor apenas viria a ser compreendido anos mais tarde e apenas em meados dos anos 60 do século passado, tendo sido nesta altura lançados os fundamentos da cromatografia liquida de alta eficiência, no seu original HPLC, High Performance Liquid
Chromatography. Atualmente, é possível separar gases e substâncias voláteis por
cromatografia gasosa, matérias de elevado peso molecular por cromatografia liquida e mesmo separações simples por cromatografia em camada fina, com um custo baixo (79,80).
19 A cromatografia líquida de ultra performance surge como uma melhoria aos equipamentos de HPLC, partilhando os mesmos princípios, mas exibindo resolução adicional. Esta resolução adicional é possível de alcançar já que este tipo de sistemas suporta pressões mais elevadas, permitindo ao operador diminuir as dimensões da fase estacionária. Conhecer a forma de funcionamento e os princípios teóricos adjacentes a esta técnica é fundamental para a interpretação dos resultados. A principal diferença de outras técnicas de elevada eficiência, como a cromatografia gasosa (GC) é o facto da última depender da possibilidade das substâncias serem volatilizadas. Estima-se, a título de exemplo, que apenas 20% dos compostos orgânicos conhecidos possam ser analisados através de GC, sendo uma óbvia limitação (80).
Assim, e de forma geral, o sistema de distribuição encontra-se na forma de uma coluna, que pode ter um comprimento de poucos centímetros a vários metros, revestida com partículas que constituem a fase estacionária. A fase móvel, um líquido ou gás, é forçado sob pressão (ou não), pela coluna para eluir a amostras. Num primeiro momento, como resultado das diferentes forças moleculares, os solutos são retidos pela fase estacionária, sendo que os que possuem menos afinidade para esta serão eluídos primeiro. Desta forma, e assumindo que a eluição é lenta o suficiente, produz-se a separação dos solutos. Na tabela 2, abaixo, encontra-se uma possível classificação das técnicas cromatográficas (77,79).
Tabela 2: classificação de técnicas cromatográficas. Adaptado (79)
Fase Móvel Fase Estacionária
Gás Cromatografia Gasosa (GC) Líquida Cromatografia Gás-Líquido Sólida Cromatografia Gás-Sólido Líquida Cromatografia Líquida (LC) Líquido Cromatografia Líquido-Líquido Sólido Cromatografia Líquido-Sólido
Em cromatografia líquida podemos ainda distinguir entre cromatografia de fase normal e fase reversa. A primeira refere-se ao caso em que a fase estacionária é mais polar que a fase móvel e a segunda denomina o caso em que a fase estacionária apresenta menor polaridade que o solvente utilizado na fase móvel (79).
O grau de separação é ditado pelo coeficiente de distribuição da substância, sendo este definido como a razão entre as concentrações dum composto numa mistura de duas fases, em equilíbrio, permitindo quantificar a diferença de solubilidade. O coeficiente de distribuição de uma dada substância é função de vários aspetos, cujo efeito sinérgico resulta num valor
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numérico. As mais importantes são forças moleculares, nomeadamente forças de dispersão, iónicas, polares e interações hidrofílicas ou hidrofóbicas (29,45,81).
5.2.
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Tendo em conta o sistema analítico utilizado no presente documento, irá realizar-se de forma resumida uma breve introdução sobre o mesmo.
Em cromatografia líquida, a amostra tem de ser dissolvida num solvente orgânico, e a maioria dos solventes não levanta problemas de foro técnico. A escolha do solvente prende-se com a afinidade deste para com os constituintes da amostra a separar. Se a afinidade for demasiado elevada, é possível que os elementos da mistura sejam eluídos rapidamente, não se obtendo a separação em picos necessária. Em cromatografia líquida é fundamental manter o número de pratos teóricos elevado, isto é, elevada eficiência na forma de capacidade de eluição com baixa dispersão dos picos produzidos pelo analito. Quanto maior o número de pratos teóricos, maior o grau de separação da mistura. Uma série de fatores pode levar a uma diminuição deste valor, ou seja, à obtenção de picos largos e possivelmente sobrepostos, nomeadamente o multipath effect, que se refere aos “percursos” que o analito pode fazer entre as partículas de fase estacionária. Tal prevê que alguns destes reflitam uma maior distância percorrida até à saída da coluna, demorando por isso mais tempo. O fluxo de fase móvel pela coluna pode também ocorrer a diferentes velocidades nesta, ou a difusão molecular, afetada por fatores como a velocidade geral de fluxo. Outros aspetos podem contribuir para este fenómeno (36,77,80,82).
A coluna (fase estacionária) é dos componentes mais importantes num sistema cromatográfico. Assume diversas formas, conforme o tipo de cromatografia e o seu comprimento pode ir desde poucos centímetros até vários metros. Um cromatograma, o registo efetuado à saída do detetor, é função primariamente da coluna, da fase móvel e da intensidade do sinal gerado. Relativamente à coluna, dois aspetos são fundamentais: o seu comprimento e o tamanho da partícula que constitui a fase estacionária. Um comprimento maior permite obter uma maior separação dos picos, pois aumenta o tempo de eluição. Por outro lado, um menor tamanho de partícula aumenta a área de superfície da fase estacionária, aumentando por isso a adsorção. Isto permite maior precisão e eficiência de separação (78–80,82).
Garantir a resolução do cromatograma obtido é fundamental para a correta identificação e quantificação dos analitos. O fator de retenção, a razão entre o tempo durante o qual um analito é retido na fase estacionária e o tempo em que é retido na fase móvel, deverá oscilar entre 1 e 10, ajustando-se a fase móvel em função do valor obtido. A qualidade da coluna e dos reagentes é fundamental para obter picos devidamente separados, existindo estratégias a
21 adotar para atingir este propósito. Uma otimização da velocidade de fluxo é também importante. Uma outra alternativa para aumentar a resolução pode passar por um aumento do fator de separação, podendo considerar-se uma diferente fase móvel, em primeiro lugar, seguido de uma mudança na fase estacionária, trocando de coluna (78,80).
Num sistema cromatográfico de HPLC conseguimos distinguir vários elementos, cujo conhecimento e compreensão de funcionamento são fundamentais para a sua operação. A bomba é o equipamento controlável por computador capaz de manter o sistema sob muito elevada pressão e manter o fluxo de solvente constante. O forno da fase estacionária corresponde ao segmento onde são mantidas as colunas, sendo possível configurar a temperatura a que se pretende que sejam realizadas as medições. O importante efeito da temperatura será abordado posteriormente. O sampler e injetor são os componentes responsáveis por manter e injetar as amostras. Na maioria dos equipamentos modernos é possível manter um elevado número de amostras, podendo-se configurar a temperatura a que são mantidas. Por fim, o detetor, que pode apresentar várias configurações, em virtude do que se pretende determinar. Exemplos de detetores são o detetor de ultravioleta (UV), o detetor de diode array (DAD), o detetor de fluorescência (FLD), o detetor de electroquímica (ECD) ou o detetor de espectrometria de massa (MS) A coluna, um dos mais importantes componentes, foi já discutida anteriormente. (15,77).
Um outro aspeto crucial para o funcionamento dos sistemas de HPLC é o efeito da temperatura. De forma geral (mas não exclusiva), um aumento da temperatura permite melhor eficiência, já que a diminuição da viscosidade do solvente facilita as transferências de massa. Isto permite um menor tempo de análise, pelo que também a temperatura deve ser sujeita a otimização. No entanto, temperaturas mais elevadas podem levar a uma degradação dos compostos em estudo ou até do próprio solvente, prejudicando a quantificação. Temperaturas mais elevadas podem levar ao aparecimento de bolhas, devido à evaporação do solvente, prejudiciais para a coluna, comprometendo também a uniformidade dos resultados obtidos (78,80).
Durante a validação e preparação do método cromatográfico, esforços devem ser feitos no sentido de analisar os cromatogramas obtidos e otimizar o método recorrendo às ferramentas e bibliografia existentes, tendo em consideração aspetos variados como a coluna, fase móvel, velocidade de fluxo, temperatura de funcionamento, compostos a analisar, entre outros.
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