Anisotropic models

No decorrer dos últimos anos, as lipases têm vindo a ser alvo de grande interesse em aplicações biotecnológicas. Mas quando se trabalha com este tipo de enzimas devem ter-se em conta diversos fatores implicativos na sua atividade e estabilidade operacional. Um estudo publicado por Holm e Cowan (2008), indica que a estabilidade de uma enzima a atuar em meio aquoso é influenciada, sobretudo, pela temperatura, pH, e pela presença do substrato, em certa medida. Em meios não aquosos a estabilidade enzimática manifesta-se de forma diferente. Embora se saiba que as lipases são mais termostáveis

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em meios não aquosos, muitos destes estudos foram elaborados por curtos períodos de tempo, não envolvendo operações em sitemas contínuos. Alguns dos principais fatores que influenciam a atividade e estabilidade operacional das enzimas são: temperatura, produtos de oxidação dos lípidos, atividade da água e ácidos gordos livres. Em baixo encontra-se uma breve descrição de como estes fatores se tornam condicionantes no meio reacional.

A temperatura é um parâmetro que se deve ter em consideração no decorrer de uma reação enzimática. A maioria das enzimas imobilizadas são termoestáveis, operando a maiores amplitudes de temperatura sem apresentar diferenças acentuadas de atividade. A maioria das enzimas livres apresenta no entanto temperaturas ótimas para atuar, perdendo atividade fora desses parâmetros ótimos. Nas reações enzimáticas, verifica-se que a velocidade de reação aumenta com a temperatura até a um valor ótimo, a partir da qual decresce, podendo mesmo inativar a enzima por processos de desnaturação. À medida que se aumenta a temperatura, aumenta-se a energia atómica que confere maior agitação e mobilidade nos átomos que pode ser suficiente para quebrar as fracas ligações que mantêm a estrutura proteica. Desta forma dá-se a desnaturação da enzima e inativação da mesma. Na maioria dos casos, as enzimas sofrem processos de imobilização para não perderem a sua atividade tão rápido e suportarem temperaturas mais elevadas, favoráveis a maiores taxas de conversão, maior solubilidade no substrato e menor viscosidade no meio reacional, favorecendo a transferência de massa (Person et al, 2002; Karra-Châabouni et al, 2008). A nível industrial, pretendem-se catalisadores que mantenham a sua atividade por um período o mais extenso possível, a uma taxa de incorporação estável, num processo que implique os menores custos possíveis. Neste sentido têm sido sugeridos sistemas com enzimas capazes de operar a temperaturas inferiores, evitando oxidações, principalmente em sistemas que envolvam ácidos gordos insaturados de cadeia longa (Karra-Châabouni et

al, 2008; Shakeri e Kawakami, 2009).

A oxidação dos lípidos entende-se como um fenómeno complexo, induzido pelo oxigénio, e na presença de catalisadores como o calor, radicais livres, luz, pigmentos fotossensíveis ou iões metálicos. Esta oxidação pode ocorrer por três vias diferentes: (i) oxidação não-enzimática em cadeia, mediada pelos radicais livres, (ii) oxidação espontânea induzida pela luz, e (iii) oxidação enzimática (Laguerre et al, 2007). A lipólise e a oxidação dos lípidos nos alimentos origina “off-flavours” desagradáveis, que resultam da formação de hidroperóxidos (produtos iniciais da oxidação) que reagem facilmente

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com os ácidos gordos e originam produtos secundários da oxidação, essencialmente aldeídos e cetonas (Serra et al, 2008), provocando um decréscimo na atividade e estabilidade das lipases.

As gorduras insaturadas são mais suscetíveis à oxidação, quando comparadas com gorduras saturadas, oxidação que aumenta consoante o seu grau de insaturação (Osório

et al 2001; Leyton et al, 1987) e a sua posição na estrutura do TAG. Assim, os ácidos

gordos polinsaturados inseridos nas posições sn-1 e sn-3 estão sujeitos a um maior grau de oxidação do que se estiverem, comparativamente, inseridos na posição central do TAG (sn-2) (Andrews et al, 2008). Alguns autores apresentam inclusive resultados onde comprovam capacidades antioxidantes para estes ácidos gordos (Richard et al, 2008). Em reações de acidólise ou de interesterificação, a oxidação dos PUFA resulta também da conjugação das condições reacionais (Osório et al, 2001). Esta oxidação também pode levar a uma diminuição da atividade e estabilidade operacional das lipases, quando utilizadas em reatores contínuos (Osário et al, 2008), originando um menor rendimento no produto final. A tentativa de evitar ou retardar a oxidação de produtos lipídicos formulados em laboratório ou à escala industrial, representa uma das maiores preocupações quando se trabalha com estes compostos, pelo que se aplicam algumas técnicas para retardar ou prevenir a oxidação lipídica. Estas vias incluem a quelação de metais de transição, a destoxificação enzimática das espécies reativas de oxigénio (“Reative oxygen species” - ROS), filtração U.V., inibição de enzimas pró-oxidantes, cofactores enzimáticos antioxidantes (Laguerre et al, 2007), apenas para referir técnicas mais usuais.

A atividade da água (aw) é uma medida da água disponível de um sistema, e corresponde à relação entre a pressão de vapor de água desse sistema (P) e a pressão de vapor de água pura no ar saturado à mesma temperatura (Po) (Parker e Birch, 1983). Estudos anteriores puderam inclusive comprovar que o conteúdo de água no sistema reacional pode ser melhor quantificado em termos de atividade da água (Halling, 1994). Na síntese dos mais variados compostos e derivados lipídicos estruturados, as lipases podem ser utilizadas em três tipos de sistemas principais. Os sistemas aquosos, sistemas com solventes orgânicos ou os sistemas livres de solventes, sobre os quais se tem prestado mais atenção nos últimos tempos. Este sistema consiste na mistura simples dos reactantes e apresenta maiores vantagens, no que respeita a condições de operação, a alta especificidade para o substrato, a simplificação considerável no processo de “downstream” e as reduzidas implicações ambientais.

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Outras vantagens adicionais para os sistemas livres de solventes passam eventualmente pela redução de custos no design do reator para o processo em larga escala e na redução nos custos de separação, visto não ser necessário recuperar os solventes utilizados (Xin et al, 2010).

As lipases são caracterizadas por um fenómeno designado de “ativação interfacial” e assim sendo, a atividade enzimática aumenta consideravelmente quando o substrato se encontra na interface água-substrato, um fenómeno que é devido às características estruturais únicas desta classe de enzimas e que se justifica pela sua maior flexibilidade molecular. A aw de um sistema determina a hidratação da enzima e, assim, a sua atividade catalítica. Além disso, este parâmetro determina a posição do equilíbrio nas reações catalisadas por enzimas hidrolíticas, como é o caso das lipases, já que a reação de hidrólise compete com as reações de interesterificação e de esterificação. A água pode encontrar-se no sistema em quantidades vestigiais, geralmente adsorvida nas moléculas de biocatalisador (Foresti et al, 2007). Verifica-se assim uma aw muito baixa, que vai favorecer as reações de esterificação e de interesterificação. Uma hidratação excessiva do biocatalisador (fase separada da fase orgânica) vai promover reações essencialmente extensas de hidrólise, originando maioritariamente, diacilgliceróis, monogliceróis e ácidos gordos livres como produtos finais (Zhao et al, 2007). Quanto menor a aw no sistema, mais será beneficiada a reação global no sentido da formação de triacilgliceróis pelo processo de interesterificação (Ma et al, 2003; Yang et al, 2003).

Atendendo a que o mecanismo de interesterificação envolve uma primeira fase de hidrólise dos grupos éster, com posterior reesterificação, o rendimento do produto final depende diretamente deste balanço entre hidrólise e esterificação reacionais. Diversos estudos referem que a adição de água no meio reacional pode favorecer a acidólise, mas em proporções severamente controladas, e que variam consoante o catalisador (Foresti

et al, 2007; Ma et al, 2006; Nielsen et al, 2006; Huang e Akoh, 1994).

A síntese de lípidos estruturados, e de triacilgliceróis, mais especificamente, envolve sucessivas reações de hidrólise e posterior reesterificação na molécula de glicerol. Contudo neste processo estão envolvidos alguns produtos intermédios como ácidos gordos livres, glicerol e glicéridos parciais (mono e diacilgliceróis). Tanto recorrendo a meios químicos como enzimáticos, o processo de interesterificação não se traduz em incorporações totais, resultando no aparecimento destes produtos intermédios no meio que misturam nos produtos finais.

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O aparecimento de ácidos gordos livres no meio reacional provoca um decréscimo do pH do mesmo. Existem estudos que referem a inativação/inibição das lipases na presença de elevados teores de ácidos gordos livres, precisamente pela sua sensibilidade ao pH do meio. Nas reações de acidólise, este aspeto limita a utilização de concentrações elevadas de ácidos gordos livres como substrato (Pesaresi et al, 2009). Por outro lado é sugerido por alguns autores que, com a formação de ácidos gordos livres no meio, estes possam competir com os ácidos gordos livres específicos, que são utilizados como substrato de incorporação no TAG, causando uma diminuição ou inibição na taxa de incorporação de determinados ácidos gordos no produto de interesse final.

Embora seja também sugerido que a elevada concentração de AGL no meio possa por em causa a estabilidade operacional do biocatalisador, Holm e Cowan (2008) demonstraram não haver interferência negativa sobre o processo de acidólise.

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