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• NF- B e Fator de Necrose Tumoral- Receptor 1 (TNFR1)

As expressões imunoistoquímicasdo NF- B e TNFR1 foram avaliadas através de um escore, sendo consideradas positivas, as amostras que exibiam marcações nucleares roxas e marcações citoplasmáticas, respectivamente, independente da intensidade de marcação, segundo os critérios abaixo descritos:

Negativo = ausência de marcação; 1+ = < 10% de células positivas; 2+ = 10% a 50% de células positivas; e

3+= > 50% de células positivas (DELLA PORTA, 2011).

Para verificação da associação estatística das variáveis foram compostos três grupos: Negativo; Baixa expressão (BE)- 1+ e 2+ e Alta expressão (AE)- 3+.

• Survivina

A expressão imunoistoquímica da survivina foi avaliada através de um escore, sendo consideradas positivas, as amostras que exibiam marcação citoplasmática, independente da intensidade da marcação, segundo os seguintes critérios:

Negativo =< 10% de células marcadas; 1+= 10% a 29% de células marcadas; 2+= 30% a 59% de células marcadas; e

3+= > 60% de células marcadas (LIN et al., 2003).

Para verificação da associação estatística das variáveis foram constituídos dois grupos: negativo e positivo (amostras com 10% de células coradas) (XI et al., 2011).

• Caspase 3

A expressão imunoistoquímica da caspase 3 foi avaliada através de um escore, sendo consideradas positivas, as amostras que exibiam marcação citoplasmática, independente da intensidade da marcação, segundo o critério abaixo descrito:

Negativo= 0 a 5%;

1+= 6% a 25% de células marcadas; 2+= 26% a 50% de células marcadas; 3+= 51% a 75% de células marcadas; e 4+= 76% a 100% de células marcadas.

Para verificação da associação estatística das variáveis foram compostos três grupos: Negativo; Baixa expressão (BE)- 1+ e 2+ e Alta expressão (AE)- 3+.

• Catenina

A expressão da catenina nas células epiteliais colônicas foi avaliada através de um escore que incluiu:

o Distribuição da marcação: membrana; citoplasma e nuclear. • Membrana

A marcação de membrana foi graduada obedecendo aos seguintes critérios: 0= < 5 % de células epiteliais com marcação positiva;

1+= 5 a 25% de células epiteliais com marcação positiva; 2+= 26 a 50% de células epiteliais com marcação positiva; 3+= 51 a 75% de células epiteliais com marcação positiva; e 4+= >75% de células epiteliais com marcação positiva.

A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica seguiu ao critério: 0= negativa;

1+= fraca; 2+= moderada; e 3+= intensa.

O escore final foi obtido através da multiplicação da extensão da positividade pela intensidade. A contagem final de 9 a 12 foi definida como expressão intensa, 5 a 8 como expressão reduzida e 0 a 4 como expressão marcadamente reduzida (OZAWA et al., 1990; HAO et al., 1997; HAO et al.,2001; MI et al., 2009).

• Nuclear e citoplasmática

A marcação nuclear e citoplasmática para catenina obedeceu ao seguinte critério: 0= negativo (ausência de marcação citoplasmática ou nuclear);

1+= < 5% de células epiteliais marcadas; 2+= 5% a 25% de células epiteliais marcadas; e 3+= > 26% de células marcadas.

Expressão reduzida de membrana, expressão citoplasmática e nuclear foram consideradas expressão alterada de catenina (MI et al., 2009; OZAWA et al., 1990; HAO et al., 1997; HAO et al.,2001).

• p53

As amostras que exibiam marcação nuclear 10% foram consideradas positivas, A escolha deste valor de corte baseou-se no estudo de GRIZZLE et al. (1998), que detectaram que este valor mostra alta concordância entre a detecção imunoistoquímica e pontos de mutação do gene p53 detectado através de análise de polimorfismo de conformação de fita simples.

• Proibitina (PBT)

A expressão imunoistoquímica da Proibitina foi avaliada com relação à: • Distribuição da marcação: Citoplasmática.

O percentual de células marcadas foi mensurado segundo os critérios abaixo discriminados:

Negativo= ausência de marcação; 1+= 1% a 25% de células marcadas; 2+= 26% a 50% de células marcadas; 3+= 51% a 75% de células marcadas; e 4+= > 76% de células marcadas.

O escore final foi calculado através da multiplicação: intensidade x percentual de células coradas, resultando em:

0 - Negativo;

1-3 - Fracamente positivo; 4-7 - Positivo; e

8-12 - Fortemente positivo (REN et al., 2010).

A análise da marcação nuclear obedeceu ao mesmo escore utilizado para a citoplasmática, independente da intensidade da marcação.

Para análise estatística da expressão citoplasmática e nuclear da PBT foram constituídos três grupos conforme discriminados abaixo: Negativo; Baixa expressão para fracamente positivo e positivo/ 1+ e 2+; e Alta expressão (AE) para fortemente positivo/ 3+ e 4+; respectivamente.

• VEGF

A avaliação da expressão do VEGF foi realizada segundo os critérios abaixo discriminados:

o Marcação citoplasmática positiva > 10% de marcação epitelial,

o Marcação citoplasmática negativa < 10% de marcação epitelial. (LI et al., 2011).

• Metaloproteinases 2 e 9

A avaliação imunoistoquímica das metaloproteinases (MMP) 2 e 9 incluiu a análise da proporção de células reativas dentro do tumor e a intensidade da coloração da marcação citoplasmática. A presença de precipitação marrom escuro claramente visível foi considerada positiva e o sistema de graduação utilizado foi: 0= < 1% de células positivas; 1= 1%-10% de células tumorais marcadas; 2= 11%-50% de células tumorais marcadas; 3= 51%-90% de células tumorais marcadas; e 4= > 90% de células tumorais marcadas. A intensidade da marcação foi representada pela intensidade estimada baseada no seguinte critério: 0= reação não visível; 1= fraca; 2= moderada e 3= intensa. Foram examinados cerca de dez campos de maior aumento (SOARES et al., 2006; CURRAN et al., 2004; GOLOVKOV, 2009; FELIN et al., 2009; LYALL et al., 2006).

Para análise estatística, foram considerados casos negativos quando a soma da intensidade e da proporção de células marcadas foi de 0 a 1= negativa; soma de 1 a 4= fracamente positiva; e positiva quando a soma era maior que 4 (SOARES et al., 2006).

3.5. TÚNEL

Secções dos tecidos parafinados foram desparafinados e incubados em 20µg/mL proteinase K (Promega Corporation, Madison, WI- USA). Foi utilizado para a detecção de apoptose in situ, peroxidase DeadEnd (Kit Dead EndTM Colorimetric TUNEL System-

Promega Corporation, Madison, WI- USA) com o kit (TUNEL DeadEnd, Promega Corporation) sendo utilizado biotina dUTP-nick-end. As amostras foram tratadas com peróxido de hidrogênio 3% para bloqueio da atividade da peroxidase endógena. Após a adição do tampão de equilíbrio, os cortes foram tratados com deoxinucleotídeo-transferase e digoxigenina-dNTPs por 60 minutos a 37°C. A seguir, tratados com anti-peroxidase- digoxigenina por 30 minutos a 37°C, coradas com DAB (diamino benzidina) e contracorados com Hematoxilina de Mayer. Finalmente, os cortes foram lavados, desidratados e montados.

O controle negativo foi preparado pela omissão da enzima deoxinucleotídeo- transferase para controlar a incorporação não-específica de nucleotídeos ou ligação conjugada da enzima. O número de células TÚNEL positiva foi avaliado com base no percentual de marcação nuclear observado em cada amostra para se obtiver a média de valores. As células

foram consideradas positivas quando exibiam marcação nuclear marrom evidente. Marcações estromais foram desconsideradas. O cut off foi estabelecido de acordo com o percentual mais frequente de pontos sendo <5% considerado negativo e a 5% positivo (ZANETTI, 2011).

3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas foram realizadas com a utilização do software estatístico SAS® 9.0 (SAS Institute Inc., SAS/STAT® User’s Guide, Version 9.0, Cary, NC: SAS Institute Inc., 1999). Para verificar a associação entre as variáveis qualitativas relacionadas ao estudo, os dados foram submetidos ao Teste Exato de Fisher (FISHER, 1935) ou teste de 2.. Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.

4. RESULTADOS

4.1. ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DA NF- B,