Muito progresso tem sido feito quanto à identificação de indicadores confiáveis da qualidade do sêmen, de forma a permitir a exclusão de ejaculados de baixa qualidade para uso na IA. A avaliação física e morfológica do sêmen não é sempre indicativa de fertilidade e desempenho reprodutivo de varrões, de forma que a identificação de marcadores genéticos e protéicos acurados e preditivos ainda são necessários (Foxcroft et al., 2008).
O PS é definido como o meio líquido no qual os espermatozoides se encontram imersos após a ejaculação, sendo formado por uma mistura de secreções oriundas dos túbulos seminíferos, epidídimos e das glândulas sexuais acessórias (Mann e Lutwak-Mann, 1981). As funções do PS se referem principalmente à nutrição, proteção, regulação da motilidade e capacitação espermática, reconhecimento e união entre gametas e de uma maneira mais indireta à sua ação sobre o sistema genital da fêmea, aumentando as contrações uterinas, modulando a resposta imune uterina e levando ao relaxamento do istmo da tuba uterina (Johnson et al., 2000). O PS afeta vários atributos dos espermatozoides do varrão, ou seja, aumenta a sua motilidade, assim como a sua resistência ao choque pelo frio e ao estresse oxidativo. Além disso, aumenta também sua resistência à desestabilização de sua
38 membrana plasmática, bem como a danos
ao DNA (Saravia et al., 2009).
O ejaculado do varrão difere do ejaculado do carneiro e do touro de várias maneiras, sendo o volume maior e a concentração espermática menor. Além disso, a ejaculação acontece em várias ondas, sendo o processo mais demorado (Mckenzie et al., 1938). Além disso, como citado anteriormente, é possível distinguir três principais frações, designadas fração pré- espermática, fração espermática rica e fração pós-espermática, de acordo com a distribuição espermática (Lavon e Boursnell, 1975).
A maioria dos estudos referentes ao plasma seminal do varrão tem sido feitos no ejaculado completo, uma vez que esta é a forma como o ejaculado tem sido coletado. No entanto, existem excelentes estudos em amostras fracionadas do PS do varrão, os quais têm demonstrado que, devido a sua formação sequencial, o PS contém muitos componentes, todos interagindo com os espermatozoides e com o sistema genital feminino (Rodriguez-Martinez et al., 2009). A fração pré espermática contém basicamente eletrólitos, principalmente Na+ e Cl-; a fração espermática rica contém principalmente proteínas, além de hormônios esteróides (Claus et al., 1987; Saravia et al., 2009), glicerilfosforilcolina, frutose, glicose, inositol, citrato, bicarbonato e zinco, enquanto a fração pós espermática é formada por volumes crescentes de proteínas, bicarbonato, zinco, Na, Cl e ácido siálico (Rodriguez-Martinez
et al., 2009; Saravia et al., 2009).
As proteínas são os principais componentes do ejaculado do varrão, com 39,4- 13,45mg/mL de acordo com Rodriguez- Martinez et al. (2005). Destas, 80-90% são derivadas das glândulas vesiculares, com 75-90% pertencendo à família das espermadesinas-lecitinas (Rodriguez- Martinez et al., 2009; Saravia et al., 2009).
As espermadesinas, uma família de glicoproteínas de baixo peso molecular (12 – 16 kDa), são os principais produtos secretados pelo epitélio da vesícula seminal de certos animais domésticos, dentre eles o touro, o garanhão e o varrão (Calvete et al., 1995).
Membros desta família de glicoproteínas desempenham atividade heparina-ligante e carboidrato-ligante e recobrem a superfície do terço apical do acrossoma espermático na ejaculação. A maioria das espermadesinas que cobrem a superfície espermática é perdida durante a capacitação. Esta população de espermadesinas pode atuar como fator decapacitante ou estabilizante do acrossoma, impedindo a ocorrência da reação acrossômica prematura. Em contrapartida, as espermadesinas ligantes atuam na ligação entre glicoproteínas espermáticas e lecitinas da zona pelúcida, durante o reconhecimento gamético na fertilização. No entanto, as duas principais espermadesinas do varrão, Porcine Seminal Plasma Proteins (PSP-I e PSP-II), representam acima de 50% do total de proteínas plasmáticas e formam um heterodímero não covalente, que se liga de forma fraca à superfície espermática, sendo facilmente removido durante a capacitação
in vitro (Calvete et al., 1995). Para Assreuy et al. (2002) o heterodímero não é capaz de
se ligar à membrana plasmática dos espermatozoides, caracterizando outra população de espermadesinas.
As heparinas são glicosaminas lineares fortemente ácidas compostas de unidades repetidas de D-glicosaminas e resíduos de ácido hexurônico, substituídos com O- sulfatos e N-sulfatos, sendo produzidas pela maioria das células animais. Heparinas e Heparam-sulfato (GAG´s) se ligam a uma grande variedade de células associadas à superfícies, sendo importantes tanto para a fisiologia quanto para o desenvolvimento. Além disso, têm sido encontradas também associadas à proteínas da matriz
39 extracelular e como secreção. Estas
interações parecem ser importantes nos diversos processos biológicos. Heparinas e GAG´s exercem seus efeitos via modulação da atividade de proteínas as quais se ligam, sendo que o número de proteínas com propriedades GAG-ligantes implicadas nas suas ações biológicas vem aumentando e incluem enzimas, inibidores enzimáticos, proteínas da matriz celular, glicoproteínas de superfície viral, fatores de coagulação sanguínea, citocinas, fatores de crescimento, lecitinas, dentre outras. GAG´s tipo heparinas, secretadas pelo epitélio do sistema genital feminino, particularmente em altas concentrações durante a fase folicular do ciclo estral, têm sido relacionadas à indução da capacitação espermática em várias espécies, sendo seus efeitos mediados, aparentemente, pelas proteínas ligantes de heparina do PS (Calvete et al., 1997).
As espermadesinas são formadas a partir de um único domínio “CUB”, que ocorrem em variadas combinações em mosaicos de proteínas estruturalmente e funcionalmente não relacionadas, servindo como esqueleto estrutural onde diferentes funcionalidades podem ser imprimidas (Romero et al., 1997).
Dessa forma, esta família compreende três membros: as proteínas Alanina-Glutamina- Asparagina AQN (-1 a -3), as proteínas Alanina-Triptofano-Asparagina (AWN´s) e as Proteínas do Plasma Seminal do Suíno ou PSP´s (Porcine Seminal Plasma Proteins) I e II, PSP-I e PSP-II (Topfer- Petersen et al., 1998).
As atividades biológicas das espermadesinas dependem da sua sequência, do quanto são glicosiladas e do seu estado de agregação, assim como de sua habilidade de se ligar à heparina ou não. As proteínas AQN-1, AQN-3 e AWN se ligam à heparina e são classificadas como HBP´s (Heparin- Binding Proteins ou Proteínas ligadoras de heparina), sendo que as PSP´s
não se ligam à heparina, embora se liguem
à membrana plasmática dos
espermatozoides em vários graus, desde os testículos até a ejaculação (Rodriguez- Martinez et al., 2009).
As várias proteínas do plasma seminal se originam dos testículos, do epidídimio e das glândulas sexuais acessórias. Dessa forma, a concentração de proteínas aumenta aproximadamente quatro vezes, paralelamente à secreção das glândulas vesiculares. A menor concentração é encontrada na P1, aumentando as HBP´s e, particularmente, as PSP´s na fração pós – espermática. Assim, verifica-se que a maior parte dos espermatozoides não são suspensos, imediatamente, em altas concentrações de proteínas do PS in vivo, particularmente aqueles contidos na P1 (Rodriguez-Martinez et al., 2005).
De acordo com Strzezek et al. (2002), as concentrações de proteínas do plasma seminal em suínos, ficam estabilizadas desde o início da maturidade sexual do varrão até a idade de 2,5 anos, sendo reduzidas, significativamente em varrões a partir dos três anos de idade. A alta correlação existente entre a concentração de proteínas do PS e a habilidade fertilizante dos espermatozoides, tem sido utilizada como critério para predizer a fertilidade de machos (Killian et al., 1993; Flowers, 1997).
Diferenças qualitativas e quantitativas na composição protéica das frações P1 e P2 podem explicar porque os espermatozoides da P1 se comportam melhor durante o resfriamento e sobrevivem em maiores proporções, quando comparados aos espermatozoides da P2 (Saravia et al., 2009).
De acordo com Saravia et al. (2009), o PS da P2 consiste quase que exclusivamente de espermadesinas, particularmente as formas glicosiladas PSP-I e PSP-II, cada uma contendo um único resíduo N-asparagina glicosilado. No entanto, a fração P1
40 também contém estas espermadesinas,
embora em menores concentrações e com menores pesos moleculares. A maior parte das glicoformas de PSP-I tem massa molecular de 13,565; 13,949 e 14, 092 Da. Em contrapartida, a massa molecular das moléculas PSP-II é maior (14,069; 14,213 e 14,755). Basicamente, apesar de ambas P1 e P2 conterem espermadesinas, a P1 contém proteínas de origem epididimária, que são exclusivas da P1 ou encontradas em menores concentrações na P2. Assim, verificou-se que os espermatozoides da P1 continuam expostos a substancial quantidade de fluido da cauda do epidídimo.
Está bem estabelecido que os espermatozoides contidos na cauda do epidídimo do varrão resistem melhor à rotina de resfriamento e congelamento do que os espermatozoides ejaculados. Desta forma, o fato da P1 ainda conter relativamente altas concentrações de fluido epididimário poderia explicar o melhor desempenho dos espermatozoides contidos nesta fração (Saravia et al., 2009).
No trabalho desenvolvido por Garcia et al. (2009), demonstrou-se que o heterodímero PSPI/PSPII está presente em todas as frações do ejaculado, apesar de sua concentração aumentar na P2, paralelamente às HBP´s. Ao contrário, a FRE ou a P1 é caracterizada pelas menores concentrações de proteínas totais (15,37mg/mL) e também do heterodímero (1,8mg/mL), assim como pela menor concentração de HBP´s.
Os efeitos deletérios dos espermatozoides altamente diluídos da fração pós- espermática, na qual o heterodímero PSPI/PSPII alcança concentrações de >10mg/mL, citados por Garcia et al. (2009) estão de acordo com estudos anteriores quando demonstrou-se que o heterodímero possui ótima função de proteção espermática na concentração de 1,5mg/mL. Sua presença passa a apresentar efeitos
negativos quando em concentrações >7,5mg/mL (Centurión et al., 2003). Em um estudo realizado em ratos, demonstrou-se que as espermadesinas PSPI/PSPII e suas subunidades desempenham atividade quimiotática aos polimorfonucleares (PMN´s) in vitro. Além disso, o efeito tempo dependente exercido pelo heterodímero PSPI/PSPII, quanto ao recrutamento de células mononucleares e neutrófilos até a cavidade peritoneal de ratos, demonstrou padrão de reação inflamatória. O efeito pró-inflamatório da subunidade PSPI parece envolver uma interação direta com neutrófilos, enquanto a atividade PSPI/PSPII e PSPII de migração neutrofílica parece ser potencializada por macrófagos residentes, os quais podem liberar um fator quimiotático, possivelmente citocinas (Assreuy et al., 2003).
Um estudo envolvendo oito porcas, distribuídas aleatoriamente em grupos controle e tratado, demonstrou o efeito do heterodímero na resposta imune uterina. O grupo controle foi inseminado com soro fisiológico estéril (dose de 100mL, 0,9% de NaCl), enquanto o grupo tratado foi inseminado com um isolado do heterodímero PSPI/PSPII em soro fisiológico estéril (3mg/mL, em dose de 100mL). Todas as porcas foram inseminadas no primeiro dia de cio e abatidas aproximadamente 3h após a IA. Os cornos uterinos foram divididos em direito e esquerdo por grampos cirúrgicos, deixando um segmento de 5cm adjacente à tuba uterina e outro adjacente ao corpo uterino para exame histológico, os quais foram fixados por imersão em glutaraldeído tampão cacodilato 2,5%. Os segmentos medianos restantes foram lavados com 50mL de soro, sendo o fluido coletado para exame. Aproximadamente 96% das células encontradas após lavagem foram leucócitos, basicamente PMN. A simples infusão de soro (grupo controle) foi capaz de provocar a migração de PMN até o lúmen uterino
41 (238 ± 104,92 milhões de PMN).
Entretanto, um número médio seis vezes maior de PMN (1524 ± 298,70 milhões) foi recuperado do lúmen uterino de porcas inseminadas com o heterodímero. Tal observação confirma que mesmo diante de concentrações cinco vezes menores que as encontradas no ejaculado do varrão, o heterodímero induziu a migração de PMN
in vivo em porcas (Rodriguez-Martinez et al., 2001).
Durante a monta natural nos suínos, os primeiros espermatozoides alcançam a junção útero-tubárica e a primeira porção do istmo da tuba uterina em minutos até 1-2 horas, com a formação de um reservatório espermático pré-ovulatório (com 105 a 108 espermatozoides). A sua formação com número suficiente de espermatozoides para fertilizar todos os oócitos ovulados ocorre dentro de aproximadamente 3h após a cobrição; entretanto, o período considerado crítico para a sua formação está entre 5 – 60 minutos (Hunter, 1981; Viring e Einarsson, 1981).
O restante dos espermatozoides (10 – 50 x 109) será perdido por fluxo retrógrado (aproximadamente 35%) ou eliminado por fagocitose pelos PMN uterinos. Estes PMN migram da lâmina própria subjacente ao epitélio endometrial, onde se acumulam após extravasamento, provavelmente como resultado das altas concentrações de estrógeno circulantes na porca durante o proestro. Esta migração não é imediata após a cobrição, sendo a presença massiva de PMN primeiramente detectada trinta minutos após a deposição do sêmen, aumentando de maneira contínua nas 2-3 horas seguintes (Rozeboom et al., 1999; Woelder e Mattjis, 2001).
Os espermatozoides contidos na P1 do ejaculado serão os primeiros a colonizar o reservatório espermático. Há que se enfatizar, além disso, que a ausência de mediadores da inflamação PSPI/PSPII nesta fração espermática pode prover uma janela
de oportunidade para que os espermatozoides alcancem o reservatório espermático antes que os PMN cheguem ao lúmen uterino (Rodriguez-Martinez et al., 2005).
Com relação às diferenças eletrolíticas do plasma seminal, é importante lembrar que os espermatozoides saem de um ambiente pobre em bicarbonato como o epidídimo (3- 4mM) para um ambiente rico em bicarbonato como o plasma seminal do varrão (20-23mM/L). O íon bicarbonato é altamente relevante para a motilidade espermática, assim como para a indução de mudanças na estabilidade da membrana plasmática dos espermatozoides. Assim, é importante para a capacitação e reação acrossômica, eventos fundamentais para a fertilização do oócito (Rodriguez-Martinez
et al.,1990; Gadella e van Gestel, 2004).
As suas concentrações variam entre as frações, de 14mmol/L na fração pré- espermática, para 17mmol/L na FRE, alcançando na fração pós-espermática, acima de 30mmol/L.
A concentração de bicarbonato é menor na P1 (aproximadamente 13mmol/L), ou seja, a primeira população espermática do ejaculado não é diluída no PS com alta concentração de bicarbonato, sendo este fato implicado na menor motilidade encontrada para esta fração (Saravia et al., 2009).
Ao compará-lo com outros fluidos corporais, o PS de certos mamíferos como o do homem e o do cão contém alta concentração de zinco (Zn2+). A concentração de zinco na secreção vesicular do varrão é aproximadamente seis vezes maior (137µg/mL) que a encontrada no PS (22,5µg/mL). Assim, o zinco presente no PS é quase que totalmente oriundo das vesículas seminais. Existem diferenças marcantes quanto à concentração deste cátion no PS, nas diferentes espécies sobre as quais existem dados publicados. Alguns, como o gato, o touro e o carneiro têm
42 valores relativamente baixos (1,9; <2 e 2,8
µg/mL, respectivamente); enquanto o homem e o cão têm valores maiores (134 e 71,3-86,5 µg/mL, respectivamente) (Boursnell et al., 1972; Massaniy et al., 2003).
É interessante notar que, no varrão, o zinco provém da vesícula seminal, enquanto nas demais espécies origina-se da próstata. A sua menor concentração no PS em relação à secreção vesicular pode ser devido, especialmente, à absorção deste cátion pelos espermatozoides (Boursnell et al., 1972).
O zinco é secretado no PS paralelamente à emissão de frutose, sendo uma de suas funções a estabilização da cromatina espermática (Kvist e Bjorndahl, 1985; Bjorndahl e Kvist, 1990; Bjorndahl e Kvist, 2010).
Durante a sua passagem ao longo do sistema genital masculino e, especialmente, no epidídimo, os espermatozoides dos mamíferos passam por mudanças estruturais e bioquímicas que são consideradas como pré-requisitos para a aquisição de ótima capacidade fertilizante (Bedford e Calvin, 1974). Dentre essas mudanças, a formação progressiva de pontes dissulfeto nas protaminas nucleares tem sido enfatizada (Bedford, 1975).
As protaminas têm importância na morfogênese e estabilização da cabeça dos espermatozoides. Durante a espermiogênese no varrão, protaminas são incorporadas ao núcleo das espermátides alongadas de maneira sequencial e específica (Courtens
et al., 1988). Elas são solidamente
associadas com o DNA, formando a cromatina altamente condensada dos espermatozoides. Durante o trânsito pós- testicular, a estrutura da cromatina espermática dos espermatozoides é modificada, tornando-se progressivamente mais rígida, principalmente pela formação das forças estabilizadoras nas quais os grupos tiol das cisteínas tem participação.
Pontes envolvendo tiol e zinco também participam desta estabilização, uma vez que o zinco é capaz de “mascarar” tióis (Rodriguez-Martinez et al., 1990).
In vivo, a depleção do zinco leva à redução
da estabilidade, sendo seguido por uma “superestabilização” dependente da formação de pontes dissulfeto sem zinco, o que impede a descondensação normal da cromatina durante a fertilização (Rodriguez-Martinez et al., 1990).
Os espermatozoides do varrão, ejaculados na fração pós-espermática, onde a concentração de zinco é significativamente maior, se tornam mais superestabilizados do que aqueles contidos na P1, uma vez que há clara redução da capacidade de se descondensarem in vitro no decorrer da ejaculação. No entanto, a concentração total de Zn 2+ no plasma seminal não é um bom indicador do zinco livre que se equilibra com o conteúdo de zinco espermático. Um aumento concomitante das concentrações de citrato, que tem três sítios de ligação para o zinco em pH levemente alcalino, ou a presença de proteínas ligadoras de zinco podem resultar em um ambiente quelante de zinco (Kvist et al., 1990).
A interação das espermadesinas com outras moléculas e/ou outros solutos do PS pode determinar o comportamento protéico das mesmas. De fato, foi observado recentemente que na presença de concentrações fisiológicas de Zinco (Zn2+) no PS do varrão, a termoestabillidade do heterodímero PSPI/PSPII diminuiu significativamente, sendo promovida a sua dissociação. Apesar da integridade da PSPI/PSPII ser garantida pelas altas concentrações de PSPI e PSPII, sítios de ligação internos das subunidades podem ser expostos quando da diluição da proteína no sistema genital feminino (Campanero- Rhodes, 2006; Rodriguez-Martinez et al., 2009).
Diferenças nas características bioquímicas
43
principalmente, na relação
colesterol:fosfolípides insaturados (Darin- Bennet e White, 1977) são considerados os principais fatores explicando diferenças na sensibilidade à crioinjúria, existentes entre espécies (Peña et al., 2005).
A coexistência de diferentes subpopulações espermáticas é vastamente aceita pela comunidade científica atual. A origem destas subpopulações ainda não está clara, mas suspeita-se que correspondam à diferenças na formação individual dos
espermatozoides, durante a
espermatogênese, assim, como a sua diferença maturacional e de idade quando deixam a cauda do epidídimo na ejaculação (Abaigar et al., 1999; Peña et al., 2005). Como citado anteriormente, a qualidade espermática após a criopreservação ou ao resfriamento do sêmen do varrão, difere de acordo com a fração do PS em que os espermatozoides estão contidos (Peña et al., 2003, 2004b; Saravia et al., 2009; Alkmin, 2010). Além dos fatores discutidos anteriormente, outros podem estar relacionados a esta diferença, como súbitas diferenças morfométricas na morfologia da cabeça espermática. No trabalho de Peña e colaboradores (2005), demonstrou-se a existência de súbitas diferenças morfométricas entre os espermatozoides presentes no ejaculado de diferentes varrões.
É notável que quando comparações são feitas entre espécies, sobre a sua capacidade de resistir ao choque pelo frio, existem claras diferenças entre elas (Watson e
Plummer, 1985). Assim, os
espermatozoides das espécies mais resistentes, como o touro, são menores e mais arredondados. É então, plausível pensar que os espermatozoides podem variar em suas propriedades físicas dependendo da sua forma. Apesar da sua relação com vários outros fatores, a importância do formato é que existem provavelmente características herdadas
(Thruston et al., 2001), o que aponta para a possibilidade de se identificarem varrões com “boa” ou “má” congelabilidade, através do estudo morfométrico dos ejaculados (Quintero-Moreno et al., 2003; Peña et al., 2005).
2.3. Características físicas e morfológicas