Analyse  og  vurdering  av  data

Avaliações de atividade enzimática da Peroxidase (POD, EC 1.11.1.7) e concentração de compostos fenólicos totais foram efetuadas nos ‘Laboratórios de ‘Fisiologia vegetal’, pertencentes ao Departamento de Botânica (UNESP) Câmpus Botucatu.

Avaliações da atividade enzimática da UGPase (E.C.2.7.7.9) e seu perfil de aminoácidos foram realizadas nos ‘Laboratórios de genética molecular’ e ‘fisiologia vegetal’ pertencente à Unidad de Fruticultura, Centro de Investigación y Tecnologia Agroalimentaria

de Aragón (CITA), Saragoça, Comunidade Autônoma de Aragón, Espanha.

As análises bioquímicas foram realizadas utilizando-se amostras de caule das combinações copa/porta-enxerto e pé-francos. Cada amostra foi constituída de aproximadamente cinco (05) cm de caule contendo a região do enxerto (entre 15-20 cm do solo) e dos pé-francos a 20 cm de altura. As amostras foram coletadas no momento da enxertia, 15, 30 e 60 DAE. As coletas foram realizadas sempre no período da manhã e as amostras acondicionadas imediatamente em tubos tipo falcon, protegidos da luz, resfriadas em nitrogênio líquido e armazenadas em ultrafreezer até se processar as análises.

Para as análises da POD e Concentração de compostos fenólicos totais das combinações foram utilizadas nove (09) repetições de uma (01) planta, avaliadas em duas (02) épocas (30 e 60 DAE) e para as espécies pé-francos utilizou-se nove (09) repetições de uma (01) planta avaliadas em duas (2) épocas, 30 e 60 DAE. Para a atividade enzimática da UGPase das combinações foram utilizadas quatro (04) repetições de uma (01) planta avaliadas em duas (02) épocas, 30 e 60 DAE e para as espécies pé-francos utilizadas (04) repetições de uma (01) planta avaliadas em uma (01) época, momento antes da enxertia. Já para as avaliações do perfil de aminoácidos da enzima UGPase foi utilizada uma (01) única repetição para cada espécie pé-franco em uma (01) única época, 60 DAE.

5.12.4.1. Ensaio da atividade da peroxidase (POD, EC 1.11.1.7)

O extrato enzimático das amostras maceradas foi obtido segundo a metodologia descrita por Kar; Mishra (1976). O material vegetal (300mg) foi homogeneizado em 4,0 mL de tampão fosfato de potássio 0,1mol L-1 _{a pH 6,8. Após a homogeneização, as amostras}

foram colocadas para centrifugar por 10 minutos a 5000 g à 04°C, sendo então, o sobrenadante coletado em microtubos e armazenado em freezer a -20°C, para posterior determinação. A atividade da peroxidase (POD, EC 1.11.1.7) foi analisada seguindo o método descrito por Teisseire; Guy (2000). A reação foi conduzida a temperatura ambiente por 05

minutos. A formação de purpurogalina foi medida em espectrofotômetro UV-visível a 430 nm e seu coeficiente de extinção molar (2,5mmol L-1 _cm-1_{) foi usado para calcular a atividade}

específica da enzima, expressa em mmol de purpurogalina min-1 _mg-1 _{de proteína. Os teores}

de proteínas solúveis do extrato enzimático foram obtidos pelo método de Bradford (1976), sendo que as leituras de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro UV-visível a 595nm, utilizando-se caseína como proteína de referência.

5.12.4.2. Quantificação da concentração de compostos fenólicos totais

A quantificação dos compostos fenólicos totais foi realizada seguindo a metodologia descrita por Herrig et al. (2002), com algumas modificações. O material vegetal (250 mg) foi macerado em 5,0 mL de ácido clorídrico (HCl) 2N e, em seguida, esse macerado foi vertido em tubos de ensaio com tampa e fervido por 30 minutos. Após a fervura fez-se o resfriamento, colocando-se os frascos em gelo e água gelada por 03 minutos e, na sequência, as amostras foram centrifugadas a 5000 g, por 10 minutos, à 04°C.

Foi utilizado 100µL desse sobrenadante, diluído em 4500µL de água deionizada, no qual acrescentou-se 750 µL de carbonato de sódio (Na2CO3) 1,9M e 250µLde reagente

‘Folin ciocalteau’. Nesse método, o reagente de Folin-Ciocalteu (RFC), que consiste na mistura dos ácidos fosfomolíbdico e fosfotúngstico, em que o molibdênio se encontra no estado de oxidação (VI), formando um complexo de cor amarela (Na2MoO4.2H2O), reage

com compostos fenólicos, mas não de forma exclusiva, diminuindo seu estado de oxidação, e formando complexos de coloração azul com esses compostos.

Essa mistura foi mantida no escuro durante o período de 60 minutos. Após o tempo decorrido, foi realizada leitura no espectrofotômetro com um comprimento de onda de 750 nm. Foi utilizado o ácido ferúlico como padrão de referência, seguindo a metodologia descrita por Blum et al. (1991).

5.12.4.3. Ensaio de atividade UGPase (E.C. 2.7.7.9.)

A atividade enzimática da UDP-glicose pirofosforilase (UGPase) foi examinada seguindo a metodologia proposta por Ciereszko et al. (2001a), com pequenas modificações. Dois (02) µl de extrato proteíco foram misturados em tampão de extração contendo 100 mM de TRIS-HCl e 05 mM de MgCl2, 0,8 mM de NAD (solução "stock" a 10 mM), 0,8 mM de UDP- glicose, glicose 1,6-bifosfato, 04 unidades de fosfoglucomutase e glicose-6-fosfato

reação. A leitura da atividade UGPase foi determinada em 340nm por espectrofotômetro. Para os ensaios de atividade enzimática (n=9, ± erro padrão, E.P.). A atividade é descrita em mmol min-1 _{(g FW)}-1_.

5.12.4.4. Perfil de aminoácidos da UGPase (E.C. 2.7.7.9) 5.12.4.4.1. SDS-PAGE e MALDI-TOF

A proteína total do extrato vegetal foi separada por SDS-PAGE em um sistema contendo “resolving” gel 15% e “stacking” gel 04% de acordo com o procedimento de Laemmli et al. (1970). A separação foi realizada usando gel de 0,75 mm gel com as dimensões de 8,3 cm x 7,3 centímetros (Miniprotean II-System Bio-Rad®_{). Em cada poço do}

gel foi aplicado 24 mg de proteína e depois da eletroforese, os géis foram corados com

Comassie Brilliant Blue R-250 durante a noite (overnight). A análise de SDS-PAGE foi

realizado três vezes.

As análises foram realizadas com amostras de caule de pé-franco de atemoia, araticum-de-terra-fria, araticum-mirim e biribá, conforme proposto por Pina; Errea (2008). A potencial banda contendo a enzima UGPase (aproximadamente 55 kDa) foi recortada do gel e lavada várias vezes com água esterilizada. O mapeamento de peptídeos por MALDI-TOF acoplado à espectrômetro de massa foi realizada pelo serviço de proteômica CNB (‘Centro

Nacional de Biotecnología’, CSIC, Madrid, Espanha) e os dados obtidos foram analisados

utilizando o banco de dados de proteínas MASCOT (http://www. matrixscience.com). Consultas ao banco de dados foram realizadas usando os seguintes parâmetros tolerância máxima permitida de erro (50 ppm); máximo de uma (01) clivagem perdida para peptídeos trípticos e a carbamidometilação das cisteínas como modificações fixas.