4. Metode
4.4 Analyse av regelverk/retningslinjer for netteier og utbygger
Foi realizada a extração de RNA total a partir de tecido foliar de todos os biótipos de C. bonariensis a serem analisados: resistentes e suscetíveis à ação do glyphosate tendo sido tratados e não tratados com o herbicida (Figura 4.1).
Figura 4.1 - Gel 1,2% agarose contendo fragmentos de RNA extraído de tecidos dos diferentes biótipos de C. bonariensis (C.b na figura). res.: resistente;
susc.: suscetível.
Diferentes reações de RT-PCR foram preparadas para analisar a amplificação de trecho do cDNA dos genes alvo de estudo (EF1-α, EPSPS1, EPSPS2 e EPSPS3). Essas reações testariam a qualidade dos cDNAs sintetizados e também a especificidade dos primers sobre seu alvo de amplificação (amplificação de fragmentos únicos). Para tanto, cada amostra de cDNA sintetizada a partir dos mRNAs extraídos foi submetida separadamente a reações com os diferentes conjuntos de primers desenhados (Tabela 4.1).
A Figura 4.2, apresenta resultados de reação de PCR utilizando os primers (EF1alfa_F e EF1alfa_R) desenhados para amplificação do cDNA do gene EF1-α.
Não tratada tratada C.b res. C.b susc. C.b res. C.b susc.
Figura 4.2 - Gel 2% agarose contendo fragmentos de cDNA de C. bonariensis obtidos através de reação de PCR para o gene EF1-α. M: marcador de peso molecular de 50 pb (Invitrogen). CN: controle negativo. Todas as amostras apresentaram amplificação de fragmentos de aproximadamente 150 pb, o que era esperado
Os fragmentos amplificados a partir do cDNA gene EF1-α deveriam apresentar aproximadamente 150 pb. A eletroforese representada pela Figura 4.2 mostra que todas as amostras de cDNA apresentaram amplificação esperada, o que indica que os primers que haviam sido desenhados sobre a seqüência de Arabidopsis thaliana são eficazes para a utilização em C. bonariensis. A especificidade desse conjunto de primers também foi comprovada através do resultado do seqüenciamento dos fragmentos gerados. Os fragmentos obtidos apresentaram similaridade com o gene EF1-
α
(AK221176) de A.thaliana (Anexos B.1, B.2 e B.3).
A reação que utilizou os primers EPSP1_2_F e EPSP1_R (responsável pela amplificação de trecho do cDNA do gene EPSPS1) também foi realizada com êxito (Figura 4.3). C.b res. CN C.b susc. C.b res. C.b susc. M M 150 pb 50 pb 150 pb 50 pb Não tratada tratada
Figura 4.3 - Gel de 2% agarose contendo fragmentos de cDNA de C. bonariensis obtidos através de reação de PCR para o gene EPSPS1 com os primers EPSP1_2_F e EPSP1_R. M: marcador de peso molecular de 50 pb (Invitrogen). CN: controle negativo. Todas as amostras apresentaram amplificação de fragmentos de aproximadamente 150 pb, o que era esperado
Todas as amostras apresentaram amplificação de aproximadamente 150 pb, esperada para essa situação. A especificidade desse conjunto de primers também foi confirmada através do seqüenciamento dos fragmentos gerados, que apresentaram similaridade com a seqüência do gene EPSPS1 (AY545666) de C. canadensis, seqüência sobre a qual os primers foram desenhados.
Os experimentos realizados com os primers EPSPS1_2_F e EPSPS2_R, projetados para viabilizarem a amplificação de trecho do cDNA do gene EPSPS2 não obtiveram resultado esperado (dados não mostrados). Foi constatado que esse par de
primers não apresentou a especificidade necessária para poder ser utilizado na
condução dos experimentos seguintes (RT-qPCR). Dessa forma a análise desse gene com esse par de primers não foi levada adiante.
As seqüências os primers EPSP2art-F e EPSP2art-R derivam do artigo de Dinelli et al. (2006). Teoricamente esses primers deveriam ser responsáveis por amplificar apenas seqüência (816 pb) do cDNA do gene EPSPS2. Mas, foi verificado que uma região do gene EPSPS3 também poderia ser alvo de amplificação por EPSP2art-F e
150 pb 50 pb C.b res. CN C.b susc. C.b res. C.b susc. M M Não tratada tratada
EPSP2art-R (Anexo C). Os testes de amplificação realizados com esses primers até então não apresentaram amplificação de fragmentos de 800 pb (referentes à seqüência do cDNA de EPSPS2), mas apresentaram amplificação de fragmentos de aproximadamente 200 pb (que teoricamente se referem à seqüência do cDNA do gene
EPSPS3) (Figura 4.4).
Figura 4.4 - Gel 2% agarose contendo fragmentos de cDNA de C. bonariensis obtidos através de reação de PCR com os primers EPSP2art_F e EPSP2art_R, apresentando amplificação prevista apenas para região do gene EPSPS3 (aprox. 200 pb). M: marcador de peso molecular de 50 pb (Invitrogen). CN: controle negativo
Por outro lado o resultado da análise do seqüenciamento dos fragmentos gerados por essa reação indicou que as seqüências apresentavam trechos de similaridade tanto com o gene EPSPS2 (AY545667) quanto com o gene EPSPS3 (AY545668) de C.
canadensis. Uma comparação entre as seqüências dos genes depositadas no GenBank
mostrou que EPSPS3 apresenta quase total similaridade com trechos de EPSPS2 (Anexo B) (somente as regiões das seqüências que incluíam os sítios de ligações dos
primers estão apresentadas em anexo). C.b res. C.b susc. C.b res. C.b susc. CN M 200 pb 350 pb Não tratada tratada
Ainda em relação ao gene EPSPS3, foi obtido êxito nas reações de PCR utilizando os primers EPSP3_F e EPSP3_R (desenhados especificamente para amplificarem uma região de 154 pb do cDNA desse gene). A Figura 4.5 abaixo apresenta resultado de eletroforese em gel de uma dessas reações.
Figura 4.5 - Gel de 2% agarose contendo fragmentos de cDNA de C. bonariensis obtidos através de reação de PCR cm os primers EPSP3_F e EPSP3_R, apresentando amplificação de fragmentos de aproximadamente 150 pb.
M: marcador de peso molecular de 50 pb (Invitrogen). CN: controle
negativo
Os fragmentos gerados com essas reações de PCR também apresentaram seqüências similares tanto à região do gene EPSPS2 quanto a região do gene EPSPS3 de C. canadensis (Anexo B).
Não foi possível determinar sobre qual transcrito os pares de primers EPSPS2art_F e EPSPS2art_R e EPSPS3_F e EPSPS3_R se anelavam para viabilizarem as amplificações dos fragmentos, se sobre fragmentos de EPSPS2 ou
EPSPS3 ou se sobre ambos. Até então também não houve descrições na literatura que
indicassem que EPSPS2 e EPSPS3 possam se referir a genes distintos. Por outro lado, as comparações realizadas nesse trabalho entre as seqüências mostram um forte vínculo entre EPSPS2 e EPSPS3. Dessa forma, para as análises seguintes de RT-
C.b res. C.b susc. C.b res. C.b susc. CN M 150 pb 350 pb Não tratada tratada
qPCR assumiu-se que EPSPS2 e EPSPS3 se referiam ao mesmo gene e conseqüentemente ao mesmo transcrito presente nas amostras analisadas (chamado de EPSPS2/EPSPS3).
Em geral foi constatado que os primers desenhados a partir das seqüências dos genes EPSPS de C. canadensis foram capazes de amplificar seqüências de EPSPS de C. bonariensis. As análises das seqüências dos fragmentos gerados indicaram forte similaridade entre os genes EPSPS de C. canadensis e C. bonariensis (e com A.
thaliana no caso do gene EF1-
α
), o que sugere, particularmente baseado nessascomparações, que esses genes são evolutivamente conservados entre essas espécies. Foi constatado que os primers testados também apresentaram a especificidade necessária para serem utilizados nos experimentos de RT-qPCR, uma vez que proporcionaram a amplificação apenas de fragmentos únicos (exceto o par EPSPS1_2_F e EPSPS2_R).
Todos os experimentos realizados também ajudaram a atestar a viabilidade dos cDNAs sintetizados a partir dos RNAs mensageiros extraídos dos tecidos dos biótipos analisados, possibilitando sua utilização nos experimentos de RT-qPCR.
Após confirmada a viabilidade dos cDNAs sintetizados e dos primers desenhados, via reações de RT-PCR, foi realizado o delineamento dos experimentos das análises de RT-qPCR para análise da expressão gênica. Inicialmente foram realizadas reações com pool de cDNA das amostras objetivando encontrar as melhores condições para se obter os reais valores de eficiência dos primers. Os conjuntos de
primers submetidos às reações foram EF1alfa_F e EF1alfa_R (gene EF1-
α
),EPSP1_2_F e EPSP1_R (gene EPSPS1), EPSPS2art_F e EPSPS2art_R (gene
EPSPS2/EPSPS3), e EPSP3_F e EPSP3_R (gene EPSPS2/EPSPS3). Em seguida
foram conduzidas reações com cada amostra de cDNA (C. bonariensis resistente e suscetível submetidas ou não ao tratamento com glyphosate para que fosse possível realizar as análises de expressão dos genes. A Tabela 4.2 apresenta a seguir os valores de eficiência obtidos para cada par de primers submetido aos testes.
Tabela 4.2 - Valores de eficiência obtidos para pares de primers submetidos aos experimentos de RT-qPCR
Nome do primer (gene)
Valor de eficiência obtido (somado a 1) EPSP1_2_F (EPSPS1) 2,008 EPSP1_R EPSP2art_F (EPSPS2/EPSPS3) 1,805 EPSP2art_R EPSP3_F (EPSPS2/EPSPS3) 2,060 EPSP3_R EF1alfa_F (EF1α) 2,000 EF1alfa_R
O Anexo D apresenta as curvas de “melting” das reações realizadas. Fragmentos específicos foram amplificados em todas as situações.
Os dados foram analisados de acordo com Pfaffl (2001). A Figura 4.6 abaixo apresenta gráfico que mostra os níveis relativos de expressão de cada gene analisado para cada amostra. A amostra calibradora, que serve de base para as comparações foi escolhida arbitrariamente entre as amostras, no caso C. bonariensis suscetível não submetida ao tratamento com glyphosate (“Cb S n trat” na figura).
1,03 0,90 1,78 1,00 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
C b R trat (1) C b S trat (2) C b R n trat (5) C b S n trat (6)
Figura 4.6 - Expressão gênica relativa de EPSPS1 em tecidos de C. bonariensis resistente (Cb R) ou suscetível (Cb S) submetidos (trat) ou não (n trat) ao tratamento com glyphosate
A análise dos dados apresentados nesse gráfico permite propor que a expressão do gene EPSPS1 em C. bonariensis possa estar relacionada à condição de resistência da planta ao tratamento com glyphosate. Nos biótipos resistentes (na figura, ‘Cb R n trat’ e ‘Cb R trat’) o nível de expressão gênica aparece sempre maior em relação ao nível de expressão dos biótipos suscetíveis (na figura, ‘Cb S n trat’ e ‘Cb S trat’). Também é observado que ocorre uma queda na produção de transcritos desse gene após 24 horas da aplicação do herbicida glyphosate, mas ainda assim o biótipo resistente apresenta maior nível de expressão se comparado ao biótipo suscetível.
A Figura 4.7 apresenta diferentes formas de comparação do nível de expressão de EPSPS1, tendo como base sempre os mesmos dados. Para cada caso alterou-se apenas a amostra utilizada como calibradora. As relações observadas continuam as mesmas.
Nível de expressão relativa do ge
ne
Figura 4.7 – Expressão gênica relativa de EPSPS1 em tecidos de C. bonariensis resistente (Cb R) ou suscetível (Cb S) submetidos (trat) ou não (n trat) ao tratamento com glyphosate. Em A: comparação entre biótipos suscetíveis com e sem a aplicação de glyphosate. Em B: comparação entre biótipos resistentes com e sem a aplicação de glyphosate. Em C: comparação entre biótipos resistente e suscetível, ambos submetidos à aplicação de glyphosate. Em D: comparação entre biótipos resistente e suscetível, ambos não submetidos à aplicação de glyphosate
A Figura 4.8 abaixo apresenta o resultado da análise da expressão do gene
EPSPS2/EPSPS3 (analisado duplamente devido aos dois conjuntos de primers
utilizados). A amostra calibradora utilizada novamente foi C. bonariensis suscetível sem tratamento com glyphosate (“Cb S n trat” na figura).
Nív e l de e x p ressã o r e lat iv a do ge n e EP S P S 1 A B C D
1,07 0,80 0,87 1,00 0,58 0,69 3,16 1,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
C b R trat (1) C b S trat (2) C b R n trat (5) C b S n trat (6)
G ene E P S P S 3 (E P S P S 2_a rt) G ene E P S P S 3
Figura 4.8 - Expressão gênica relativa de EPSPS2/EPSPS3 (analisado duplamente pelos dois pares de primers EPSPS2_art e EPSPS3) em tecidos de C.
bonariensis resistente (Cb R) ou suscetível (Cb S) submetidos (trat) ou
não (n trat) ao tratamento com glyphosate
A mesma relação observada em relação a EPSPS1 pode ser observada para o gene EPSPS2/EPSPS3 (somente a partir da interpretação dos dados provindos da utilização do conjunto de primers EPSPS3_F e EPSPS3_R), ou seja, é possível que um alto nível de expressão basal do gene EPSPS2/EPSPS3 também possa ser em parte responsável por conferir a resistência à ação do glyphosate em C. bonariensis. Aparentemente o nível de expressão do transcrito desse gene também diminui após submeter ambos os biótipos ao tratamento com o herbicida.
Era de se esperar que os dados oriundos dos experimentos com
EPSPS2/EPSPS3 com os diferentes pares de primers apresentassem resultados
equivalentes, uma vez que ambos os pares de primers deveriam se ligar sobre o mesmo transcrito (a análise das curvas de “melting” das duas reações (Anexo D) ajudam a confirmar a possibilidade de EPSPS2 e EPSPS3 se referirem a um mesmo transcrito). A diferença nos níveis de expressão observados entre as reações se deve possivelmente aos diferentes valores de eficiência encontrados de cada conjunto de primer. Valores
Nível de expressão relativa do ge
ne
muito distantes como os obtidos (Tabela 4.2) podem ajudar a alcançar resultados discrepantes quando comparados.
Todas as análises realizadas com os genes EPSPS de C. bonariensis foram feitas uma única vez. Portanto os dados apresentados refletem apenas uma suposição do nível de expressão desses genes. Repetições biológicas devem ser realizadas para confirmar a tendência desses níveis de expressão para assim poder definitivamente atrelar ou não a resistência ao glyphosate com a expressão dos genes EPSPS em C.
bonariensis.
Avaliando o nível de expressão gênica de EPSPS2 em C. bonariensis, Dinelli et al. (2008) também sugeriram que o nível basal dos transcritos em biótipos resistentes de
C. bonariensis eram de 2-3 vezes mais altos que aqueles observados nos biótipos
susceptíveis (antes da aplicação de glyphosate) e que esse fato, aliado com a forma de translocação do glyphosate nessa espécie, ajudam a diminuir a inibição de EPSPS pelo herbicida.
Estudos já realizados com C. canadensis também acusam um maior nível de expressão do mRNA de EPSPS2 (2-3 vezes) em biótipos resistentes sem tratamento com glyphosate, corroborando os dados apresentados. Em C. canadensis a síntese de transcritos EPSPS não foi induzida em resposta aplicação do herbicida (DINELLI et al., 2006).
Outros trabalhos já haviam estudado a relação entre expressão de EPSPS e resistência ao tratamento com glyphosate em outras espécies. Na primeira espécie em que foi detectada a resistência ao herbicida, Lolium rigidum, estudos indicaram que mecanismos baseados na enzima EPSPS não estavam envolvidos com a resistência ao glyphosate (BAERSON et al., 2002; LORRAINE-COLWILL et al., 2001; FENG et al., 1999; LORAINNE-COLWILL et al., 1999). Ao contrário, em Dicliptera chianensis o aumento do nível de EPSPS em tecidos da planta foi citado como um dos três tipos de mecanismos responsáveis por conferir resistência ao herbicida (YUAN; CHAING; CHEN, 2002). Em Eleusine indica, espécie que também apresenta biótipos resistentes, foi constatado que a resistência está relacionada a uma mutação na seqüência de EPSPS, que alterou um aminoácido importante situado no sítio de ligação entre a enzima e o herbicida (NG et al., 2003; BAERSON et al., 2002). Dinelli et al. (2008) também sugerem
a possibilidade de uma mutação pontual no sítio alvo de EPSPS estar relacionada à resistência em C. bonariensis. Mas, de acordo com o revisado por Powles e Preston (2006), é importante enfatizar que não é válido extrapolar que a resistência ao glyphosate poderá sempre ser relacionada a mutações no sítio de ação da enzima ou a outras mutações em geral.