EC (2002) preconiza a determinação dos parâmetros de desempenho limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ) em processos de validação, os quais têm sido extensivamente estudados para aplicação em ensaios de resíduos de drogas veterinárias em alimentos de origem animal, com a intenção de estabelecer presença ou ausência de substâncias banidas ou regulamentadas (FAJGELJ & AMBRUS, 2000).
Os experimentos para determinação de CCα e CCβ envolvem ensaios com diversos níveis de concentração ou com um único nível de concentração. No primeiro caso são preparadas curvas de calibração de amostras adicionadas (ISO, 1997 b; ISO, 2000; EC, 2002). No segundo, são realizados ensaios com 20 replicatas de amostras brancas para analitos proibidos ou 20 replicatas de amostras adicionadas no limite máximo permitido para analitos permitidos para estimativa do CCα e ensaios com 20 replicatas de amostras adicionadas no limite de decisão para estimativa da CCβ (EC, 2002). Os ensaios com curvas de amostras adicionadas apresentam a vantagem de englobarem diversos níveis de concentração, além da possibilidade dos dados serem obtidos dos experimentos com amostras adicionadas para avaliação de exatidão e precisão, sem necessidade de delineamento experimental específico para estimativa de
CCα e CCβ.
Há várias formas de cálculo de CCα e CCβ descritas na literatura (ISO, 1997 b; ISO, 2000; EC, 2002; ANTIGNAC et al., 2003; VAN LOCO & BEERNAERT, 2003; PECORELLI et al., 2004; VAN OVERMEIRE et al., 2004). As estimativas de CCα e CCβ, a partir de experimentos com um único nível de concentração, são obtidas pela soma da concentração correspondente ao limite de decisão mais 1,64 vezes o desvio padrão de reprodutibilidade parcial e pelo valor do limite de decisão mais 1,64 vezes seu desvio padrão, respectivamente. Já as estimativas destes parâmetros por meio de experimentos com curvas de calibração, conforme descrito pela ISO 11843 (ISO, 1997 b; ISO, 2000) e pela EC (2002), tratam as bandas em torno da regressão como se fossem retas, quando na verdade são hipérboles. Este procedimento inclui a construção de três curvas e uso destas curvas para estimativa dos parâmetros de desempenho, sendo: i) níveis de concentração estudados versus sinal médio obtido em cada nível; ii) níveis de concentração estudados versus sinal médio obtido em cada nível mais 1,64 vezes o desvio padrão de reprodutibilidade parcial; e iii) níveis de concentração estudados versus sinal médio obtido em cada nível menos 1,64 vezes o desvio padrão de reprodutibilidade parcial. VAN LOCO & BEERNAERT (2003) propõem fórmulas para estimativa direta de
CCα e CCβ, baseadas no trabalho original de HUBAUX & VOS (1970), que dispensam a construção de curvas das bandas em torno da regressão e não assumem que estas bandas sejam lineares.
122 negativos (erro tipo β) de 50 %. A segunda, escola baseada em testes de hipóteses, considera valores independentes para os dois tipos de erro (CURRIE, 1999; DESIMONI, 2004). Em concordância com a segunda escola, ANTIGNAC et al. (2003) estabelecem os seguintes critérios de interpretação: i) para resultados menores que os valores estabelecidos para CCα, as amostras são declaradas como conformes ou com analitos em concentrações inferiores ao limite máximo estabelecido, com um nível de confiança de (1−α); ii) para resultados maiores ou iguais aos valores estimados para CCβ, as amostras são declaradas como não-conformes ou com analito presente em concentrações superiores ao limite máximo, com uma probabilidade de (1−β); e iii) existe uma faixa de incerteza estatística entre os valores de CCα e CCβ. Apesar da EC (2002) levar em conta a estimativa destes parâmetros considerando ambos os tipos de erro, somente considera CCα como critério de conformidade na interpretação dos resultados, sugerindo que valores menores que os estabelecidos para CCα sejam declarados como conformes e maiores ou iguais a CCα como não-conformes.
3 PROCEDIMENTO PROPOSTO
O procedimento para validação intralaboratorial de métodos quantitativos e qualitativos proposto neste trabalho, para aplicação em análises de alimentos, adotou a forma de validação direta com uso de padrões ou materiais de referência. Isto porque a validação comparativa tem a desvantagem de requerer que o laboratório tenha condições operacionais de executar um método de referência, além do método em validação.
Na validação de métodos quantitativos foram considerados parâmetros como linearidade, efeitos de matriz, seletividade, exatidão, precisão e limites. O processo foi dividido em três delineamentos experimentais distintos sendo: i) ensaios com curvas de calibração do analito em solventes para determinação da linearidade; ii) ensaios com uma curva de calibração do analito em solventes e outra do analito em matriz para verificação dos efeitos de matriz; e iii) ensaios com curvas de calibração (do analito em solventes, em matriz ou extratos sem matriz, dependendo dos resultados dos estudos de efeitos de matriz), amostras brancas e amostras adicionadas ou materiais de referência para verificação da seletividade, exatidão, precisão e limites (Figura I.1).
Para métodos qualitativos foram estudados identificação do analito, seletividade e limite de detecção, sendo dois delineamentos experimentais: i) ensaios com padrões ou materiais de referência para determinação das características de identificação do analito;
Avaliação da linearidade Avaliação dos efeitos de matriz Avaliação da seletividade, exatidão, precisão e limites
e ii) ensaios com padrões ou materiais de referência, amostras brancas e amostras adicionadas para verificação da seletividade e do limite de detecção (Figura I.2).
O procedimento sugerido assumiu que os laboratórios tinham sistemas de gestão da qualidade devidamente implementados, com base nos requisitos da norma ISO/IEC 17025 (ISO, 2005 b). O estabelecimento dos delineamentos experimentais e a seleção das ferramentas para análises de dados foram balizados pela fundamentação teórica apresentada no item 2, assim como por aspectos de eficiência, praticidade e facilidade. Os delineamentos experimentais sugeridos basearam-se em princípios de representatividade, enquanto as análises de dados sugeridas foram fundamentadas na verificação prévia das premissas relativas aos testes estatísticos selecionados. O nível de significância adotado nos testes de hipóteses foi α = 0,05.
Figura I.1 - Experimentos para validação de métodos quantitativos, incluindo formas de Experimento 1
(ensaios com curvas do analito em solventes)
Experimento 2
(ensaios com curvas do analito em solventes e em matriz)
Experimento 3
(ensaios com curvas do analito, amostrasbrancas e adicionadas
ou materiais de referência)
Adequação para uso
124 Identificação do analito Avaliação da seletividade e limite de detecção
Figura I.2 - Experimentos para validação de métodos qualitativos, incluindo formas de
validação e abrangência em termos de parâmetros de desempenho avaliados.