K AMERA / OPTISK UTSTYR

Para analisar o perfil proteico dos extratos de EPS, esses, após concentração das amostras, foram aplicados em géis SDS-PAGE. Como primeiro método de escolha para diminuir o volume dos extratos, foi escolhida a técnica de liofilização. Como visto na figura 10, o procedimento não foi eficaz para a obtenção de amostras com a concentração necessária para que as bandas pudessem ser visualizadas através do método de coloração por Coomassie.

Uma razão para esse fato pode ter sido a degradação das amostras durante o processo, o que seria pouco provável, levando em consideração as características da técnica (Ó´FÁGÁIN, 2011). Uma razão mais plausível seria que ao final da liofilização, o volume das amostras pode não ter sido reduzido o bastante. Devido à grande quantidade de matéria presente, o volume mínimo em que os extratos liofilizados puderam ser ressuspendidos variou entre 0,5 mL e 1,5 mL. Levando em conta a concentração de proteínas encontrada e que apenas uma pequena fração é aplicada no gel, a quantidade total de cada proteína não alcançou o valor mínimo para detecção.

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Figura 10: SDS-PAGE dos extratos de EPS liofilizados. 1- centrifugação; 2- CER; 3- NaOH; 4- formaldeído+NaOH; 5- aquecimento; 6- formaldeído+aquecimento; 7- EDTA; 8- Na2S.

Sendo assim, as proteínas foram concentradas por meio de precipitação com sulfato de amônio. A escolha desse método foi baseada nos resultados de Park e colaboradores (2008), os quais, ao trabalharem com extração de EPS de lodo aeróbio, reportaram que entre outros métodos de precipitação – incluindo, acetona ou ácido tricloroacético – o uso de (NH4)2SO2

mostrou os melhores resultados. Para o nosso propósito, uma vantagem desse método sobre o de liofilização é que, ao mesmo tempo em que o volume das amostras é reduzido, ocorre um processo de concentração mais seletivo para moléculas com características hidrofóbicas do que para as demais – como carboidratos e ácidos húmicos, por exemplo. Esse procedimento, seguido de diálise e liofilização, permitiu que as amostras fossem ressuspendidas em volumes muito menores (em média 70 µL) e que bandas fossem visualizadas para todos os extratos (Figura 11).

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Figura 11: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de amônio. M- marcador de massa molecular; 1- centrifugação; 2- CER; 3- NaOH; 4- formaldeído+NaOH; 5- aquecimento; 6- formaldeído+aquecimento; 7- EDTA; 8- Na2S. A seta indica a banda identificada por LC-MS/MS.

Não obstante as variações na eficiência de extração e no perfil dos cromatogramas apresentados anteriormente, visualmente não são notadas diferenças significativas na quantidade de proteínas entre os métodos. Além disso, muitas bandas são comuns a todos os extratos, inclusive ao método de centrifugação empregado como controle, o qual, segundo outros estudos é o método mais brando de extração de EPS e não ocasionaria o rompimento das células durante o processo (SHENG et al., 2010). Portanto, as proteínas visualizadas na figura 11 podem ser consideradas de fato como constituintes da matriz extracelular. Dessas observações, pode-se supor que mesmo para métodos mais severos e eficientes de extração, como os que fazem uso de NaOH ou aquecimento, os danos ocasionados às células foram mínimos. Por outro lado, os dados indicam que, para estudos sobre o proteoma dos EPS de lodo anaeróbio, métodos menos agressivos possam ser usados. Isso evitaria possíveis modificações nas cadeias laterais de aminoácidos causadas por agentes químicos, como as que ocorrem quando do uso do formaldeído (FOX et al., 1985). Tais modificações, por alterarem a massa dos resíduos, podem dificultar a posterior identificação das proteínas por espectrometria de massas.

Em sua maioria, as proteínas precipitadas apresentaram alta massa molecular e encontram-se acima de 20 kDa, sendo muitas com aproximadamente 100 kDa. Curiosamente, esses resultados diferem do encontrado nas separações por cromatografia de exclusão, nas

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quais não são notados picos de alta intensidade nessa região. Essa discrepância pode ser explicada pelo fato de que nas análises por SEC, os polímeros encontram-se em um estado mais aproximado de seu estado natural. Por outro lado, o tratamento das amostras que precede sua aplicação nos géis SDS-PAGE propicia o rompimento de interações e a completa desnaturação proteica (RABILLOUD et al., 2009). Essa diferença também foi mostrada por Park e colaboradores (2008), os quais, ao avaliarem o tamanho de moléculas EPS por meio de fracionamento por ultrafiltração, encontraram alta porcentagem de proteínas maiores que 500 kDa e menores que 3 kDa, enquanto que as análises por SDS-PAGE revelaram a ocorrência de proteínas com tamanhos intermediários.

A ausência de proteínas de baixa massa molecular pode ser explicada como um viés da técnica de precipitação por sulfato de amônio, visto que o sucesso do método depende de características das moléculas a serem precipitadas. Proteínas maiores ou mais hidrofóbicas são desnaturadas mais facilmente quando da adição do sal, sendo mais propícias a interagirem e tornarem-se insolúveis (BURGESS, 2009). Outra explicação seria a escolha da fração encaminhada para centrifugação. Imediatamente após a adição do sal, parte dos compostos se aglomerou na superfície da solução, o que pode ser notado pela formação de um halo de coloração mais escura, diminuindo a turbidez do restante da solução. Visto que essa coloração é uma característica de substâncias húmicas (HANREICH et al., 2012) e que essas interagem com corantes usados em géis SDS-PAGE (AOYAMA, 2006), o halo em questão foi removido antes da etapa de centrifugação, com o intuito de diminuir o background das amostras. Para testar essa suposição, três dos protocolos de extração (aquecimento, EDTA e formaldeído + aquecimento) foram repetidos e, dessa vez, todo o material presente nos tubos foi centrifugado. Na figura 12, ao analisar as canaletas 1, 2 e 3, correspondentes aos extratos submetidos a uma outra eletroforese em SDS-PAGE, nota-se a presença de um grupo de proteínas de baixa massa molecular (menores que 29 kDa), indicando que essas também fazem parte do aglomerado removido na precipitação anterior. Além disso, dessa vez podem ser notadas diferenças maiores entre os extratos, como a ocorrência da banda ‘s1’, presente em alta concentração apenas para o método de extração com EDTA.

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Figura 12: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de amônio e centrifugados sem remoção da fração superior. M- marcador de massa molecular; 1- aquecimento; 2- EDTA; 3- formaldeído+aquecimento.

Como visto acima, e de acordo com Bastida e colaboradores (2009) entre as dificuldades encontradas para o estudo de proteínas oriundas de comunidades naturais a principal delas seria o desenvolvimento de protocolos que conciliem a eliminação de interferentes com a obtenção de amostras representativas do proteoma extracelular.

Das bandas submetidas à identificação, apenas a banda indicada pela seta (Figura 11) retornou resultado positivo. Mesmo assim, essa foi identificada como uma proteína hipotética de bactérias da família Acetobacteriaceae. A sequência fornecida pelo software MASCOT foi submetida à busca de homologia pelo algoritmo BLAST. A única sequência não hipotética encontrada apresentou apenas 34 % de identidade e refere-se à proteína CelD, uma das constituintes do celulossomo – complexo bacteriano de degradação de material celulósico (DOI et al., 2003) – e apesar de não apresentarem relação direta com a formação de biofilmes podem ser importantes para a degradação extracelular de carboidratos complexos, ou mesmo para a estruturação da matriz, sem função enzimática. Em um trabalho recente, Albertsen e colaboradores (2013) reportaram que proteínas diretamente envolvidas no desenvolvimento dos EPS, apesar de serem detectadas em culturas puras, não foram encontradas em EPS de lodo ativado, principalmente devido ao baixo rendimento das extrações para esse tipo de

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amostra. Por outro lado, os autores encontraram proteínas intracelulares, provavelmente liberadas após morte celular, entre os componentes dos EPS.