V ALG AV DATA

O espectrômetro VARIAN de 200 MHz com magneto OXFORD de 4,7 T, como qualquer outro espectrômetro de RMN, consiste em uma fonte de radiação eletromagnética que atua sobre a amostra a ser estudada. Além disso, também é necessário um magneto para criar uma indução magnética, B0, estável e homogênea em

toda a amostra. O espectrômetro consiste principalmente das seguintes partes: magneto, probe, fontes de radiofrequência, amplificadores, conversor analógico-digital e um computador.

Atualmente, o campo magnético estático é fornecido por um magneto supercondutor. O solenóide que produz o campo é submerso em Hélio líquido para que a resistência elétrica da liga metálica que compõe o fio seja igual a zero. O ambiente de Hélio é circundado por um ambiente de Nitrogênio líquido para diminuir as perdas por evaporação de Hélio, pois o Nitrogênio minimiza a diferença de temperatura entre o Hélio líquido e a sala onde se encontra o espectrômetro. Também existem bobinas adicionais, que são colocadas no ambiente de Hélio líquido a fim de corrigir distorções na homogeneidade do campo (bobinas de shim).

O probe é uma das partes mais delicadas do equipamento, pois nele se encontra a bobina de transmissão e recepção. Tal bobina encontra-se no meio do campo magnético. Uma vez baixado o spinner (suporte no qual é colocado o tubo padrão contendo a amostra, que pode girar em torno de seu eixo para aumentar a homogeneidade transversal do campo magnético) o tubo de ressonância é posicionado de tal forma que o líquido dentro dele (amostra) é coberto pela bobina de transmissão/recepção completamente. É importante lembrar que a bobina de transmissão/recepção não deve ser confundida com as bobinas de homogeneização do campo magnético. O probe é conectado ao pré-amplificador, que está normalmente localizado próximo ao magneto e faz a primeira amplificação do sinal.

As fontes de radiofrequência são componentes eletrônicos que produzem ondas senoidais em frequências apropriadas. As fontes atuais são completamente digitais. Já os amplificadores aumentam os sinais advindos das fontes de radiofrequência. Ele funciona numa variação de 50 a 100 Watts para amostras sólidas e cerca de 10 Watts para amostras líquidas.

O conversor analógico-digital é necessário, pois os sinais são gerados de forma analógica, mas devem estar na forma digital para que o computador possa fazer a transforma de Fourier e transformar o FID em espectro.

Figura 20: Figura esquemática do magneto.

6.2 Preparação de Amostras

O primeiro passo para preparação de uma amostra é coletar 12 mL de sangue em tubos de parede revestida com EDTA, depois centrifuga-se o sangue a 1200 rpm durante 15 minutos em temperatura ambiente. Com esse procedimento consegue-se um rendimento de aproximadamente 5 ml de plasma. Após centrifugado, o plasma é armazenado a -80°C no Laboratório de Imunofísiopatologia ICB USP, ficando assim disponível. Quando necessário esse plasma é descongelado e se retira uma quantidade de aproximadamente 0,7 mL separada em um eppendorf que é guardada no freezer a -16°C do Laboratório de Ressonância Magnética do IFUSP.

Para deixar a amostra pronta para a aquisição dos espectros descongela-se o plasma contido no eppendorf e coloca-se seu conteúdo no tubo porta amostra de 5 mm do espectrômetro. Feito isso, é colocado dentro do tudo maior o tubo capilar coaxial selado com marcador interno. Este tubo apresenta 1,5 mm de diâmetro e contém uma solução de água deuterada com TSP (8mmol/L). O TSP é usado para normalizar as amplitudes dos picos de ressonância dos espectros e ajustar o deslocamento químico (įTSP = 0) e água deuterada é necessária para fazer o “lock” da frequência de ressonância

do espectrômetro.

Depois de preparada a amostra, encaixa-se o tubo padrão do espectrômetro no

spinner e desliza-se este pelo upper barrel até o centro do magneto onde a amostra ficará na região de campo magnético mais uniforme possível.

Para simular a temperatura corporal humana (aproximadamente 37ºC), utilizou- se o sistema de ventilação da amostra conectado a um fluxo de ar aquecido que foi previamente calibrado para chegar ao valor de 37ºC.

Além de preparadas amostras com plasma, preparou-se também uma amostra de 28 mg de albumina bovina (96% de pureza, SIGMA ALDRICH) que foi diluída diretamente em 0,7 ml água deuterada com TSP, sem a necessidade de se utilizar o tubo capilar com marcador interno.

6.3 Preparação Para Aquisição do Espectro

Agora com a amostra bem posicionada e nas condições ideais inicia-se o processo de lock do deutério. O sistema de lock é importante, pois gera correções para a intensidade do campo magnético B0 de tal forma que a frequência de ressonância do 1H

referência ou padrão para as outras ressonâncias dos hidrogênios. Se este sistema não é ativado quando a amostra é colocada no magneto, ocorrem variações nas frequências de ressonâncias.

Agora, com o lock adequado, é iniciado o ajuste do shim. Este ajuste é realizado através de um conjunto de bobinas geométricas nas quais se ajustam os valores de corrente de modo que o campo magnético resultante tende a minimizar as distorções do campo principal B0. Sabendo-se que as frequências de precessão são proporcionais a

intensidade do campo magnético B0, o shim é responsável pela homogeneidade que

deve ser a maior possível ao longo do volume da amostra. Se o campo magnético não for altamente homogêneo, a intensidade do campo efetivo em diferentes volumes da amostra será diferente, isso levará a um considerável alargamento da linha do espectro. Por isso, antes de efetuar as medidas, é fundamental ajustar o shim, que pode ser conferido pela largura de linha à meia altura do sinal da água.

6.4 Sequência de Pulso CPMG

A sequência de pulso utilizada para gerar os espetros foi a CPMG (Carr-Purcell- Meiboom-Gill) antecedida por um pulso de inversão:

Figura 22: Esquema de pulsos utilizados com seus respectivos tempos de excitação e relaxação.

Tx refere-se ao núcleo que esta sendo medido (1H); o parâmetro d1 é o tempo de

espera depois da aquisição do sinal FID; p180° é o pulso de 180° aplicado no plano xy utilizado para inverter o sinal da magnetização para o eixo –z; inv é o tempo necessário para filtrar magnetizações indesejadas; p90°x é o pulso de 90° aplicado sobre o eixo x

para focalizar o vetor de magnetização no eixo y; IJ é metade do tempo de eco (o primeiro IJ é o tempo da defasagem dos vetores de magnetização depois do pulso de 90°

180°); p180°y é o pulso de 180° aplicado sobre o eixo y para novamente refocalizar os

vetores de magnetização sobre o eixo y, agora sem a interferência da não homogeneidade de campo B0, bt é o tempo total para o processo de relaxação spin-spin

(T2), ele pode ser compreendido pela seguinte expressão: bt =2 n. .τ , onde n é o número

de transientes que no nosso caso foram 40 e IJ é a metade do tempo de eco.

6.5 Exportando os Espectros

Após ajustar a fase dos espectros e referenciar o pico do TSP para zero no eixo x e 1 no eixo y, exporta-se a tabela de pontos que geram os espectros do programa VNMR (Varian Nuclear Magnetic Resonance) para o programa Microcal Oringin 6.0. Com os dados no programa Microcal Origin utilizou-se diversas ferramentas matemáticas, as quais ajudaram na visualização e interpretação dos resultados.