5. Formål ved å bruke fett i hestens rasjon
5.2 Adaptsjon til fett og responsen på trening
Os microssatélites D9S52, D9S15 e D9S196 geraram produtos de 213- 229 pb, 195-209 pb e 254-260 pb, respectivamente, e apresentaram padrões iguais nas lesões e tecidos controle em todos os pacientes estudados (Anexo G). O microssatélite D6S251 gerou produto de 144-162 pb, tendo evidenciado alterações em 20 % das lesões (Tabela 5).
No total, foram detectadas treze alterações, incluindo 4 LOH e 9 MSI. Deste total, o CEC I (paciente 21) apresentou quatro microssatélites alterados (2 LOH e 2 MSI), e o CEC III (paciente 258) apresentou três alterações (MSI), dentre os nove microssatélites estudados nos dois casos.
Cerca de 25 % das QAs e 25 % dos CECs apresentaram LOH e/ou MSI evidenciados com pelo menos um microssatélite. Não houve associação entre o grau histológico dos tumores e a presença de LOH ou MSI.
Nenhuma amostra de CBC mostrou-se alterada, comparada ao respectivo controle.
Tabela 5 - Total de pacientes, LOH e MSI em cada paciente por microssatélite estudado
D6S 251 252
n1 LOH2 MSI3 %4 n1 MSI3 %4 QA 8 - 1201 12,5 8 - -
CECI 8 121 - 12,5 9 - -
CECII 10 222, 234 1258 30 9 - -
CECIII 4 - 1258 25 4 1258 25
CBC 0 - - - 3 - -
1 Nº de tumores estudados por grau histológico em cada microssatélite
2 Nº de lesões com LOH (os números subscritos referem-se aos pacientes portadores da
alteração)
3 Nº de lesões com MSI (os números subscritos referem-se aos pacientes portadores da
alteração)
4 Porcentagem de pacientes que apresentaram alterações (LOH + MSI), submetidos a teste
estatístico (Anexo H) D9S 15 50 52 180 196 n1 n1 MSI3 %4 n1 n1 MSI3 %4 n1 QA 8 7 1261 14 6 6 - - 8 CECI 9 9 - - 9 9 121 11 9 CECII 9 9 - - 9 9 - - 9 CECIII 4 4 - - 4 4 1258 25 4 CBC 3 2 - - 3 2 - - 2 D9S 280 287 n1 MSI3 %4 n1 LOH2 %4 QA 4 - - 7 - - CECI 8 121 12,5 8 121 12,5 CECII 9 - - 9 - - CECIII 4 1239 25 4 - - CBC 1 - - 3 - -
4.2 RAPD
De maneira geral, os padrões de tecido normal, adjacente ao tumor, e tumor são mais comparáveis entre si do que com o padrão de RAPD obtido dos leucócitos. Isto pode estar relacionado à heterogeneidade de tipos de leucócitos presentes no sangue.
4.2.1 “Primer” OPA-2
As lesões dos pacientes 274 QA, 234 QA, 275 QA, 252 QA, 233 CEC I, 221 CEC II, 234 CEC II E 249 CEC II (Figura 14) apresentaram padrões iguais aos respectivos controles com este “primer”. Os CBCs dos pacientes 261 e 275 também apresentaram padrões iguais aos seus respectivos controles.
O Gráfico 1 mostra uma comparação entre os diferentes tipos histológicos quanto aos padrões obtidos com OPA-2, evidenciando que o número de CECs que apresentam diferenças entre o tecido normal e tumoral é maior que o de QAs.
Na Figura 14 são apresentados alguns padrões de RAPD obtidos com o “primer” OPA-2. Observou-se que uma banda de 1,7 Kb mostrou-se alterada em diversas amostras, estando presente apenas nos CECs (não nos controles) em 21%; apenas nos controles em 11 % e em controles e tumores em 25 % das amostras.
Figura 14 - Exemplos de padrões RAPD obtidos com o “primer” OPA-2. As setas mostram ganho ou perda da banda de 1, 7 Kb. (M) Marcador 100 bp (LGC), (S) sangue, (N) tecido normal
Gráfico 1 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes, em cada tipo de lesão, usando o “primer” OPA-2
OPA-2 0 2 4 6 8
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
4.2.2 “Primer” OPA-7
As lesões que mostraram padrão de bandas muito semelhante com relação ao controle foram QA (paciente 274) (Figura 15 A), CEC I (paciente 223) e CEC II (paciente 221) (não mostrado). Todos os CEC III apresentaram padrões RAPD OPA-7 diferentes dos controles (Gráfico 2). Os padrões RAPD obtidos com o “primer” OPA-7 mostraram principalmente ganho de uma banda de aproximadamente 1,4 Kb em 26 % das amostras de tumor, perda em 4 % dos tumores e estava presente em controles e tumores em 25 % das amostras (Figura 15 B).
Gráfico 2 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPA-7
OPA-7 0 2 4 6 8
QA CEC I CEC II CEC III
T ipo de lesão
A
B
Figura 15 – Padrão RAPD obtido com o “primer” OPA-7 em gel de agarose 1,5 % (A) e em gel de poliacrilamida 7 % (B). QA (paciente 274) mostrou padrão igual ao tecido normal (A). As setas indicam ganho ou perda da banda de 1,4 Kb (B). (M) Marcador 100 bp BioLabs, (N) tecido normal, (S) sangue
4.2.3 “Primer” OPA-13
Este “primer” mostrou-se pouco discriminativo. Não foram encontradas perdas ou ganhos de bandas conservadas, comuns a diversas lesões. As lesões que apresentaram padrão de bandas igual ao controle foram: 274 QA, 245 CEC I, 223 CEC I, 241 CEC I e 227 CEC II. Alguns exemplos são mostrados na Figura 16. Nenhuma amostra de CEC III apresentou padrão de bandas igual ao normal (Gráfico 3).
Figura 16 – Padrão RAPD obtido com o“primer” OPA-13 em gel de agarose 1,5 %. Os pacientes 274, 223 e 227 apresentam padrão de bandas igual ao normal. (M) Marcador 1 Kb (BioLabs), (N) tecido normal, (S) sangue
Gráfico 3 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPA-13
OPA-13 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
PADRÃO IGUAL PADRÃO DIFERENTE
4.2.4 “Primer” OPA-17
O “primer” OPA-17 mostrou-se bem discriminativo; apenas amostras de QA (pacientes 201 e 261) e CEC I (paciente 261) apresentaram padrão de bandas semelhantes ao controle. Houve perda e ganho de diversas bandas (Figura 17). O CBC do paciente 261 mostrou padrão de bandas diferente em
relação ao controle (não mostrado).
Gráfico 4 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPA-17
OPA-17 0 1 2 3 4 5 6 7
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
PADRÃO IGUAL PADRÃO DIFERENTE
Figura 17 – Padrão RAPD obtido com o“primer” OPA-17 em gel de agarose 1,5 %. O paciente 201 apresentou padrão de bandas igual ao normal. As setas indicam algumas perdas/ganhos de diferentes bandas. (M) Marcador 2-Log ladder (BioLabs), (N) tecido normal
4.2.5 “Primer” OPB-8
Houve diminuição do número de amostras com padrão de bandas semelhante ao controle em tipos histológicos mais graves (Gráfico 5). Os padrões obtidos com o “primer” OPB-8 mostraram perda de uma banda de aproximadamente 500 a 520 pb em 26 % dos tumores, a qual estava presente em controles e tumores em 18,5 % das amostras (Figura 18). Os dois CBCs estudados mostraram padrão diferente de bandas com relação aos respectivos controles.
Gráfico 5 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPB-8
OPB-8 0 2 4 6 8 10
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
Figura 18 - Padrão RAPD obtido com o “primer” OPB-8 em gel de agarose 1,5 %. As setas indicam uma banda de aproximadamente 520 pb presente no tecido normal, e perdida em 26 % das lesões. M 1 Kb: marcador 1 Kb DNA Ladder (Ultraclean); M pBR Hinf I: marcador plasmídio pBR322 clivado com a enzima de restrição Hinf I; (N) tecido normal
4.2.6 “Primer” OPB-11
Em sete lesões (28 %) houve ganho de uma banda com aproximadamente 1,8 Kb, perda da mesma em seis tumores (24 %) e presença no controle e tumor em 3 amostras (12 %) (Figura 19). Este “primer” mostrou-se bastante discriminativo: 22 amostras apresentaram diferença entre o tumor e o controle; apenas duas amostras de QA (33,33 %) e uma de CEC I (16,66 %) mostraram padrões de bandas semelhantes aos seus controles (Gráfico 6).
Figura 19 - Padrão RAPD obtido com o“primer” OPB-11 em gel de agarose 1,5 %. O CEC I (paciente 223) e o CEC II (paciente 234) apresentaram padrão de bandas igual ao controle. As setas indicam perda ou ganho da banda de aproximadamente 1,8 Kb. (M) Marcador 1 Kb (BioLabs), (N) tecido normal, (S) sangue
Gráfico 6 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPB-11
OPB-11 0 2 4 6 8 10
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
PADRÃO IGUAL PADRÃO DIFERENTE
4.2.7 “Primer” OPB-13
O padrão obtido com o “primer” OPB-13 apresentou muitas bandas conservadas na maioria das amostras (Anexo I), das quais podemos destacar bandas de 1 Kb, 800 pb e 600 pb, observando-se ganhos e perdas das mesmas em diversos pacientes (Figura 20), sendo que 43 %, 28,5 % e 28,5 % dos tumores apresentaram ganho dessas bandas, respectivamente. Somente a amostra do paciente 241 de CEC I apresentou padrão igual ao controle (Figura 20). Todas as outras amostras estudadas mostraram padrões diferentes (Gráfico 7).
Figura 20 - Padrão RAPD obtido com o “primer” OPB-13 em gel de agarose 1,5 %. As setas indicam perda ou ganho de bandas de 1,8 Kb, 1 Kb, 800 pb e 600 pb. O paciente 241 apresentou padrão igual ao controle. M 1 Kb: marcador 1 Kb (BioLabs); M LMW: Marcador Low Molecular Weight (BioLabs), (N) tecido normal, (S) sangue
Gráfico 7 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPB-13
OPB-13 0 2 4 6 8
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
PADRÃO IGUAL PADRÃO DIFERENTE
4.2.8 “Primer” OPB-19
Apenas o CEC I do paciente 250 apresentou padrão de bandas igual ao controle (Gráfico 8 e Figura 21). Foram observados ganhos (15 %) e perdas (19 %) de uma banda conservada de aproximadamente 1,3 Kb, que estava presente em 27 % das amostras nos controles e tumores (Figura 21). Gráfico 8 - Número de amostras com padrões RAPD de tumor e controle iguais e diferentes em cada tipo de lesão usando o “primer” OPB-19
OPB-19 0 2 4 6 8
QA CEC I CEC II CEC III
Tipo de lesão
Número de amostras
Figura 21 - Padrão RAPD obtido com o “primer” OPB-19 em gel de agarose 1,5 %. As setas indicam perda ou ganho de bandas de 1,3 Kb. M 1 Kb L: marcador 1 Kb Ladder (BioLabs); M 50 bp: Marcador 50 bp (BioLabs), (N) tecido normal, (S) sangue