3.4 Column characterization
3.4.4 A detailed example
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Introdução
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Os neurônios piramidais do hipocampo disparam potenciais de ação seletivamente quando um animal explora lugares específicos do ambiente, e por isso são chamados de células de lugar (do inglês “place cells”) (O’Keefe and Dostrovky, 1971). Quando um animal se locomove pelo espaço, sequências de células de lugar codificam os lugares visitados durante a trajetória (Nakazawa et al., 2004) (Figura 7). Essas sequências espaciais são frequentemente reativadas durante os períodos subsequentes de vigília quieta, sono de ondas lentas e sono REM (sigla para movimento rápido dos olhos, em inglês) (Wilson and McNaughton, 1993; Lee and Wilson, 2002; Foster and Wilson, 2006; Diba and Buzsáki, 2007; O’Neill et al., 2010). A reativação de trajetórias espaciais ocorre de maneira temporalmente comprimida e ocorrem concomitantemente a oscilações de alta frequência no potencial de campo local, chamadas Sharp-wave Ripples (Buzsaki, 1998) (SWR, ~200 Hz; Figura 8). SWR refletem a atividade de disparos sincronizados de grandes populações de neurônios hipocampais, e estão associados à plasticidade sináptica e à comunicação hipocampo-cortical (Ji and Wilson, 2007). A inibição seletiva de SWR no hipocampo piora o aprendizado e o desempenho de ratos em tarefas de memória espacial, indicando um papel fundamental dos eventos SWR em processos de evocação e consolidação de memórias (Girardeau et al., 2009).
50 Figura 7: Representação esquemática da atividade de 4 células de lugar. Cada célula
emite potenciais de ação em uma determinada região do espaço. Os gráficos de cores à direita mostram os campos de lugares (“place fields”) das respectivas células. A atividade conjunta destes neurônios é caracterizada por sequências de disparos (neste exemplo ilustrativo, temos a sequência Célula 4 -> Célula 2 -> Célula 1 -> Célula 3). Retirado de Nakazawa e colaboradores, Nature Reviews Neuroscience (2004).
51 Figura 8: Representação esquemática da atividade de 6 células de lugar durante
exploração do ambiente e as durante sessões de sono prévia e subsequente. O painel acima mostra a sequência de células de lugar ativadas ao longo da trajetória do animal. Abaixo à esquerda, oscilações ripples no potencial de campo hipocampal são mostradas em associação a atividade das células de lugar durante a sessão de sono prévia a exploração do ambiente. O painel à direita mostra a atividade dessas células na sessão de sono subsequente. Note que após a exploração, a atividade das células de lugar reflete a reativação de sequências espaciais exibida durante a trajetória, o que fortalece as conexões sinápticas durante o sono de ondas lentas. Retirado de O’Neill e colaboradores, Trends in Neurosciences (2010).
Neurônios hipocampais também apresentam atividade sequencial durante intervalos de tempo onde informação mnemônica deve ser mantida para que os animais possam concluir os objetivos da tarefa (Pastalkova et al., 2008; MacDonald et al., 2011; Kraus et al., 2013) (Figura 9). Segundo Eichenbaum (2013), essa atividade sequencial codifica momentos sucessivos no tempo, possivelmente cobrindo intervalos temporais para estabelecer uma experiência organizada em representações mnemônicas de longa duração. Por causa de sua especificidade temporal, esses neurônios foram chamados de células de tempo (“time cells”, em inglês; Figura 10). Tem sido proposto que a atividade sequencial de células de tempo possibilita a formação de relações temporais entre eventos ordenados, fornecendo a organização temporal típica de memórias episódicas.
52 Figura 9: Caracterização da atividade de neurônios do hipocampo que codificam o
tempo. (A) Disparos de diferentes neurônios representados por pontos de diferentes cores ao longo da trajetória do animal pelo labirinto. A tarefa consiste na alternância de escolhas em um labirinto em T modificado (labirinto em forma de 8) onde o animal corre em uma roda giratória no período entre as escolhas. (B) Porcentagem de neurônios ativos de acordo com a posição do animal no labirinto. Note a alta porcentagem de neurônios ativos durante a espera para uma nova escolha na roda giratória. (C) Scatter plot da taxa de disparos de potenciais de ação de neurônios hipocampais na roda giratória e durante trajetória no labirinto. Note que neurônios ativos em uma etapa possuem baixa atividade em outra etapa. (D) “Campos de tempo” (“time fields”, em analogia aos “place fields”). Cada painel mostra a atividade de um neurônio hipocampal através do tempo (eixo x) de espera na roda giratória, para diferentes tentativas (eixo y). Note que estes neurônios disparam em determinados tempos após o início da corrida na roda giratória. (E) Atividade de todos os neurônios de tempo durante o período de espera entre escolhas na roda giratória, ordenada pelo tempo em que os neurônios são maximamente ativos. Note que esta atividade conjunta
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pode ser descrita como uma sequência temporal que preenche todo o evento. Retirado de Pastalkova e colaboradores, Science (2008).
Figura 10: Segundo trabalho mostrando a existência de neurônios de tempo no
hipocampo. Retirado da revisão de Eichenbaum, Trends in Cognitive Sciences (2013); resultado original reportado em MacDonald e colaboradores, Neuron (2011).
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Como as características espaciais e temporais de uma memória episódica são combinadas em uma representação mnemônica singular ainda é tema de intenso debate. Se a ativação transiente exibida pelas sequências de células de tempo é seletivamente reativada durante eventos SWR subsequentes, ou se essas sequências são integradas às concomitantes representações espaciais do ambiente são questões que permanecem por ser investigadas.
Outros aspectos fundamentais da codificação temporal que permanecem por ser investigados:
x Como as reativações de sequências temporais se correlacionam com o desempenho em tarefas de memória?
x As reativações de sequências temporais e espaciais apresentam diferentes níveis de similaridade com os respectivos padrões exibidos na experiência original?
x Como sequências temporais e espaciais são integradas em um único evento SWR? x Sequências temporais apresentam ancoramento semelhante ao apresentado
durante a reativação de sequências espaciais?
x Outra possibilidade é que conectividade intrínseca dos circuitos hipocampais estabeleça a priori a ordem de ativação da sequência de células de tempo exibida durante os intervalos temporais.
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Objetivos
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Objetivo geral:
Verificar a ocorrência de reativação de sequências de disparo em células de tempo no hipocampo.
Objetivos específicos:
1) Realizar registros eletrofisiológicos de potencial de campo local e da atividade de disparo de neurônios individuais através de tetrodos implantados na região CA1 do hipocampo dorsal de ratos submetidos a uma tarefa de alternância em um labirinto em T modificado, na qual durante o período de espera entre as escolhas o animal anda em uma esteira elétrica; bem como também realizar registros durante períodos de sono antes e após a realização da tarefa.
2) Identificar neurônios hipocampais que codificam o espaço (células de lugar) e o tempo (células de tempo), e buscar por sequências de ativação de neurônios nas diferentes etapas da tarefa.
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3) Analisar o acoplamento entre a atividade neuronal e diferentes frequências de oscilações do potencial de campo local do hipocampo (bandas teta, gama e ripple) em períodos prévios, durante e posteriores ao momento de tomada de decisão na tarefa, bem como nos períodos de sono anteriores e posteriores à realização da tarefa.
4) Verificar a ocorrência de reativação de sequências disparos de células de tempo e de células de lugar durante os períodos de sono REM e sono de ondas lentas anteriores e posteriores a realização da tarefa.
5) Correlacionar achados eletrofisiológicos com o comportamento dos animais na tarefa de decisão, com foco no desempenho de cada escolha em tentativas individuais, bem como no desempenho ao longo dos diferentes dias de registro.
Para investigar essas questões, nós registramos a atividade de neurônios da camada piramidal da região CA1 no hipocampo do rato enquanto os animais executavam uma tarefa de alternância espacial associada a um período de corrida em uma esteira elétrica acoplada ao labirinto, e durante as sessões de sono anterior e posterior à realização da tarefa.
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Métodos
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Animais
Os experimentos foram realizados utilizando ratos machos adultos da linhagem Long Evans. A estimativa inicial do número de animais empregados, baseada em trabalhos prévios com metodologia similar, é de 6-10 ratos. Como cada rato servirá de controle para ele mesmo, o experimento não necessita de grupos adicionais. No total, 6 animais foram registrados. Todos os procedimentos realizados estão de acordo com as leis do Brasil e das Sociedades de Biologia Experimental para a experimentação com animais, e foram previamente aprovados pelo comitê de ética local.
Desenho experimental
Os animais foram parcialmente privados de água, e tiveram acesso livre à ração. O protocolo de privação prevê livre acesso à água durante 30 minutos por dia, sempre após a realização dos experimentos. Os animais foram inicialmente habituados ao experimentador e ao ambiente dos procedimentos. Os animais foram treinados a realizar uma tarefa de alternância espacial em um labirinto em T modificado, também chamado de labirinto em forma de 8 (ver Figura 11), para obtenção de água como recompensa. O caminho central do labirinto foi acoplado a uma esteira rolante
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controlada eletronicamente. A cada volta, os animais correram na esteira por 15 segundos a uma velocidade pré-determinada de 30 cm/s. Após atingirem um desempenho de 75% de alternâncias corretas, os animais receberam implantes crônicos de múltiplos tetrodos no hipocampo (protocolo cirúrgico abaixo). Os animais tiveram então a atividade eletrofisiológica registrada durante a realização da tarefa. Os registros foram realizados em um ambiente familiar ao animal (uma “caixa de sono”) durante 2 horas tanto antes como após as sessões experimentais no labirinto, a fim de gravar períodos de sono REM e sono de ondas lentas.
Figura 11: Labirinto em T modificado (em forma de 8). Uma foto do aparato é mostrada
à esquerda. O labirinto é feito de madeira e está associado a uma esteira elétrica controlada por computador. O esquema à direita mostra as dimensões do labirinto e a localização dos três pontos de entrega de recompensa (representados por círculos). Note que os animais correm na esteira (retângulo tracejado), em seguida correm pelo labirinto passando pelo ponto de decisão (bifurcação em forma de T na base da imagem), até alcançarem os locais de recompensa na outra extremidade (círculos no alto da imagem). Um ponto de recompensa próximo a esteira (círculo central) entrega água antes e depois da corrida na esteira, o que motiva o animal a permanecer correndo.
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A matriz de microeletrodos é formada por 24 tetrodos móveis (Figura 12). Uma peça circular de plástico serve como base de sustentação das placas de circuito, dos parafusos ajustáveis e de seus respectivos tetrodos. Um cone de plástico com tampa é usado para proteger a estrutura da matriz de tetrodos contra choques mecânicos.
Cada tetrodo é composto por quatro microeletrodos de nicrômio (12,5 µm de diâmetro, California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA) paralelamente associados e girados sobre seu eixo principal. Os microeletrodos são conectados por pinos de ouro a uma placa de circuito impresso ligada a conectores Omnetics em uma extremidade. Na outra extremidade, a ponta dos tetrodos é cortada em ângulo e a impedância de cada um dos quatro microeletrodos é DMXVWDGDSDUDDSUR[LPDGDPHQWH0DN+]SRU um processo de eletrólise em solução de ouro.
Os tetrodos são organizados radialmente a partir da base de plástico e inseridos em tubos de sílica. Em conjunto, os tetrodos e seus tubos de sílica são guiados paralelamente por duas cânulas maiores direcionadas às estruturas cerebrais de interesse.
Figura 12: Matrizes de tetrodos móveis. Da esquerda para a direita: a imagem frontal
mostra a base e o cone de proteção, e os parafusos ajustáveis acoplados às cânulas- guias (esquerda); uma visão superior mostra a placa de circuito impresso associada aos conectores Omnetics, e os parafusos ao redor formando a “coroa” de tetrodos
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(centro); uma visão da parte inferior da matriz mostra a base das cânulas por onde os tetrodos chegam ao cérebro (direita).
Procedimentos cirúrgicos e eletrofisiológicos
Através de anestesia gasosa (Isoflurano 3%), os animais foram cirurgicamente implantados com uma matriz de 24 tetrodos móveis para registro eletrofisiológico bilateral da região CA1 do hipocampo dorsal (coordenadas estereotáxicas: AP: 3,6 mm posterior; e ML: 1,6 mm lateral em relação à Bregma). Seis parafusos de sustentação foram inseridos superficialmente no crânio, e dois parafusos adicionais soldados a fios de cobre foram inseridos profundamente, até promover contato elétrico entre o líquido cefalorraquidiano e as placas de circuito. Duas craniotomias permitiram o acesso dos eletrodos ao interior do cérebro. Após devidamente posicionada sobre o córtex, a matriz de tetrodos foi cimentada ao crânio e aos parafusos de sustentação através do uso de resina acrílica dental. Quando acoplados a parafusos ajustáveis, os tetrodos podem ser aprofundados no tecido cerebral durante ou após a cirurgia de implante. Ao final da cirurgia, os tetrodos foram inseridos aproximadamente 1 mm no córtex cerebral (eixo dorsoventral). Após a recuperação cirúrgica do animal, os tetrodos foram cuidadosamente aprofundados até a camada piramidal do hipocampo, enquanto a variação do sinal é acompanhada através do sistema de registro. Padrões eletrofisiológicos estereotipados, como a ocorrência de ondas ripples e potenciais de ação, indicam que a ponta dos tetrodos alcançou a camada piramidal do hipocampo.
Um sistema de aquisição de múltiplos canais Plexon (MAP) foi utilizado para os registros eletrofisiológicos durante a realização da tarefa de alternância. Para a aquisição de potenciais de ação extracelular, a atividade neuronal foi filtrada (0,15–8,8
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KHz), digitalizada a 40 KHz e amplificada sempre que exceder um limiar determinado para cada tetrodo. Os potenciais de campo local foram pré-amplificados (500 x), filtrados (0,3–400 Hz) e digitalizados a 1000 Hz. Ambos os sinais foram armazenados para posterior análise. A classificação das unidades neuronais e a identificação dos tempos de disparo dos diferentes neurônios são realizadas através do programa OfflineSorter (Plexon). Após conclusão da última sessão de registros eletrofisiológicos, os animais foram sacrificados e tiveram seus cérebros dissecados e processados para posterior análise histológica.
Registro comportamental
Todos os experimentos comportamentais foram registrados em vídeo (30 quadros/s), e sincronizados com os registros eletrofisiológicos de potenciais de campo local e atividade neuronal. As coordenadas de posicionamento dos animais no labirinto, assim como a direção da cabeça foram automaticamente identificadas pelo programa Cineplex (Plexon) através de dois diodos emissores de luz (LEDs) acoplados às placas de circuito do implante, e manualmente corrigidas quando necessário. O desempenho dos animais na execução da tarefa é classificado posteriormente através do uso do mesmo programa.
Histologia
Após o término dos experimentos, os animais foram sacrificados e seus cérebros removidos para análise histológica. Os animais foram inicialmente anestesiados (Isoflurano 5%), e uma corrente de 25 ȝA foi aplicada a cada tetrodo por um período de 30 segundos. Este procedimento provoca a queima do tecido cerebral próximo à ponta
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dos tetrodos, e permite que sua localização exata nos cortes histológicos seja identificada posteriormente. Em seguida os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (i.p. 100 mg/Kg) e então perfundidos através do ventrículo esquerdo, com salina 0,9% seguida de solução azul da Prússia (cianeto férrico e paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M, em pH de 7,4). Os cérebros foram então mantidos em paraformaldeído 4% por 24 horas, transferidos para solução de sacarose 30%, e posteriormente congelados em uma mistura de gelo seco e etanol 100%. Sessões encefálicas seriais de 50 µm de espessura são cortadas usando um criostato e montadas em lâmina de vidro. Os cortes histológicos são banhados em solução de Nissl para coloração dos corpos celulares e posteriormente analisados para a identificação do posicionamento final da ponta dos tetrodos através de microscopia luminosa.
Análise de dados
A análise computacional dos registros eletrofisiológicos e dos dados comportamentais é feita através do programa MATLAB (http://www.mathworks.com/). Novas rotinas de análise são programadas, assim como rotinas prévias são adaptadas de acordo com a necessidade e conveniência. Análises de potenciais de campo local, potenciais de ação de neurônios individuais e da relação entre esses dois sinais são executadas através de rotinas que calculam a taxa de disparos, o espectro de potência de Fourier, decomposições wavelets, transformadas de Hilbert, análise de componentes principais, identificação de assembleias neuronais (Lopes-dos-Santos et al., 2011; Lopes-dos-Santos et al., 2013), índices de modulação (Tort et al., 2010),
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estatística circular, medidas de sincronia e coerência, análise de acoplamento entre a atividade neuronal e as fases do potencial de campo local, entre outras análises.
Análise de comportamento: A atividade locomotora no labirinto e na esteira, assim
como o desempenho de escolhas na tarefa de alternância, é analisada inicialmente através do programa Cineplex (Plexon), e posteriormente em rotinas específicas programadas em MATLAB. Essas análises permitem avaliar o grau de locomoção dos animais nas duas situações de interesse e comparar o padrão locomoção entre escolhas corretas e incorretas. O desempenho dos animais na realização da tarefa é classificado em correto e incorreto de acordo com a estratégia de alternância de direções escolhida por cada animal em cada sessão.
Análise de acoplamento: Avaliamos o grau de acoplamento entre a atividade de
neurônios individuais e as fases da oscilação teta, assim como de bandas de alta frequência como gama e ripples. Comparamos o grau de acoplamento durante a corrida na esteira e a durante corrida no labirinto. Comparamos o grau de acoplamento em escolhas corretas e incorretas durante a fase de decisão. Também estudamos o grau de acoplamento presentes durante os períodos de sono REM e de sono de ondas lentas antes e após as sessões experimentais no labirinto.
Análise de sequências de disparo neuronal: Através do registro da atividade de
populações de neurônios podemos analisar a similaridade das sequências de disparos exibidos durante a corrida na esteira e no labirinto, assim como durante os padrões de reativação tradicionalmente associados às oscilações ripples. E mais especificamente, comparar as sequências de disparo de células de tempo e as sequências de disparo de
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células de lugar durante os momentos de corrida e de obtenção de recompensa. Também estudamos os padrões de sequências de disparos durante períodos de sono REM e ondas lentas antes e após as sessões experimentais no labirinto, com ênfase na procura de reativações ou pré-ativações de padrões sequenciais detectados no labirinto.
Análise estatística: As análises estatísticas foram realizadas através de rotinas pré-
programadas em toolboxes estatísticos específicos (MATLAB). A escolha dos testes estatísticos empregados (paramétricos ou não paramétricos) depende da distribuição apresentada pelas variáveis estudadas. Empregamos um limiar alfa de 0,01, corrigido por Bonferroni para denotar significância estatística.
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Resultados preliminares
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Na execução da parte experimental do projeto, nós registramos o potencial de campo e a atividade de disparo de neurônios individuais da região CA1 do hipocampo dorsal de seis ratos durante sessões de sono e durante a execução da tarefa de alternância espacial combinada com um período de corrida em esteira entre cada volta. No total, 61 sessões comportamentais foram registradas. Os animais foram sacrificados, perfundidos e os cérebros foram extraídos e congelados para processamento posterior, como descrito nos métodos. Mapas com o posicionamento espacial dos tetrodos de cada matriz foram armazenados e serão utilizados como referência para a localização anatômica da ponta dos tetrodos nas lâminas histológicas. Os dados eletrofisiológicos e comportamentais foram convertidos em planilhas numéricas para análise posterior, como descrito nos métodos. Uma cópia em estado bruto dos registros eletrofisiológicos e dos vídeos comportamentais foi salva em mídia de armazenamento de longo prazo. A tabela abaixo mostra a identidade dos animais e número de sessões registradas em cada animal.
Identidade do rato N° de sessões 1 HB02 7 2 HB03 10 3 HB07 9 4 HB08 12 5 HB11 11 6 BK49 12
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Anexo 2
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A seguir estão listados alguns dos trabalhos realizados em colaboração e publicados em periódicos e/ou apresentados em congressos especializados. O painel “Codificação de localização e identidade de objetos em populações neuronais do hipocampo e do córtex cingulado anterior” foi selecionado para apresentação oral e concorreu ao prêmio Juarez Aranha Ricardo 2010. O trabalho ficou classificado entre os cinco melhores do congresso e recebeu menção honrosa da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento na reunião anual de 2010. O painel “Measuring the distribution of theta-locked spiking activity in hippocampal neuronal ensembles of rats before and after spatial exploration” foi classificado entre os trabalhos de destaque do congresso e recebeu menção honrosa no 3º Simpósio em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN em 2011.
67 Anexo 2.1: Trabalho publicado em periódico
On high-frequency field oscillations (>100 Hz) and the spectral leakage of spiking activity. (Scheffer-Teixeira et al., 2013)
Recent reports converge to the idea that high-frequency oscillations in local field potentials (LFPs) represent multiunit activity. In particular, the amplitude of LFP activity above 100 Hz – commonly referred to as “high-gamma” or “epsilon” band – was found to correlate with firing rate. However, other studies suggest the existence of true LFP oscillations at this frequency range that are different from the well established ripple