P Å SPORET AV KONTROLLERING VED HJELP AV ANT

Foram identificados em nosso trabalho nove transcritos de lipocalinas no transcriptoma de glândulas salivares de A. sculptum possuidoras de domínio de ligação a histamina e serotonina (lip1, lip4, lip7, lip10, lip14, lip17, lip21, lip24 e lip27). Estas quando confrontadas com as lipocalinas depositadas no Swiss-prot relacionadas à sua sinonímia, A. cajennense, encontram-se depositadas, à exceção do lip17 (As_6240), recomenda-se o depósito deste gene identificado no transcriptoma de Moreira 2010.

Foram analisados e validados 3 primers de genes constitutivos (g6pdh,

3ohcoadh e gapdh) candidatos potenciais a genes de referência em glândulas

salivares, intestinos e ovários do carrapato A. sculptum em situação de não infecção/infecção com R. amblyommii. Para gene de referência em glândulas salivares, intestino e ovários recomenda-se o gapdh e se necessário um segundo controle endógeno o gene de escolha seria o 3-ohcoadh.

Foram validados 3 modelos estruturais correspondentes às proteínas lipocalina 4, lipocalina 7 e lipocalina 24. A partir dessa validação in silico torna-se necessário uma obtenção da proteína recombinante das proteínas estudadas seguida da análise através de ressonância magnética nuclear e cristalografia por raioX de maneira a comprovação experimental da estrutura modelada.

Quanto ao estudo da expressão relativa, o lip4 teve sua expressão down regulada em glândulas salivares infectadas e no intestino infectado. Cabe ressaltar que a proteína LIP4 tem função distinta quando presente em glândula salivar e intestino uma vez que a infecção provocou down regulação de lip4 em glândula salivar e intestino e up regulação de lip4 em ovário. Somente no ovário o lip4 encontra-se up regulado durante a infecção o que se infere que existe um papel multifuncional da proteína LIP4, relacionado à reprodução frente a infecção da fêmea do carrapato com

R. amblyommii.

O gene de lipocalina lip7 encontra-se diferentemente expresso tanto em glândulas salivares quanto em intestinos e ovários. O mesmo apresentou uma regulação positiva na sua expressão no intestino e um pequeno aumento da expressão nos ovários infectados, em glândulas salivares tanto infectada como não infectada, o esse gene encontra-se suprimido. Conclui-se que a infecção superexpressa lip7 no intestino infectado reforçando a hipótese de que a superexpressão frente à infecção por

R. amblyommii no intestino deve-se a uma função protetora da proteína LIP7 sugerindo

91 O resultado da expressão relativa do gene lip24 demonstra que o mesmo não está presente nas glândulas salivares tanto na ausência quanto na presença da infecção. Em relação ao intestino, a infecção provoca up regulação na expressão gênica de lip24 e down regulação no ovário. No intestino aventa-se uma possível função protetora desse gene como função adicional das lipocalinas nesse órgão, uma vez que o carrapato não possui enzimas digestivas no intestino fazendo desse órgão um bom alvo para infecções bacterianas. A captação de lipídeos no intestino realizada pela função principal do lip24 pode contribuir para a defesa da infecção do carrapato frente à bactéria R. amblyommii. No ovário, sua down regulação sugere possível envolvimento desse gene na reprodução do carrapato pois o lip24 encontra-se down regulado somente em caso de infecção.

Portanto, nosso trabalho com as lipocalinas sugere a necessidade de estudos posteriores envolvendo os genes lip4, lip7 e lip24 em situação de Knock out ou Knock

down de maneira a esclarecer os possíveis papeis de cada gene estudado na função

anti-histamínica exercida durante a alimentação do artrópode sobre o hospedeiro, bem como, relacionar o quanto e porquê a infecção corrobora na expressão diferencial desses genes nos tecidos estudados pois foi demonstrado que pode haver papel multifuncional das lipocalinas com domínio SHBP nos tecidos estudados. Conclui-se que os dados obtidos na análise de expressão gênica por real time RT-qPCR suportam a hipótese de que os três genes de lipocalinas interferem na interação microrganismo- vetor sendo necessários trabalhos adicionais para verificação da validade desta hipótese, uma vez que dentre as 121 lipocalinas preditas no transcriptoma de glândulas salivares, somente nove apresentam domínios SHBP sugerindo um papel especial na função destas nos tecidos estudados.

Finalmente, através do nosso trabalho de identificação de lipocalinas com domínio de ligação a histamina e serotonina e validação de genes de referência em transcriptomas de glândula salivar, intestino e ovário do carrapato Amblyomma

sculptum reforçamos a hipótese de uma conservação evolutiva da função anti-

histamínica por meio da participação de lipocalinas na modulação da resposta do hospedeiro. Estas, durante o repasto sanguíneo do carrapato, apesar da existência de receptores cutâneos de histamina no hospedeiro vertebrado, atuariam reduzindo a reação cutânea inflamatória, prolongando o período de alimentação do artrópode.

Estudos experimentais para determinar a atividade anti-histamínica apresentada pela saliva do carrapato A. sculptum, bem como, a investigação de uma possível interação desta atividade com receptores celulares associados com o padrão de

92 conservação de sua estrutura terciária, virão constituir uma estratégia potencialmente sólida como base para o desenvolvimento de biofármacos. Neste contexto, o potencial da ação anti-histamínica apresentada pelas lipocalinas do A. sculptum, em especial lip4 nos ovários infectados e lip7 e lip24 nos intestinos infectados associado à sua capacidade de abrigar substâncias hidrofóbicas no interior de sua estrutura terciária, torna estas moléculas candidatas a produto de uso farmacêutico como estratégia de controle dos índices de reprodução ou na resistência à infecção do carrapato A.

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