Análisis molecular de la diversidad de Pseudomonas a lo largo del río Danubio

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Título: Análisis molecular de la diversidad de Pseudomonas a lo largo del río Danubio.

AUTOR: Daniela Román Cáceres

Memoria del Trabajo de Fin de Máster

Máster Universitario en Microbiología Avanzada (Especialidad/Itinerario Investigación)

de la

UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS

Curso Académico 2016-2017

Fecha 14 de septiembre de 2017

Nombre Tutor del Trabajo Jorge Lalucat Jo.

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Índice

Resumen ...

1. Introducción ... 1

1.1. Hipótesis ... 4

1.2. Objetivos ... 4

2. Materiales y Métodos ... 5

2.1. Microorganismos ... 5

2.2. Selección de cepas. ... 6

2.3. Secuenciación del gen rpoD ... 6

2.3.1. Extracción de DNA bacteriano. ... 7

2.3.2. Electroforesis en gel de agarosa. ... 7

2.3.3. Reacción en cadena de la polimerasa PCR... 7

2.3.4. Purificación del producto de PCR ... 7

2.3.5 Secuenciación ... 8

2.4. Análisis de las secuencias con las bases de datos NCBI y la propia del laboratorio. ... 8

2.5. Árboles filogenéticos ... 8

3. Resultados y Discusión ... 9

3.1. Selección de microorganismos ... 9

3.2. Identificación por la secuencia del gen rpoD ... 9

3.3. Análisis de las identificaciones obtenidas por los dos métodos ... 14

4. Conclusiones ... 19

Bibliografía ... 20

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Índice de Tablas y Figura

Tabla 1 Puntos de muestreo a lo largo del curso del río Danubio ... 1

Tabla 2 Número de aislados Pseudomonas spp. en los puntos de toma de muestras investigadas y las resistencias a antibióticos detectadas. ... 3 Tabla 3 Especies y número de aislados cedidos por la Universidad de Graz para este estudio. ... 6 Tabla 4 Asignación a grupo filogenético o especie de las 100 cepas estudiadas de acuerdo a la semejanza en la secuencia del gen rpoD. El orden en la tabla se ha establecido de acuerdo a la topología del árbol filogenético correspondiente que se incluye como anexo. ... 10 Tabla 5 Número de cepas identificadas distribuidas en 19 especies de Pseudomonas.

... 13 Tabla 6 Cepas identificadas como nuevos taxones ... 14

Tabla 7 En la tabla se indican las cepas en las que se ha visto que existe una discrepancia en la identificación por MALDI-TOF y por secuencia del gen rpoD. Se puede observar el número y afiliación de grupos que se consideraron en base al dendrograma obtenido por los perfiles proteicos de MALDI-TOF. La asignación a especie por rpoD se puede ver también en la tabla 4. ... 15 Tabla 8 Cepas del grupo P. stutzeri y a las genomovares a que pertenecen ... 18

Figura 1. Vista general de los puntos de muestreo JDS3 a lo largo del río Danubio…..2

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Resumen

Se realizó el análisis molecular de la diversidad de Pseudomonas a lo largo del rio Danubio, mediante la secuenciación del gen rpoD de 100 cepas seleccionadas entre 615 aislados identificados como Pseudomonas mediante el método de MALDI-TOF facilitados por el grupo de investigación de la universidad de Graz. Los aislados fueron identificados mediante comparación con la base de datos del NCBI y con la base de datos de secuencias de rpoD de la UIB. Se compararon las identificaciones obtenidas por ambos métodos (MALDI-TOF y rpoD) para determinar la posibilidad de que existan nuevos taxones entre las bacterias aisladas. Las 100 cepas de estudio fueron cultivadas en medio LB donde se comprobó que eran cultivos puros. Se realizó la extracción de DNA, la amplificación del gen rpoD, secuenciación y análisis de las secuencias. De las 100 cepas estudiadas, únicamente 2 no se pudieron amplificar con los cebadores selectivos de rpoD diseñados para Pseudomonas por lo que se secuenció el gen RNA ribosómico 16S. La cepa JDS02PS025 se identificó como un miembro del género Arthrobacter con una similitud de 94 % con Arthrobacter koreensis. La otra cepa, JDS03PS007, se identificó como Brevundimonas terrae con una similitud de 99,2 % respecto a la cepa tipo de esta especie. Se pudieron identificar 57 cepas a nivel de especie por presentar más del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD. Se distribuyeron en 19 especies diferentes, siendo las más abundantes P. moraviensis y P. soli (8 cepas cada una de ellas). Por abundancia, la siguiente especie detectada fue P. stutzeri, con 6 cepas pertenecientes a la genomovar 1 y otra adicional a la genomovar 3. Las 41 cepas de Pseudomonas restantes no pudieron asignarse a ninguna especie descrita por tener menos del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD por lo que fueron consideradas como representantes de 17 nuevos taxones, dentro de los aislados del río Danubio. Al observar los resultados y comparar ambos métodos MALDI-TOF y rpoD se puede determinar la existencia de una buena correspondencia entre los agrupamientos de los perfiles proteicos y los grupos o subgrupos filogenéticos establecidos previamente en el género. No obstante, la identificación a nivel de especie por MALDI-TOF no es suficiente, porque la base de datos no incluye muchas especies de origen ambiental. Además, algunas especies de un mismo grupo o subgrupo filogenético no se pueden discriminar por MALDI-TOF.

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1. Introducción

Las bacterias del género Pseudomonas son comunes en hábitats naturales, son especies metabólicamente versátiles y desde un punto de vista nutricional son consideradas altamente heterogéneas. Las especies del género tienen una importancia relevante en los ciclos biogeoquímicos del carbono y del nitrógeno (García-Valdés &

Lalucat, 2016). Algunas especies son consideradas patógenos importantes de animales y plantas; así también existen miembros que son conocidos por su papel beneficioso para las plantas, incluso se utilizan para la biorremediación y como agentes de control biológico, por lo que el estudio de la ecología de Pseudomonas en la biosfera es de gran interés (Yamamoto, 2000).

En 2016, Kittinger y colaboradores realizaron un estudio centrado en el aislamiento, identificación y determinación de las resistencias a antibióticos de cepas ambientales del género Pseudomonas a partir de muestras tomadas a lo largo del curso del río Danubio (Kittinger et al., 20016). Éste es el segundo rio más largo de Europa, con una longitud de unos 2.800 km. Desde su nacimiento en las montañas de la Selva Negra de Alemania hasta el Mar Negro fluye a través de nueve países (Alemania, Austria, Eslovaquia, Hungría, Croacia, Serbia, Bulgaria, Ucrania y Rumanía) y drena una cuenca de aproximadamente 817,000 km².

Tabla 1 Puntos de muestreo a lo largo del curso del río Danubio

Fuente: (Kittinger, 2016)

Las muestras de agua de la expedición “Joint Danube Survey 3” (JDS3), (JDS3, 2015) proporcionaron una oportunidad excelente para evaluar la resistencia a antibióticos de

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las bacterias a lo largo de un sistema fluvial conjunto. Las cepas se aislaron en medios selectivos y se determinaron sus resistencias a los antibióticos. Las bacterias primero fueron aisladas en diferentes agares selectivos: agar Endo, agar xilosa-lisina- desoxicolato (XLD) y agar Chromocult para coliformes, en condiciones de crecimiento 37°C durante 18-24h. Posteriormente se realizaron pruebas de susceptibilidad a los antibióticos para todas las especies de Pseudomonas identificadas. Se hicieron análisis de los siguientes antibióticos: Piperacilina / tazobactam (TZP), ceftazidima (CAZ), cefepima (FEP), meropenem (MEM), imipenem (IPM), amikacina (AN), gentamicina (GM), tobramicina (NN), ciprofloxacina (CIP), levofloxacina ) y sulfametoxazol / trimetoprim (SXT).

La Identificación de las cepas a nivel de especie del género Pseudomonas se realizó por espectrometría de masas de las proteínas totales (MALDI-TOF-MS) según el protocolo descrito por (Jamal, 2014) y el análisis de los espectros se realizó con la base de datos VITEK-MS. Los picos de estos espectros se compararon con el patrón característico para la especie, género o familia del microorganismo, lo que lleva a la identificación del mismo. (Kittinger, 2016)

Como resultado obtuvieron un total de 520 cepas de Pseudomonas. El menor número de aislados se obtuvo en el punto JDS68 con 32 cepas, y el más alto en el punto JDS28

Figura 1. Vista general de los puntos de muestreo JDS3 a lo largo del río Danubio

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con 117 cepas aisladas. Las especies más abundantes que se identificaron fueron Pseudomonas putida (66,0% / 344 aislados) y Pseudomonas fluorescens (27,1% / 141 aíslados). Las demás especies estuvieron representadas por menos de cinco aislamientos.

Se considera que uno de los requisitos esenciales para una investigación detallada del papel que juega Pseudomonas en los ambientes naturales es disponer de un sistema preciso de identificación. Sin embargo, la identificación de las cepas de Pseudomonas por los métodos tradicionales fenotípicos no es totalmente satisfactoria y por ello, en el trabajo, recurrieron a la técnica de MALDI-TOF. En el estudio se concluyó que es una técnica conveniente para la discriminación de bacterias a nivel de especie y que es útil en la identificación bacteriana. Sin embargo, se necesita una base de datos completa con espectros de referencia para fines comparativos y las habitualmente utilizadas se basan en cepas de origen clínico y son incompletas.

Yamamoto et al. (2000) propusieron el análisis de genes que codifican proteínas (gyrB y rpoD) para la discriminación de especies de Pseudomonas. Estos genes evolucionan Tabla 2 Número de aislados Pseudomonas spp. en los puntos de toma de muestras investigadas y las resistencias a antibióticos detectadas.

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mucho más rápidamente que los ribosómicos y por tanto proporcionan mayor resolución que el análisis de las secuencias del gen rRNA 16S (Yamamoto, 2000).

Las secuencias de genes codificantes de proteínas, tales como gyrB, rpoB o el gen rpoD proporcionan una resolución superior al rRNA 16S y son conocidos por estar presentes en una sola copia en el genoma y son un buen marcador filogenético y proporcionan una identificación muy precisa a nivel de especie en la taxonomía actual del género (Mulet, Bennasar, Lalucat, & García-Valdés, 2009)

El objetivo de este estudio es realizar una comparación de las identificaciones obtenidas en el estudio “Antibiotic Resistance Patterns of Pseudomonas spp. Isolated from the River Danube” mediante MALDI-TOF-MS, utilizando métodos moleculares basados en la secuenciación y análisis del gen rpoD de cepas aisladas en la campaña JDS3.

1.1. Hipótesis

Al analizar las secuencias del gen rpoD se obtendrá una identificación más precisa a nivel de especie de las cepas aisladas que la obtenida por MALDI-TOF utilizando como referencia la base de datos VITEK-MS diseñada sobre todo para bacterias de origen clínico.

1.2. Objetivos

1) Secuenciar el gen rpoD de los aislados facilitados por el grupo de investigación de la Universidad de Graz.

2) Identificar los aislados mediante comparaciones con la base de datos del NCBI y con la base de datos de secuencias de rpoD de la UIB.

3) Comparar las identificaciones obtenidas por ambos métodos (MALDI-TOF y rpoD).

4) Determinar la posibilidad de que existan nuevos taxones entre las bacterias aisladas.

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2. Materiales y Métodos 2.1. Microorganismos

Las muestras fueron recolectadas durante la campaña JDS3 organizada por la Comisión Internacional para la Protección del Río Danubio (CIPD). La CIPD es un cuerpo transnacional, que ha sido establecido para aplicar el Convenio de Protección del Danubio (Kittinger, 2016).

Las muestras se recogieron entre el 12 de agosto y el 26 de septiembre del año 2013, Se tomaron muestras de agua en 68 sitios de muestreo ubicados a lo largo del río Danubio (JDS3). Para cada sitio de muestreo, se tomaron muestras de agua en tres puntos de muestreo, a la izquierda, en el centro y en el lado derecho del curso del Danubio (Kittinger, 2016).

Las muestras se recogieron en matraces de vidrio de 1l estériles, a 30 cm por debajo de la superficie del río, y a continuación fueron transportados al laboratorio donde se realizó el estudio. Las muestras se almacenaron a -80 ° C (Kittinger, 2016) con glicerol.

Los puntos elegidos para la investigación de Kittinger se localizan directamente aguas abajo de las ciudades de Viena, Budapest, Novi Sad y Bucarest, además de otros cuatro puntos situados cerca del de partida de la expedición JDS3. En el estudio publicado se describen 520 cepas de Pseudmonas, pero en total se disponía de 615.

Las 615 cepas fueron enviadas al laboratorio de microbiología de la Universidad de las Islas Baleares (UIB), donde se llevaron a cabo pruebas en medio LB para confirmar que se tenía cultivos puros y también se cultivaron en agar cetrimide como medio selectivo de Pseudomonas para comprobar el crecimiento. Las cepas se almacenaron a -80ºC en medio crioprotector. En la Tabla 3 se indica la identificación de los aislados obtenida por MALDI-TOF con la base de datos Vitek, tal como se describe en el trabajo original de Kittinger (2016).

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Tabla 3 Especies y número de aislados cedidos por la Universidad de Graz para este estudio.

Especie (identificación por MALDI-TOF y base de datos Vitek)

Número de aislados

Pseudomonas putida 406

Pseudomonas fluorescens 163

Pseudomonas oleovorans 12

Pseudomonas chlororaphis 8

Pseudomonas stutzeri 8

Pseudomonas mendocina 6

Pseudomonas chlororaphis/fluorescens 5

Pseudomonas viridiflava 3

Pseudomonas aeruginosa 2

Pseudomonas alcaligenes 1

Pseudomonas veronii 1

Total 615

2.2. Selección de cepas.

Además de las cepas, se cedieron también los perfiles proteicos de todas las cepas, lo que permitió la construcción de un dendrograma de semejanza en los perfiles de las 615 cepas. Este dendrograma permitió la agrupación de aquellas cepas con perfiles semejantes y se seleccionaron representantes de cada uno de los agrupamientos para su identificación posterior por rpoD. Inicialmente se tomó como criterio un 60% mínimo de semejanza para establecer los grupos. En total se pudieron distinguir 53 grupos tal como se indica en el anexo 1. También se tuvo en cuenta en la elección de las cepas a estudiar los puntos de muestreo del estudio de (Kittinger, 2016) para tener al menos dos representantes de cada punto a ser posible. Las 100 cepas elegidas para este trabajo se relacionan en la Tabla 4 del apartado de Resultados y Discusión.

2.3. Secuenciación del gen rpoD

Para realizar la secuenciación del gen rpoD de cada una de las 100 cepas elegidas se siguió los pasos que se describen con detalle en el anexo 2 y sigue la metodología descrita por Mulet et al. (2009). Las diferentes fases se resumen a continuación.

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7 2.3.1. Extracción de DNA bacteriano.

Las células se cultivaron en 5 ml de medio LB a partir de la colección de cepas conservada a -80°C. Para efectuar la extracción se utilizó el kit comercial “Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit”.

2.3.2. Electroforesis en gel de agarosa.

El gel de electroforesis se hizo para comprobar que se ha llevado a cabo correctamente la extracción del DNA bacteriano, para este paso el gel que se utiliza es agarosa al 1,5%.

2.3.3. Reacción en cadena de la polimerasa PCR

Para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa primero se procedió a hacer diluciones 1:30 de las extracciones de DNA para disminuir la concentración de DNA obtenida en el paso anterior.

Utilizamos la técnica de PCR para llevar a cabo la amplificación del fragmento de DNA en estudio en este caso el gen rpoD, donde se necesita la dilución de DNA 1:30 y se procede a hacer la mezcla que contiene además del DNA un par de primers específicos para el género Pseudomonas, PsEG 30F, PsEG 790R, estos primers delimitan la región que queremos amplificar tal como se ha descrito en (Mulet, Bennasar, Lalucat, & García- Valdés, 2009)

La electroforesis en gel de agarosa se repite después de realizar la PCR para confirmar su ejecución correcta. En este caso el gel que se utiliza es de agarosa al 1%.

2.3.4. Purificación del producto de PCR

Una vez obtenido el producto de PCR se realiza la purificación del producto de DNA para eliminar las sales añadidas en los procesos anteriores y la recuperación del material génico que se puede visualizar como un sedimento al final del proceso que contiene el DNA en estado puro.

Los amplificados por PCR se purifican con el sistema Montage de 96 pocillos (Millipore) utilizando el protocolo descrito en el anexo 2.

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8 2.3.5 Secuenciación

La secuenciación de DNA se realizó por el método descrito por Sanger et al. (1977) marcando el DNA con “BigDye” según se indica en el anexo 2.

2.4. Análisis de las secuencias con las bases de datos NCBI y la propia del laboratorio.

Para realizar el análisis de las secuencias obtenidas se acudió a la base de datos que posee la página del Centro Nacional para la Información Biotecnológica o National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Además, también se hizo una comparación con la base de datos propia del laboratorio donde se comparó los resultados de 98 secuencias obtenidas por medio de secuenciación de rpoD obtenidos contra 179 secuencias de cepas tipo de diferentes especies de Pseudomonas, de esta manera poder observar la similitud que poseen con cada grupo establecido de Pseudomonas y poder realizar una afiliación a especie con un porcentaje >95% y de lo contrario considerarlos como un nuevo taxon.

2.5. Árboles filogenéticos

Para generar los árboles filogenéticos de las secuencias del gen rpoD, se hizo primero un alineamiento de las secuencias de las 100 cepas estudias junto con cepas tipo de cada especie encontrada. Posteriormente se hizo también un alineamiento de las cepas afiliadas a los grupos de P.putida y P. stutzeri incluyendo todas las cepas de la base de datos propia del laboratorio.

A continuación se construyó una matriz de distancias con las alineaciones realizadas tanto para el árbol filogenético de las 100 cepas como para las especies afiliadas a P.putida y P. stutzeri respectivamente. La matriz se calculó por el método de Jukes- Cantor.

Una vez obtenida la matriz de distancia se construyó el dendrograma por el método de neighbor-joining, usando el paquete informático MEGA5 (Tamura, 2011)

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3. Resultados y Discusión

3.1. Selección de microorganismos

Se utilizó el medio LB de forma rutinaria para el cultivo de las 100 cepas objeto de este estudio. Los cultivos se incubaron a 30° durante 24-48h. Se comprobó que eran cultivo puro en placas de LB. La mayor parte de las cepas de estudio crecieron adecuadamente en placas de agar cetrimide (24-48h a 30°), con la excepción de las siguientes:

 JDS02PS001

 JDS02PS004

 JDS02PS008

 JDS02PS025

 JDS38PS002

 JDS68PS028

3.2. Identificación por la secuencia del gen rpoD

Las secuencias obtenidas en el presente estudio se han depositado en la base de datos PseudoMLSA del área de Microbiología de la UIB (Bennasar, 2010).

De las 100 cepas estudiadas, únicamente 2 no se pudieron amplificar con los cebadores selectivos de rpoD diseñados para Pseudomonas. Con objeto de identificar estas cepas se secuenció el gen RNA ribosómico 16S. La cepa JDS02PS025 (que no había crecido en agar cetrimide) se identificó como un miembro del género Arthrobacter ya que la semejanza con la especie más próxima fue del 94 % con Arthrobacter koreensis. La otra cepa, JDS03PS007, se identificó como Brevundimonas terrae ya que la semejanza en la secuencia fue de 99,2 % respecto a la cepa tipo de esta especie.

La identificación de las 98 cepas restantes mediante la secuencia del gen rpoD se indica en la Tabla 4 donde se puede ver la identificación mediante Blast en la base de datos del NCBI y la identificación con la base de datos del laboratorio.

Las relaciones filogenéticas se presentan en el árbol de la figura del anexo 3.

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Tabla 4 Asignación a grupo filogenético o especie de las 100 cepas estudiadas de acuerdo a la semejanza en la secuencia del gen rpoD. El orden en la tabla se ha establecido de acuerdo a la topología del árbol filogenético correspondiente que se incluye como anexo.

Cepa

Identificación por MALDI- TOF/Vitek

Cepa tipo/cepa más

cercana por

secuencia de rpoD en las bases de datos del NCBI

similitud

%

Cepa tipo/cepa más cercana por secuencia de rpoD en las bases de datos del laboratorio

Similitud

%

Asignación a Grupo o Subgrupo filogenético

Afiliación a especie

JDS59PS023 P. veronii P veronii LMG 17761T 99 P. veronii 98,7 P. fluorescens SG* P. veronii JDS59PS024 P.

chlororaphis P. fragi 97 ^{P. fragi} ⁹⁶ P. fragi G* P. fragi

JDS03PS010 P. fluorescens P. monhii 98 P. mohnii 98,4 P. jesseni SG P. mohnii JDS10PS004 P. fluorescens P. koreensis 99 P. koreensis 98,9 P. koreensis SG P. koreensis JDS10PS005 P. fluorescens P. koreensis 99 P. koreensis 98,6 P. koreensis SG P. koreensis JDS28PS053 P.

chlororaphis P. koreensis (SE23 with

95%) 95 P. koreensis 95 P. koreensis SG P. koreensis

JDS38PS032 P.

chlororaphis P. koreensis 96 P. koreensis 95,5 P. koreensis SG P. koreensis

JDS02PS012 P. fluorescens P. moraviensis (98 %

with SE23 ) 96 P. moraviensis 96,5 P. koreensis SG P. moraviensis

JDS02PS013 P. fluorescens P. moraviensis (97 %

with SE18 ) 96 P. moraviensis 96,2 P. koreensis SG P. moraviensis

JDS02PS015 P. fluorescens P. moraviensis 96 P. moraviensis 96,2 P. koreensis SG P. moraviensis JDS28PS098 P. fluorescens P. moraviensis (99 %

with rDWA35 ) 97 P. moraviensis 97,5 P. koreensis SG P. moraviensis

JDS36PS101 P.

chlororaphis P. koreensis 100 P. moraviensis 97,3 P. koreensis SG P. moraviensis JDS38PS017 P. fluorescens P. moraviensis (98 %

with SE18) 96 P. moraviensis 96,6 P. koreensis SG P. moraviensis

JDS38PS022 P. fluorescens

P. moraviensis (98%

WITH SE23 Mulet et

al., 2016) 97

P. moraviensis 97,7 P. koreensis SG P. moraviensis

JDS49PS011 P. fluorescens P. moraviensis 97 P. moraviensis 97,1 P. koreensis SG P. moraviensis JDS02PS007 P. fluorescens P. protegens 99 P. protegens 99,2 P. chlororaphis SG P. protegens JDS02PS006 P. fluorescens

P. protegens (and 99%

with rDWA51a

Sanchez) 95

P. protegens 94,6 P. chlororaphis SG nuevo taxon 01

with rDWA51a

Sanchez) 95

with rDWA51a

Sanchez) 95

with rDWA51a

Sanchez) 95

with rDWA51a

Sanchez) 95

with rDWA51a

Sanchez) 95

with rDWA51a

Sanchez) 95

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JDS08PS004 P. fluorescens P. saponiphila 97 P. saponiphila 97,8 P. chlororaphis SG P. saponiphila JDS28PS082 P. fluorescens P. saponiphila 97 P. saponiphila 97,3 P. chlororaphis SG P. saponiphila JDS49PS007 P.

chlororaphis P. mediterranea CFBP

5447T 92 P. mediterranea 91,8 P. corrugata SG nuevo taxon 02

JDS67PS006 P. fluorescens P. kilonensis 99 P. kilonensis/P. terrae 92,5/92,8 P. corrugata SG nuevo taxon 03 JDS02PS002 P. putida P. entomophila ( 94%

with Pp CFBP 5934) 94 P. entomophila 95,2 P. putida G P. entomophila

JDS36PS069 P. putida P. monteilli 99 P. monteilli 98,6 P. putida G P. monteilli JDS28PS088 P. putida P. monteilli 99 P. monteilli 98,6 P. putida G P. monteilli JDS22PS037 P. putida P. mosselli 99 P. mosselii 98,9 P. putida G P. mosselii JDS22PS042 P. putida P. mosselli 99 P. mosselii 99,8 P. putida G P. mosselii JDS10PS007 P. putida P. putida (100% with

Pp S13.1.2) 96 P. putida 95,8 P. putida G P. putida

JDS10PS010 P. putida

P. soli (98% with CCUG 64951 Mulet et al,

2016) 97

P. soli 97 P. putida G P. soli

P. soli (97% with CCUG 64951 Mulet et al.,

2016) 96

P. soli 95,9 P. putida G P. soli

2016) 96

P. soli (95% with CCUG 64951 Mulet et al,

2016) la seq es regular 94

P. soli 94,4 P. putida G P. soli

JDS03PS001 P. putida P. soli (94% with CCUG

64951) 93 P. soli 95,9 P. putida G P. soli

JDS63PS023 P. viridiflava P. alkylphenolia 95 P. alkylphenolia 94,4 P. putida G nuevo taxon 04 JDS63PS070 P.

chlororaphis P. alkylphenolia 93 P. alkylphenolia 91,8 P. putida G nuevo taxon 05

JDS63PS042 P.

chlororaphis P. vranovensis 88

P.donghuensis

GenomaAJJP01 91,7 P. putida G nuevo taxon 06

P. entomophila L48T (and 94% with SE6

Mulet et al., 2016) 93

P. entomophila/P. mosselii 92,8/93,1 P. putida G nuevo taxon 07

JDS28PS096 P. putida P. entomophila (93%

SE6) 93 P. entomophila/P. mosselii 92,3/92,4 P. putida G nuevo taxon 07

P. entomophila (100%

P. sP. CCUG 58741;

VIII Mulet 2016) 92

P. mosselii (99% with CCUG 58741 Mulet et

al, 2016) 92

al, 2016) 91

P. entomophila (99%

with CCUG 58741

Mulet et al, 2016) 92

P. entomophila 92 P. entomophila/P. mosselii 91,9/91,7 P. putida G nuevo taxon 08 JDS22PS039 P. putida

al, 2016) 90

(16)

12

P. hunanensis (99% P.

sP. CFBP 2461; 98%

P. sP. V289) 89

P. hunanensis/W2Ago4 88.6/99,8 P. putida G nuevo taxon 09

P. japonica JCM 21532T (99% with

FBF35 Farid) 84

P. japonica/S12 81,5/99,4 P. putida G nuevo taxon 10

JDS28PS032 P. viridiflava P. japonica JCM

21532T (1er hit) 84 P. japonica 82,5 P. putida G nuevo taxon 11

JDS59PS015 P. viridiflava P. japonica (99%with

FBF35) 85 P. japonica/S12 82,5/81,9 P. putida G nuevo taxon 11

JDS63PS080 P. oleovorans P. stutzeri gv1 98 P. japonica/S12 82,5/82,8 P. putida G nuevo taxon 12 JDS10PS001 P. putida Pp KT2440 98 P. monteilli/Pp KT2440 94,7/98,8 P. putida G nuevo taxon 13 JDS10PS008 P. putida Pp KT2440 97 P. monteilli/Pp KT2440 94,6/97,5 P. putida G nuevo taxon 13 JDS10PS011 P. putida Pp KT2440 97 P. monteilli/Pp KT2440 94,4/97,7 P. putida G nuevo taxon 13 JDS36PS066 P. putida Pp KT2440 98 P. monteilli/Pp KT2440 93,9/99,2 P. putida G nuevo taxon 13 JDS36PS067 P. putida Pp KT2440 99 P. monteilli/Pp KT2440 93,6/99,2 P. putida G nuevo taxon 13 JDS28PS089 P. putida Pp KT2440 98 P. monteilli/Pp KT2440 93,9/97,8 P. putida G nuevo taxon 13 JDS28PS094 P. putida Pp KT2440 99 P. monteilli/Pp KT2440 94,3/99,1 P. putida G nuevo taxon 13 JDS10PS012 P. putida P. monteilli 93 P. monteilli/Pp BH 92,9/97,1 P. putida G nuevo taxon 14 JDS36PS064 P. putida Pp KT2440 (93% with

SE22) 91 P. monteilli/V222 90.2/91.0 P. putida G nuevo taxon 15

JDS02PS022 P. putida P plecoglossicida

(100% with W619) 91 P. plecoglossicida/W619 89,7/100,0 P. putida G nuevo taxon 16 JDS08PS006 P. putida P. plecoglossicida (98%

with W619) 91 P. plecoglossicida/W619 89,7/ 98,0 P. putida G nuevo taxon 16 JDS28PS079 P. putida P. plecoglossicida (99%

with Pp W619) 91 P. plecoglossicida/W619 89,7/100,0 P. putida G nuevo taxon 16 JDS28PS084 P. fluorescens

P. plecoglossida 98 P. plecoglossicida/W619 89,6/ 99,8 P. putida G nuevo taxon 16 JDS28PS085 P. fluorescens P. plecoglossida (W619

with 99%) 90 P. plecoglossicida/W619 89,6/100,0 P. putida G nuevo taxon 16 JDS28PS086 P. putida P. plecoglossicida (99%

with Pp W619) 91 P. plecoglossicida/W619 89,7/100,0 P. putida G nuevo taxon 16 JDS36PS040 P. mendocina

Pp W619 100 P. plecoglossicida/W619 89,7/100,0 P. putida G nuevo taxon 16 JDS02PS005 P. mendocina

P. guguanensis (and 100% with SD142

Scotta) 99

P. guguanensis 99,2 P. oleovorans G P. guguanensis

JDS02PS003 P. oleovorans P. sihuiensis 95 P. sihuensis 95,8 P. oleovorans G P. sihuensis JDS02PS026 P. mendocina P. sihuiensis 95 P. sihuensis 95,8 P. oleovorans G P. sihuensis JDS03PS009 P. mendocina P. sihuiensis strain

KCTC 32246T 95 P. sihuensis 95,8 P. oleovorans G P. sihuensis

JDS28PS118 P. mendocina P. sihuiensis 98 P. sihuensis 98,4 P. oleovorans G P. sihuensis JDS63PS013 P. oleovorans P. sihuiensis 98 P. sihuensis 98,1 P. oleovorans G P. sihuensis JDS68PS008 P. oleovorans P. sihuiensis 98 P. sihuensis 98,4 P. oleovorans G P. sihuensis JDS68PS019 P. oleovorans P. sihuiensis 98 P. sihuensis 97,8 P. oleovorans G P. sihuensis JDS03PS008 P. oleovorans P. oleovorans 99 P. oleovorans 99,8 P. oleovorans G P. oleovorans JDS36PS078 P. oleovorans P. oleovorans 99 P. oleovorans 100 P. oleovorans G P. oleovorans JDS38PS002 P. oleovorans P. oleovorans 99 P. oleovorans 100 P. oleovorans G P. oleovorans JDS68PS018B P. oleovorans P. oleovorans (Morfo A

y B son iguales 99 P. oleovorans 99,7 P. oleovorans G P. oleovorans

JDS68PS025 P. oleovorans P. oleovorans 99 P. oleovorans 99,7 P. oleovorans G P. oleovorans JDS68PS028 P. oleovorans P. oleovorans 99 P. oleovorans 99,7 P. oleovorans G P. oleovorans

(17)

13

JDS68PS031 P. oleovorans P. oleovorans 99 P. oleovorans 99,7 P. oleovorans G P. oleovorans JDS63PS008 P. mendocina P. alcaliphila 93 P. alcaliphila 93,5 P. oleovorans G nuevo taxon 17

JDS28PS114 P. aeruginosa P. citronellolis 96 P. citronellolis 99,5 P. aeruginosa G P. citronellolis JDS28PS093 P. aeruginosa P. nitroreducens (1er

hit) 96 P. nitroreducens 95,5 P. aeruginosa G P. nitroreducens

JDS63PS055 P. alcaligenes P. resinovorans 98 P. resinovorans 98,1 P. aeruginosa G P. resinovorans JDS63PS033 P. stutzeri

P. stutzeri WM88 gv3 99 P.kunmingensis/DSM50227gv3 94,7/99,1 P. stutzeri G P. stutzerigv3 JDS02PS001 P. stutzeri

P. stutzeri gv1 99 P. stutzeri CCUG11256Tgv1 99,1 P. stutzeri G P. stutzeri gv1 JDS02PS004 P. stutzeri

P. stutzeri gv1 99 P. stutzeri CCUG11256Tgv1 97,5 P. stutzeri G P. stutzeri gv1

16S rRNA

JDS02PS025 P. stutzeri Arthrobacter koreensis 94 Arthrobacter koreensis 94 JDS03PS007 P. fluorescens Brevundimonas terrae 99 Brevundimonas terrae KSL-

145(T) 99,2

*G o SG: grupo o subgrupo filogenético basado en la secuencia de 4 genes dentro del género Pseudomonas (Mulet, Bennasar, Lalucat, & García-Valdés, 2009).

Se pudieron identificar 57 cepas a nivel de especie por presentar más del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD. Se distribuyeron en 19 especies diferentes, siendo las más abundantes P. moraviensis y P. soli (8 cepas cada una de ellas). Por abundancia, la siguiente especie detectada fue P. stutzeri, con 6 cepas pertenecientes a la genomovar 1 y otra adicional a la genomovar 3 (Tabla 5).

Tabla 5 Número de cepas identificadas distribuidas en 19 especies de Pseudomonas.

P. citronellolis 1 P. monteilli 2 P. putida 1 P. stutzeri gv3 1

P. entomophila 1 P. moraviensis 8 P. resinovorans 1 P. veronii 1

P. fragi 1 P. mosselii 2 P. saponiphila 2

P. guguanensis 1 P. nitroreducens 1 P. sihuensis 7

P. koreensis 4 P. oleovorans 7 ^{P. soli} 8

P. mohnii 1 P. protegens 1 P. stutzeri gv1 6

(18)

14

El resto de cepas de Pseudomonas, 41 cepas, no podían asignarse a ninguna especie descrita por tener menos del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD por lo que fueron consideradas como representantes de 17 nuevos taxones, que requieren estudios taxonómicos más precisos para confirmar la asignación a alguna especie conocida o para proponerlos como especies nuevas..

Tabla 6 Cepas identificadas como nuevos taxones

3.3. Análisis de las identificaciones obtenidas por los dos métodos

Un aspecto interesante a considerar es la correlación que debe existir entre la agrupación de las cepas por sus perfiles proteicos de MALDI-TOF y por la secuencia del gen rpoD (Scotta, Gomila, Mulet, Lalucat, & García-Valdés, 2013).

Además de las 41 cepas que por rpoD no pueden identificarse a nivel de especie y que son posibles representantes de especies nuevas aun no descritas, se detectaron tan solo 16 cepas cuya identificación por MALDI-TOF coincidía con la identificación por rpoD (P. veroni -1 cepa, P. putida -1 cepa, P. oleovorans -7 cepas y P. stutzeri -7 cepas) tal como se muestra en la Tabla 7. Cuarenta y una cepas se habían asignado por MALDI- TOF a una especie errónea y 42 corresponden a probables nuevos taxones. Esta importante discrepancia podemos atribuirla a que la base de datos utilizada para comparar los perfiles proteicos de las cepas (Vitek) está diseñada para la identificación de cepas procedentes de muestras clínicas y es incompleta. Muchas especies detectadas son típicamente ambientales y no están representadas en las bases de datos comerciales.

Nuevo Taxon Número de

cepas Nuevo Taxon Número de

cepas

nuevo taxon 01 7 nuevo taxon 09 1

nuevo taxon 17 1

(19)

15

Tabla 7 En la tabla se indican las cepas en las que se ha visto que existe una discrepancia en la identificación por MALDI-TOF y por secuencia del gen rpoD. Se puede observar el número y afiliación de grupos que se consideraron en base al dendrograma obtenido por los perfiles proteicos de MALDI-TOF. La asignación a especie por rpoD se puede ver también en la tabla 4.

Para mayor claridad, esta misma tabla se presenta también como anexo ordenándola por grupos de MALDI-TOF, por la identificación por MALDI-TOF/Vitek y por la identificación por la secuencia de rpoD.

Cepa

Grupos por MALDI-

TOF

Identificación por MALDI-TOF

Identificación por rpoD

JDS59PS023 46 P. veroni P.veronii JDS59PS024 28 P. chlororaphis P. fragi JDS10PS004 29 P. fluorescens P. koreensis JDS10PS005 29 P. fluorescens P. koreensis JDS28PS053 29 P. chlororaphis P. koreensis JDS38PS032 29 P. chlororaphis P. koreensis JDS02PS012 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS02PS013 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS02PS015 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS28PS098 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS36PS101 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS38PS017 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS38PS022 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS49PS011 29 P. fluorescens P. moraviensis JDS03PS010 27 P. fluorescens P. mohnii JDS02PS007 27 P. fluorescens P. protegens JDS02PS006 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS02PS016 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS02PS020 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS10PS002 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS28PS081 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS08PS001 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS67PS009 27 P. fluorescens nuevo taxon 01 JDS08PS004 27 P. fluorescens P. saponiphila JDS28PS082 27 P. fluorescens P. saponiphila JDS49PS007 32 P. chlororaphis nuevo taxon 02 JDS67PS006 27 P. fluorescens nuevo taxon 03 JDS02PS002 4 P. putida P. entomophila

JDS10PS007 10 P.putida P. putida

(20)

16

JDS10PS001 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS10PS008 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS10PS011 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS36PS066 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS36PS067 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS28PS089 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS28PS094 10 P.putida nuevo taxon 14 JDS10PS012 10 P.putida nuevo taxon 15 JDS36PS064 10 P.putida nuevo taxon 16 JDS36PS069 10 P.putida P. monteilli JDS28PS088 10 P.putida P. monteilli

JDS22PS037 5 P.putida P. mosselii

JDS22PS042 5 P.putida P. mosselii

JDS10PS010 51 P.putida P. soli

JDS28PS080 5 P.putida nuevo taxon 07

JDS02Ps021 5 P.putida nuevo taxon 08

JDS63PS023 39 P. viridiflava nuevo taxon 04 JDS63PS070 35 P. chlororaphis nuevo taxon 05 JDS63PS042 35 P. chlororaphis nuevo taxon 06 JDS02PS023 8 P. putida nuevo taxon 09 JDS08PS005 29 P. fluorescens nuevo taxon 10 JDS28PS032 37 P. viridiflava nuevo taxon 11 JDS59PS015 37 P. viridiflava nuevo taxon 11 JDS63PS080 38 P. oleovorans nuevo taxon 13 JDS02PS022 8 P. putida nuevo taxon 17 JDS08PS006 8 P. putida nuevo taxon 17 JDS28PS079 8 P. putida nuevo taxon 17 JDS28PS084 29 P. fluorescens nuevo taxon 17 JDS28PS085 29 P. fluorescens nuevo taxon 17 JDS28PS086 8 P. putida nuevo taxon 17 JDS36PS040 8 P.putida nuevo taxon 17 JDS02PS005 42 P. mendocina P. guguanensis

(21)

17

JDS02PS003 41 P. oleovorans P. sihuensis JDS02PS026 41 P. mendocina P. sihuensis JDS03PS009 41 P. mendocina P. sihuensis JDS28PS118 41 P. mendocina P. sihuensis JDS63PS013 42 P. oleovorans P. sihuensis JDS68PS008 42 P. oleovorans P. sihuensis JDS68PS019 42 P. oleovorans P. sihuensis JDS03PS008 41 P. oleovorans P. oleovorans JDS36PS078 42 P. oleovorans P. oleovorans JDS38PS002 42 P. oleovorans P. oleovorans JDS68PS018B 42 P. oleovorans P. oleovorans JDS68PS025 42 P. oleovorans P. oleovorans JDS68PS028 42 P. oleovorans P. oleovorans JDS68PS031 42 P. oleovorans P. oleovorans JDS63PS008 43 P. mendocina nuevo taxon 19 JDS28PS114 49 P. aeruginosa P. citronellolis JDS28PS093 49 P. aeruginosa P. nitroreducens JDS63PS055 44 P. alcaligenes P. resinovorans JDS63PS033 2 P. stutzeri P. stutzeri JDS02PS001 1 P. stutzeri P. stutzeri JDS02PS004 1 P. stutzeri P. stutzeri JDS02PS008 1 P. stutzeri P. stutzeri JDS03PS002 1 P. stutzeri P. stutzeri JDS03PS003 1 P. stutzeri P. stutzeri JDS68PS016 1 P. stutzeri P. stutzeri

Cabe destacar que todas las cepas de P. stutzeri aparecían agrupadas en el dendrograma de los perfiles de MALDI-TOF (grupos 1 y 2) por lo que ésta es una muy buena herramienta para detectar rápidamente y con fiabilidad cepas de la especie.En el dendrograma de P. stutzeri se observó la diversidad dentro de la especie que se refleja en el nivel genético, se tomó en cuenta las secuencias de referencia de cepas de P.

stutzeri que se han agrupado en genomovares, de 1 a 22.

Las relaciones filogenéticas de las 7 cepas afiliadas a P. stutzeri que se detectaron en este estudio pertenecen a las genomovares 1 y 3 que se pueden observar en el dendrograma en el anexo 4.

(22)

18

Tabla 8 Cepas del grupo P. stutzeri y a las genomovares a que pertenecen Cepa Cepa tipo Porcentaje Asignación JDS02PS001 CCUG11256Tgv1 99,1 genomovar 1

JDS02PS004 A95/69gv1 99 genomovar 1

JDS68PS016 A95/69gv1 98,3 genomovar 1

JDS02PS008 CCUG11256Tgv1 99,3 genomovar 1 JDS03PS002 CCUG11256Tgv1 99,3 genomovar 1 JDS03PS003 CCUG11256Tgv1 99,2 genomovar 1 JDS63PS033 DSM50227gv3 99,1 genomovar 3

Para P. putida primero se observó la organización de las cepas tipo dentro del grupo; para ser utilizado como base para poder considerar la existencia de nuevos taxones dentro del mismo.

Existen 12 representantes de los 17 nuevos taxones que hemos considerado como posibles nuevas especies. Se puede observar en el anexo 4.

Las agrupaciones por los perfiles de proteínas en el dendrograma están obviamente de acuerdo con la identificación por VITEK de las cepas, pero la identificación se limita a unas pocas especies. En el caso de las cepas identificadas como P. stutzeri, los resultados del análisis por la secuencia del gen rpoD son perfectamente concordantes, e incluso diferencia a las cepas de las 2 genomovares detectadas. No obstante, en el caso de las cepas inicialmente identificadas como P. putida se distribuyen en 5 agrupamientos, aunque todos menos 1 en la misma rama del dendrograma: grupos 4 (1 cepa), 5 (17 cepas), 8 (6 cepas), 10 (12 cepas) y 51 (1 cepa). La identificación por rpoD nos demuestra que en realidad se trata de cepas pertenecientes a 5 especies reconocidas distintas y a 7 posibles taxones nuevos, aunque todos dentro de la rama filogenética de P. putida y los agrupamientos del dendrograma no reflejan exactamente las especies a las que se asignan las cepas. Por tanto, la identificación por los perfiles de proteínas por MALDI-TOF no es suficientemente discriminativa a nivel de especie, aunque sí da una buena idea de los grupos filogenéticos que se distinguen en el género Pseudomonas tal como se puede ver en el anexo 5.

Otro ejemplo es el grupo 29 de MALDI-TOF cuyas cepas se identificaron inicialmente como P. fluorescens, pero en realidad demostramos por la secuencia del gen rpoD que incluye a todas las cepas asignadas a las especies P. koreensis, P. moraviensis y 2 posible nuevos taxones. Todas ellas pertenecen al subgrupo filogenético de P.

koreensis, dentro del grupo de P. fluorescens.

(23)

19

4. Conclusiones

 Se realizó la secuenciación del gen rpoD de las 100 cepas elegidas para este estudio con el uso de cebadores diseñados que son selectivos en la detección de Pseudomonas, no hubo problema en la secuenciación de 98 cepas, sin embargo 2 de ellas no pudieron ser amplificados y se realizó por secuenciación del gen RNA ribosómico 16S. La cepa JDS02PS025 se identificó como un miembro del género Arthrobacter con una similitud 94 % con Arthrobacter koreensis. La otra cepa, JDS03PS007, se identificó como Brevundimonas terrae con una similitud de 99,2 % respecto a la cepa tipo de esta especie. Por tanto, se ha confirmado que los cebadores selectivos diseñados para el género Pseudomonas han sido útiles en la asignación de cepas al género, no amplificando cepas de oros géneros. Muy probablemente las 2 cepas de otros géneros se deban a una contaminación en el proceso de envío de cepas de un laboratorio a otro.

 Se compararon las identificaciones obtenidas por los métodos de MALDI-TOF y rpoD. Existe una buena correspondencia entre los agrupamientos de los perfiles proteicos y los grupos o subgrupos filogenéticos establecidos previamente en el género. No obstante, la identificación a nivel de especie por MALDI-TOF no es suficiente, porque la base de datos no incluye muchas especies de origen ambiental. Además, algunas especies de un mismo grupo o subgrupo filogenético no se pueden discriminar por MALDI-TOF.

 Al realizar la comparación de las secuencias con la base de datos del NCBI y con la base de datos propia del laboratorio se revisó la similitud que poseen las secuencias estudiadas con cada grupo establecido de Pseudomonas tomando en cuenta un porcentaje >95% para poder hacer una afiliación a especie. Se observó que 41 cepas no cumplían con este requisito teniendo una similitud por debajo del 95% por lo que se consideran representantes de nuevas especies bacterianas que deben estudiarse con más detalle desde el punto de vista taxonómico. El hecho de que se hayan detectado 17 posibles nuevas especies dentro de los aislados del río Danubio indica que la diversidad de especies dentro del género es muy superior a la que actualmente conocemos.

(24)

20 Expresiones de Gratitud

Quiero dar las gracias a Magdalena Mulet y a Jorge Lalucat por sus conocimientos y valiosa colaboración durante todo el trabajo.

Bibliografía

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(25)

ANEXOS

(26)

JDS02PS001 JDS02PS004 JDS03PS002 JDS03PS003 JDS02PS008 JDS63PS033 JDS68PS016 JDS02PS002 JDS22PS001 JDS36PS003 JDS36PS046 JDS36PS073 JDS38PS018 JDS02PS019 JDS03PS001 JDS28PS019 JDS28PS034 JDS28PS038 JDS10PS009 JDS36PS105 JDS28PS049 JDS22PS025 JDS22PS043 JDS22PS044 JDS22PS022 JDS22PS046 JDS28PS010 JDS10PS006 JDS36PS030 JDS28PS112 JDS28PS091 JDS63PS100 JDS28PS026 JDS22PS017 JDS22PS024 JDS36PS014 JDS22PS019 JDS22PS028 JDS36PS055 JDS28PS108 JDS28PS103 JDS38PS030

Anexo 1

Selección de las 100 cepas de estudio y la distinción de los 53 grupos dentro de la identificacion realizada por MALDI-TOF