Effekt av kondisjonert medie fra hPEC og PANC-1 på metabolisme i
muskelceller
Awais Ur Rehman Saqib
Masteroppgave for graden Master i Farmasi
45 studiepoeng
Avdeling for farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
November 2021
II
III
Effekt av kondisjonert medie fra hPEC og PANC-1 på metabolisme i
muskelceller
Awais Ur Rehman Saqib
Masteroppgave for graden Master i Farmasi
45 studiepoeng
Avdeling for farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet
UNIVERSITETET I OSLO
November 2021Veiledere:
Førsteamanuensis Eili Tranheim Kase Stipendiat Solveig Astrid Krapf
Postdoktor Jenny Lund
IV
© Awais Ur Rehman Saqib 2021
Effekt av kondisjonert medie fra hPEC og PANC-1 på metabolisme i muskelceller Awais Ur Rehman Saqib
http://www.duo.uio.no/
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
V
Forord
Denne masteroppgaven ble utført ved Avdeling for farmasøytisk biovitenskap under veiledning av førsteamanuensis Eili Tranheim Kase, stipendiat Solveig Astrid Krapf og postdoktor Jenny Lund. Arbeidet ble påbegynt i august 2020, og avsluttet i november 2021.
En stor takk rettes til mine veiledere: Eili Tranheim Kase og Solveig Astrid Krapf for deres tett oppfølging, oppmuntring, korrekturlesing, hjelp med resultatene og nyttige tilbakemeldinger hele veien. Takk til Jenny Lund for god støtte og kyndig assistanse under utformingen av denne oppgaven. En stor og spesiell takk rettes til Hege Gilbø Bakke for uvurderlig hjelp i laboratoriet.
Takk også til Camilla Stensrud for opplæring i laboratoriet. Denne oppgaven hadde ikke blitt til uten deres støtte, tålmodighet, engasjement og faglige kunnskaper!
Til mine venner og medstudenter: Studietiden hadde rett og slett ikke vært den samme uten dere. En stor takk til Nima for sine verdifulle tilbakemeldinger på oppgaven.
Til min fantastiske familie: Takk for deres støtte gjennom den lange studietiden, særlig mamma og pappa. Takk for at dere alltid har vært der for meg.
Oslo, november 2021 Awais Ur Rehman Saqib
VI
Sammendrag
Bakgrunn: Pankreaskreftceller skiller ut peptider som kan endre energimetabolismen i muskelceller. Foreløpig er det gjort få studier som har undersøkt hvordan pankreaskreft påvirker humane muskelceller. I denne oppgaven ble det undersøkt kommunikasjon mellom pankreaskreftcellelinjen (PANC-1) og muskelceller. Dette ble gjennomført ved å behandle humane skjelettmuskelceller med kondisjonert medie fra PANC-1 og primære pankreasceller (hPEC).
Metode: Genekspresjon av utvalgte gener i hPEC, PANC-1 og muskelceller ble undersøkt ved å benytte kvantitativ polymerasekjedereaksjon. Resterende forsøk ble gjennomført på muskelceller kondisjonert med medium fra hPEC (CM hPEC) og PANC-1 (CM PANC-1):
Subtratoksidasjonsmetoden ble brukt til å undersøke glukose- og oljesyremetabolisme ved å benytte henholdsvis D[14C(U)]glukose og [1- 14C]oljesyre. Fosforylering av AKT og AS160 ble undersøkt vha Western immunoblotting. D[14C(U)]glukose ble benyttet for å måle effekten av glykogensyntesen.
Resultater: Genuttryk av interleukin-6 (IL-6) og activin var signifikant lavere i PANC-1 enn i hPEC når resultatene var korrigert for RPLP0, et referansegen. Behandling med antimycin A og rotenon, og oligomycin førte til signifikant reduksjon av total opptak av 14C-glukose i CM CM PANC-1 sammenlignet med CM hPEC. FCCP førte til signifikant reduksjon i oksidasjon av 14C-oljesyre i CM PANC-1 sammenlignet med CM hPEC. Insulineffekten på pAS160/total AS160 i CM PANC-1 var signifikant lavere enn i basal medium og CM hPEC. Samtidig så vi en tendens til redusert insulineffekt i CM PANC-1 sammenlignet med CM hPEC.
Genekspresjon av IL-6 og metabolske kjernereseptorer viste noe tendens til redusert genuttrykk i CM PANC-1 enn i CM hPEC. UQCRB var signifikant lavere i CM PANC-1 sammenlignet med CM hPEC.
Konklusjon: Endringene i både de metabolske parametrene, protein uttrykk og genekspresjon vist i denne oppgaven, kan tyde på at det er en kommunikasjon mellom muskelceller og pankreaskreftceller. Videre studier er nødvendige for å kartlegge konsekvensene av denne kommunikasjonen.
VII
Forkortelser
5-FU fluorouracil
ACC acetyl-CoA-karboksylase ACLY ATP-sitratlyase
ADP Adenosin difosfat AKT Proteinkinase B
AMPK 5’ AMP-aktivert proteinkinase AS160 Akt-substrat på 160 kDa ATP Adenosin trifosfat Basal Basal PANC-1 medium BSA Bovint serumalbumin CA Celleassosiert radioaktivitet CACT karnitin: acylkarnitin-translokase
CoA Koenzym A
cDNA Komplementær deoksyribonukleinsyre
CM hPEC Muskelceller kondisjonert med medium fra hPEC CM PANC-1 Muskelceller kondisjonert med medium fra PANC-1 CO2 Karbondioksid
CPT1 Karnitin palmitoyltransferase-1 CRP C-reaktivt protein
DMEM «Dulbecco’s Modified Eagle medium» (Serumfritt differensieringsmedium) DMSO Dimetylsulfoksid
DNA Deoksyribonukleinsyre
DPBS Dulbecco fosfatbufret saltvann
ERCP endoskopisk retrograd choledochopankreaticografi EtOH etanol
VIII
FABP Fettsyrebindende protein
FADH2 Redusert form av flavin-adenin-dinukleotid (FAD) FASN Fettsyresyntase
FAT/ CD36 Fettsyrebindende protein/ «cluster of differentiation 36»
FCCP Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone FDG fluordeoksyglukose
FFA Fri fettsyrer
GAPDH Glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase GDF-8 Differensieringsfaktor-8
GLUT Glukosetransportør
H2O Vann
HIF Hypoksi-induserende faktor
hPEC Humane primære epitelceller fra pankreas IFN Interferoner
IL Interleukiner
IRS Insulinreseptorsubstrat KMI Kroppsmasseindeks KOH Kaliumhydroksid
KRAS Kirsten rottesarkomvirus (basert på hvor onkogenet først ble identifisert) LPL lipoprotein lipase
LXR Lever X reseptor
MAGL Monoacylglyserollipase
NAD+ Nikotinamiddinukleotid i oksidert form NADH Nikotinamiddinukleotid i redusert form NaOH Natriumhydroksid
NF-κB Kjernefaktor kappa beta
NGICG Norsk Grastrointestinal Cancergruppen
IX PI3k Fosfoinositid 3-kinase
pAKT fosforylert Proteinkinase B PANC-1 pankreaskreftcellelinje
PanIN pankreatisk intraepitelial neoplasi pAS160 Fosforylert Akt-substrat på 160 kDa PDAC Adenokarsinom av duktal type PET Positronemisjonstomografi
PGC1α PPAR-γ koaktivator-1α
PPAR Peroksisomproliferator-aktivert reseptor qPCR Kvantitativ polymerasekjedereaksjon RNA Ribonukleinsyre
ROS Reaktive oksygenforbindelser
RPLP0 Syreholdig ribosomalt fosfoprotein 0 Rpm Rotasjon per minutt
SEM Standardfeilen til gjennomsnittet
SREBP Sterolregulerende element bindingsprotein TAG Triglyserid
TGF-β transformerende vekstfaktor-β TNF-α tumornekrosefaktor-alfa TTBS Tween-Tris-bufret saltvann
UQCRB Ubiquinol cytokrom c reduktase bindingsprotein
X
Innholdsfortegnelse
Forord ... V Sammendrag ... VI Forkortelser ... VII
1 Innledning ... 2
1.1 Skjelettmuskel ... 2
1.2 Pankreas ... 3
1.3 Kreft ... 4
1.4 Pankreaskreft ... 5
1.5 Kommunikasjon mellom pankreaskreft og muskelceller ... 6
1.6 Kakeksi ved pankreaskreft ... 7
1.7 Insulinsignalisering ... 8
1.8 Metabolisme ... 9
1.8.1 Glukosemetabolisme i muskelceller ... 9
1.8.2 Glukosemetabolisme i kreftceller ... 10
1.8.3 Fettsyremetabolisme i muskelceller ... 11
1.8.4 Fettsyremetabolisme i kreftceller ... 13
1.9 Modulatorer av mitokondriell oksidativ fosforylering ... 15
1.10 Mål for oppgaven ... 16
2 Materiale og metode ... 17
2.1 Materialer ... 17
2.1.1 Kjemikalier og reagenser ... 17
2.1.2 Utstyr ... 19
2.2 Humane primære epitelceller fra pankreas (hPEC) ... 21
2.2.1 Utsåing ... 21
2.2.2 Proliferasjon og splitting ... 21
2.3 Pankreaskreftcellelinjen (Panc-1) ... 22
2.3.1 Utsåing ... 22
2.3.2 Proliferasjon og splitting ... 22
2.4 Humane skjelettmuskelceller ... 22
2.4.1 Donorkarakteristika ... 22
2.4.2 Utsåing ... 23
XI
2.4.3 Splitting ... 23
2.4.4 Proliferasjon og differensiering ... 23
2.5 Forsøk med kondisjonert medium ... 24
2.5.1 Uttak av kondisjonert medium fra celleflasker ... 24
2.5.2 Glukosejustering av kondisjonert medium ... 24
2.5.3 Behandling av humane muskelceller med kondisjonert medium ... 25
2.6 Kvantitativ real-time polymerasekjedereaksjon (qPCR) ... 25
2.6.1 Utsåing og høsting av hPEC og Panc-1 celler til qPCR ... 25
2.6.2 Utsåing og høsting av humane muskelceller kondisjonert med medie fra hPEC og Panc-1 celler til qPCR ... 25
2.6.3 Isolering av RNA ... 26
2.6.4 Kvantifisering av RNA med NanoDrop ... 27
2.6.5 cDNA-syntese ... 27
2.6.6 qPCR ... 27
2.7 Substratoksidasjonsmetoden ... 28
2.7.1 Substratoksidasjonsforsøk ... 28
2.7.2 Effekt av antimycin A, rotenon, oligomycin og FCCP ... 30
2.7.3 Celleassosiert radioaktivitet (CA) ... 30
2.7.4 Bradford proteinmåling ... 31
2.8 Glykogensyntese ... 31
2.8.1 Tillagaing og tilsetting av isotopmedium ... 31
2.8.2 Glykogensyntese ... 32
2.8.3 Pierce proteinmåling ... 32
2.9 Westernblotting ... 33
2.9.1 Utsåing, dyrking og høsting av celler ... 33
2.9.2 Gelektroforese ... 33
2.9.3 Blotting ... 34
2.9.4 Blokking med primære- og sekundærantistoff ... 34
2.9.5 Fremkalling ... 35
2.9.6 Stripping og reblokking av membran ... 35
2.9.7 Statistikk ... 35
3 Resultater ... 36
3.1 Genekspresjon av utvalgte gener i hPEC og PANC-1 ... 36
XII
3.2 Metabolisme i muskelceller ... 37
3.2.1 Glukosemetabolisme ... 37
3.2.2 Oljesyremetabolisme ... 39
3.3 Glykogensyntese ... 40
3.4 Fosforylering av AKT og AS160 ... 41
3.5 Genekspresjon i muskelceller ... 43
4 Diskusjon ... 44
4.1 Vurdering av metodikken ... 44
4.1.1 Cellemodellene ... 44
4.1.2 Metoder benyttet til å måle energimetabolisme og genekspresjon ... 45
4.2 Genekspresjon av utvalgte gener i hPEC og PANC-1 ... 45
4.3 Glukosemetabolisme i myotuber etter behandling med kondisjonert medie fra pancreasceller ... 46
4.4 Oljesyremetabolisme i myotuber etter behandling med kondisjonert medie fra pancreasceller ... 47
4.5 Glykogensyntese i myotuber etter behandling med kondisjonert medie fra pancreasceller ... 48
4.6 Insulinsignalisering i myotuber etter behandling med kondisjonert medie fra pancreasceller ... 48
4.7 Genekspresjon i myotuber etter behandling med kondisjonert medie fra pancreasceller ... 49
4.8 Veien videre ... 50
5 Konklusjon ... 52
Litteraturliste ... 53
Vedlegg ... 61
2
1 Innledning
1.1 Skjelettmuskel
Tverrstripet skjelettmuskulator utgjør ca. 80 % av kroppens totale muskelvev og består av omtrent 600 muskler. Hver muskel består av muskelceller, bindevev, blodårer og nerver.
Hovedfunksjonene til disse musklene er å bevege kroppen, justere kroppsstillinger, støtte og beskytte innvollene, kontrollere kroppens åpninger, regulere blodstrøm og bidra til jevn temperatur. Skjelettmuskelceller dannes i forstadiet ved fusjon av embryonale celler (myoblaster) til muskelceller (myotuber, også kalt muskelfibre). En muskelcelle har derfor mange cellekjerner, og hver kjerne reflekterer bidraget fra en myoblast. Ferdig utvokste muskelfibre har lengde på noen få centimeter og en diameter på 0,01-0,1mm, avhengig av personens trenings nivå (1).
Muskelfibrene er tettpakket med myofibriller og utgjør mesteparten av muskelfibrene.
Myofibrillene består av to typer filamenter, proteinene aktin og myosin, som følger et fast mønster. Dette mønsteret gir den karakteristiske tverrstripte strukturen. Sarkomerene er de minste enhetene i den strukturen og består av aktin- og myosinfilamenter (1).
Muskelfibrene kan deles inn i fire hovedtyper etter evne til å kontrahere raskt og motstå næringsmangel. Type I-fibre har høy oksidativ kapasitet og er egnet for langvarige kontraksjoner og i mange repetisjoner. Type IIa-fibre har lavere oksidativ kapasitet, men høyere glykolytisk kapasitet og kan kontrahere raskt, noe som gjør dem egnet for korte og kraftige kontraksjoner. Type IIx -fibre har omtrent kun glykolytisk kapasitet i mennesker og de er sensitive for næringsmangel. Hos gnagere er type IIx -fibre mer oksidative. Type IIb-fibre finnes bare hos gnagere og ligner type IIx-fibre hos mennesker (2).
Kontraksjon i skjelettmusklene styres av det somatisk motoriske nervesystemet. Når muskelfibrene trekker seg sammen, forkortes sarkomerene ved at myosinfilamentene forskyves i forhold til hverandre, slik at overlapping øker mellom aktin- og myosinfilamentene. Når et aksjonspotensial sprer seg gjennom muskelen begynner hodet på myosin å bevege seg langs aktinfilamentet i gjentatte sykluser. Myosinhodet binder og hydrolyserer ett ATP-molekyl i hver syklus. Når kontraksjon er over mister myosinhodet kontakten med aktinfilamentet og muskelen hviler (1).
3 Skjelettmuskler inneholder stamceller, også kalt satellittceller, plassert mellom plasmamembran og basal membran av muskelfiber. Satellittceller ble først beskrevet i froskemuskel i 1961 av Alexander Mauro (3). De er vanligvis passive, men aktiveres når de blir utsatt for stress, for eksempel skade eller muskelvekst. Ved aktivering vil satellittcellene migrere til de aktuelle områdene og differensiere seg til nye myoblaster. De vil deretter fusjonere med eksisterende muskelfibre eller fusjonere med hverandre og danne nye flerkjernede myotuber (4). Isolerte satellittceller har evnen til å gjennom gå den samme prosessen in vitro, og kan derfor brukes til forsøk. Cellene kan påvirkes av vekstfaktorer, omliggende celler og vekstmedium (5).
1.2 Pankreas
Pankreas, også kalt bukspyttkjertelen, er en langstrakt kjertel som ligger på tvers i bukhulen, bak magesekken som vist i figur 1.1. Pankreas spiller en sentral rolle i fordøyelse og absorpsjon av næringsstoffene. Den består av en endokrin del og en eksokrin del (1).
Figur 1.1: Illustrasjon av pankreas. Pankreas ligger på tvers i bukhulen, bak magesekken. Kjertelen består av en endokrin del og en eksokrin del. Den endokrine delen skiller ut hormoner til blodbanen, mens den eksokrine delen skiller ut bukspytt med enzymer til tarmen. Bildet fra (6)
4
Den endokrine delen skiller ut hormoner som insulin og glukagon. Insulin senker sukkerinnholdet i blodet ved å ta opp sukker i vevet og fremmer dannelsen av glykogen i leveren. Glukagon, derimot, øker sukkerinnholdet i blodet ved nedbrytning av glykogen (7).
Den eksokrine delen utgjør en stor del av kjertelen og skiller ut bukspytt (1). Bukspytt er pankreassaft som inneholder forskjellige enzymer som tømmes ut i tarmen (8). Sekresjon fra den eksokrine delen reguleres av gastrointestinale peptidhormoner. Sekretet føres over i et kanalsystem hvor det til slutt samles i en felles, stor gang, som leder en blanding av bukspytt og galle inn i duodenum (1).
1.3 Kreft
Kreft er en fellesbetegnelse på en gruppe sykdommer med unormal cellevekst som skyldes økt celledeling eller redusert celledød. Forandringer i DNA spiller en viktig rolle både i initiering og progresjon av kreft (9). Kreftsvulst, eller ondartet neoplasi, følger ikke de naturlige prosessene som skal forhindre celler i å vokse utover normal størrelse, sted og næringsforhold (10).
Forskere har kommet frem til seks egenskaper som kjennetegner kreftceller – motstandsdyktige mot apoptose (I), selvforsyning av vekstsignaler (II), motstandsdyktige mot anti-vekst signaler (III), evne til vevsinvasjon og metastasering (IV), ubegrenset potensial til replikasjon (V) og evne til å stimulere kardannelse gjennom angiogenese (VI) (11,12). Likevekten mellom celler og vev er forstyrret i kreftsvulster. Inaktivering av svulstundertrykkende gener fører til at cellene vokser autonomt uten å sikre at antall celler, funksjon og lokalisering er tilpasset behovet (9,13). Kreftsvulsten vil vokse inn i omgivende vev, slik at avgrensingen blir ujevn, og etterhvert spre seg til andre vev og organer. Denne spredningsprosessen kalles metastasering(14).
En egenskap som skiller ondartete svulster fra godartete svulster er de-differensiering og tap av funksjon. Differensiering gjør at celler utvikler seg i forskjellige retninger til en bestemt type og funksjon. Kreftceller, derimot, de-differensieres slik at det fører til tap av organets funksjon.
Normale celler, utenom blod og lymfatisk celler, har ulike vevsspesifikke overlevelsesfaktorer som gjør at celler holder seg innenfor egne vev. Kreftceller har derimot ikke den egenskapen grunnet mutasjon, og kan derfor å spre seg inn i omgivende vev (13),(15).
5
1.4 Pankreaskreft
Pankreaskreft er en av de dødeligste krefttypene med svært dårlig prognose. Med rundt 900 årlig tilfeller i Norge, døde 771 personer av denne kreftformen i 2020 (16). Pankreaskreft er forventet å bli nest ledende kreftrelatert dødsårsak i USA i 2030 (17).
Ondartet svulst som utgår fra kjertelvev kalles adenokarsinom. Adenokarsinom av duktal type (PDAC) er den vanligste formen av pankreaskreft og utgjør over 90% av alle tilfellene.
Identifisering av kreftforstadier til denne kreftformen kalles pankreatisk intraepitelial neoplasi (PanIN). PanIN er delt inn i tre grader og representerer trinnvise morfologiske forandringer i gangepitel. Dette har også dannet grunnlaget for kartlegging av trinnvise genetiske forandringer (18,19).
Cytokiner regulerer mange biologiske prosesser som cellevekst, differensiering, inflammasjon og metabolisme. Både pro- og anti-inflammatoriske cytokiner har vist seg å være overuttrykt ved pankreaskreft. De fremmer progresjon av svulst i pankreas ved å modulere svulstens mikromiljø og virke direkte på kreftceller (20). Kjernefaktor kappa beta (NF-κB) er en transkripsjonsfaktor som regulerer genekspresjon av flere inflammatoriske cytokiner, som interleukin-1 (IL-1), interleukin-8 (IL-8) og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), involvert ved pankreaskreft. NF-κB er også involvert i regulering av apoptose og onkogenese og promoterer dermed tumorvekst og metastaser. TNF-α og interleukin-6 (IL-6) er ofte observert forhøyet hos pasienter med pankreaskreft. TNF-α promoterer metastase og IL-6 promoterer angiogenese, og begge cytokiner er også assosiert med kakeksi (beskrevet i avsnitt 1.6) og dårlig prognose (21).
De fleste av pasientene er asymptomatiske helt til sykdommen utvikler seg til et avansert stadie.
Tap av appetitt, ufrivillig vekttap, ryggsmerter, mageproblemer og nyoppdaget diabetes type 2 er noen symptomer assosiert med pankreaskreft. Utvikling av gulsott er første symptom hos omtrent halvparten av pasientene (18,19).
Eneste mulighet for behandling per i dag er kirurgisk fjerning av tumor. Kirurgiske teknikker inndeles i Whipples operasjon (pankreatikoduodenektomi), distal pankreasreseksjon og total pankreatektomi. Mindre svulster kan også behandles under endoskopisk retrograd choledochopankreaticografi (ERCP) i noen tilfeller ved hjelp av en elektrisk slynge (22).
Medisinsk behandling innebærer supplerende og lindrende cellegiftbehandling. Målet med supplerende behandling er å forebygge eller utsette tilbakefall etter kirurgi. Det består av
6
tilsammen 13 kurer, på seks måneder, med fluorouracil (5-FU) i kombinasjon med kalsiumfolinat (nordisk FLv) som gis annen hver uke. I Norge anbefales gemcitabin, cellegift av gruppen pyrimidin-antagonister, til pasienter som ikke er mulig å operere. Kvalme, som er en vanlig bivirkning av gemcitabin, lindres med kvalmestillende medikamenter og glukokortikoider. Strålebehandling er ikke anbefalt, verken i kombinasjon med cellegift eller alene, i henhold til retningslinjer kartlagt av Norsk Grastrointestinal Cancergruppen (NGICG) (22).
1.5 Kommunikasjon mellom pankreaskreft og muskelceller
I studien til Krapf et al. ble det studert protein sekresjon fra både pankreaskreftcellelinje (PANC-1) og primære pankreasceller (hPEC) og observert hvordan kondisjonert medie fra de to celletypene påvirker metabolisme i muskelcellene. Det ble identifisert to forskjellige proteinprofiler for sekretomet av PANC-1 og hPEC, og en rekke proteiner i PANC-1 sekretomet som er viktige i regulering av energimetabolisme. Metabolske veier som glykolyse, glukoneogenese og fettsyrebiosyntese var også forskjellige regulert i de to celletypene (23).
Tidligere studier har også sett på utskilte inflammatoriske faktorer utskilt fra pankreas kreftceller blant annet IL-6, interleukin-10 (IL-10), TNF-α og myostatin (24). Disse analysene bidrar til å forstå samsnakk (eng: crosstalk) mellom pankreas kreftceller og muskelceller – hvordan utskilte peptider fra pankreasceller kan påvirke omgivende vev, spesielt muskelceller.
For eksempel, kondisjonert medie fra pankreaskreftceller med utskilte peptider som myostatin og activin A har forårsaket muskelsvinn i dyremodeller (24). Det har også blitt vist at IL-6 produsert fra tumorer promoterer kakeksi (25).
Noen utskilte peptider fra pankreas kreftceller kan endre energimetabolismen i muskler. I studien til Krapf et al. ble det vist at oksidasjon av oljesyre var lavere i PANC-1 enn i hPEC.
Primære humane myotuber kondisjonert med medie fra PANC-1 førte til en reduksjon i oljesyre oksidasjon i myotubene. Dette antyder at fettsyremetabolismen i muskelcellene ble hemmet av faktorer fra PANC-1 mediet (23).
Forskning har også vist at skjelettmuskler produserer myokiner som muliggjør kommunikasjon mellom muskelen og andre organer, inkludert pankreas. Myokiner er cytokiner og andre peptider som produseres og frigjøres av muskelfibre og utøver enten autokrine, parakrine eller
7 endokrine effekter (26). Det finnes dermed en kommunikasjon mellom lever og muskel via utveksling av substrater for å opprettholde metabolsk homeostase under trening (27). Det er tidligere vist at for høye konsentrasjoner av TNF-α, produsert av muskelceller, induserer insulinresistens hos mennesker in vivo. IL-6 har også vist å stimulere β-celleproliferasjon og forhindrer apoptose. Derfor kan treningsindusert økning i IL-6-produksjon være involvert i beskyttelse av bukspyttkjertelens β-cellemasse og funksjon (26). To proteiner som har vist å spille en rolle i muskel-pankreas-kommunikasjon er IL-6 frigitt av muskelen og irisin. Irisin er et PPAR-γ koaktivator-1α (PGC1α)-avhengig myokin og den har en beskyttende effekt mot beta-celle apoptose(27).
1.6 Kakeksi ved pankreaskreft
Kakeksi er kjent som en av de vanligste komplikasjonene ved kreft og rammer opp til 80 % av alle pasienter med avansert kreftsykdom (28). Cancer kakeksi er definert som et multifaktorielt syndrom, og kjennetegnes ved pågående tap av skjelettmuskelmasse som ikke fullt ut kan reverseres ved optimal næringstilførsel. Tilstanden er hyppigst hos pasienter med pankreas- og ventrikkelkreft. Pasienter med kakeksi opplever tap av matlyst, tidlig metthetsfølelse, kraftløshet og nedsatt funksjonsevne som kan gi redusert livskvalitet og bidrar til økt kjemoterapitoksisitet, redusert tumorrespons og redusert overlevelse (29).
Patofysiologien bak kakeksi er en negativ protein- og energibalanse, drevet av en varierende kombinasjon av redusert matinntak og endret metabolisme. Det innebærer også inflammasjon og nevrohormonelle forandringer. Inflammasjon spiller en viktig rolle ved å påvirke blant annet appetittregulering og muskelnedbrytning. Kompleksiteten gjør det utfordrende å utvikle en effektiv behandling og det er per i dag ingen effektiv behandling for å reversere kakeksi (30,31).
Pro-inflammatoriske cytokiner spiller en viktig rolle ved cancer kakeksi. Forhøyet TNF-α serumnivå kan ha klinisk betydning i utviklingen av kakeksi hos PDAC-pasienter (32). TNF-α og IL-6 aktiverer proteolyse, insulinresistens, apoptose og NF-κB veien og dermed bidrar i utvikling av kakeksi. I pankreas kreftcellelinjer, høyt genuttrykk av IL-6 og IL-8 kan muligens forklare høye frekvensen av kakeksi hos pasienter med pankreaskreft (33).
Activin A og myostatin, ligander av transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), har hatt oppmerksomhet for deres potensielle rolle i nedbrytning av skjelettmuskel (32). I en studie ble det vist høye aktivin A-nivåer hos pasienter med avansert PDAC (34). Myostatin, også kjent
8
som vekst/differensieringsfaktor-8 (GDF-8), er hovedsakelig uttrykt i skjelettmuskulatur.
Myostatin styrer proliferasjon av muskelceller og er en potent negativ regulator av skjelettmuskelmassen. Forholdet mellom myostatin og kreft er ikke fullstendig kartlagt, men er sannsynligvis som aktivin A, myostatin kan også syntetiseres og frigjøres av enkelte kreftceller (32).
Kakeksi utvikler seg gradvis og deles inn i tre stadier hvor alvorlighetsgraden er klassifisert basert på graden av tap av energilagring og kroppsproteinmasse, og hastigheten på pågående vekttap. Det første stadiet, pre-kakeksi, beskrives som stadiet hvor pasientene viser tidlige tegn som tap av appetitt og/eller forhøyet C-reaktivt protein (CRP) i tillegg til vekttap på mindre enn 5% i siste 6 måneder. Det andre stadiet kjennetegnes ved vekttap over 5% i siste 6 måneder, eller vekttap over 2% i tillegg til kroppsmasseindeks (KMI) under 20 kg/m2 eller sarkopeni (28,29). Sarkopeni er en prosess som kjennetegnes ved progressiv og generalisert tap av muskelmasse og muskelstyrke (35). Når det tredje stadiet nås har pasientene refraktær kakeksi og responderer ikke lenger på terapi, beskrevet i avsnitt 1.4.3. Forventet levetid er da mindre enn 3 måneder (28,29).
Hvilket stadiet pasienten befinner seg i og deres allmenntilstand er avgjørende for behandlingen. Ved pre-kakeksi er målet å opprettholde eller øke vekt og fysisk funksjonsevne.
Generelle råd om kosthold og aktiv ernæringsbehandling (sondeernæring eller intravenøs behandling) vurderes. Ved refraktær kakeksi er symptomlindring og bedring av pasientens livskvalitet det viktigste (36,37). Medikamentell behandling kan også vurderes hos noen pasienter. Kortikosteroider kan øke appetitt, funksjon og generell velvære samt redusere kvalme. Megestrolacetat kan også øke appetitt og vekt, men har ingen effekt på muskelmasse.
Metoklopramid kan øke ventrikkeltømming og lindre tidlig metthetsfølelse og kvalme, men har ingen effekt på ernæringsstatus (37).
1.7 Insulinsignalisering
Insulin er et peptidhormon som består av en A-kjede og en B-kjede bundet med hverandre via to disulfidbindinger. Som nevnt tidligere, produseres og frigjøres hormonet fra β-celler i de langerhanske øyer i pankreas. Hormonets hovedoppgave er å regulere blodsukkeret ved å øke glukoseopptaket i muskelceller, øke intracellulær lagring av glukose i form av triglyserider og glykogen (38).
9 Når insulin binder seg til sin reseptor på cellenes plasmamembran, aktiveres tyrosinkinase som videre fosforylerer insulinreseptorsubstrat 1 (IRS1). Selv om både IRS1 og IRS2 antas å mediere de fleste av de metabolske effektene ved insulinreseptoraktivering, er det IRS1 som er vanlig isoform i skjelettmuskulatur. Fosforylert IRS1 deretter binder seg til og aktiverer den p85-regulerende subenheten på fosfatidylinositol 3-kinase (P13k) som fører til fosforylering og aktivering av proteinkinase beta (AKT2). AKT2 fosforylerer flere proteiner involvert i glukoseopptak, blant annet AKT-substrat på 160 kDa (AS160). Denne fosforyleringen fremmer umiddelbart translokasjon av lagringsvesikler med glukosetransportør type 4 (GLUT-4) til plasmamembran og fører til et insulin-stimulert glukoseopptak (39,40).
1.8 Metabolisme
Metabolisme, stoffskifte, er summen av alle biokjemiske reaksjoner som finner sted i celler hvor formålet er å skaffe energi til livsnødvendige prosesser og å produsere nytt organisk materiale. Metabolisme består av to prosesser – katabolisme og anabolisme. Ved katabolisme brytes større organiske molekyler ned til enkle forbindelser, med samtidig frigjøring av fri energi. Anabolisme er en prosess der store molekyler lages fra enklere forbindelser (41,42).
Re-programmert metabolisme er en av kjennetegnene for kreft (12). Kreftceller omkobler mange metabolske prosesser for å lette deres overlevelse, ubegrenset cellevekst og deling (43).
1.8.1 Glukosemetabolisme i muskelceller
Oksidativ nedbrytning av glukose kalles for glykolyse. Prosessen produserer to pyruvat molekyler fra ett glukose molekyl i tillegg til to ATP molekyler og to NADH molekyler. En rekke enzymer er involvert i glykolyse. Pyruvat molekyler transporteres videre til matriks i mitokondria hvor det dannes acetyl koenzym A (acetyl CoA) ved en reaksjon mellom pyruvat og kofactor koenzym A (CoA). Acetyl CoA, gjennom sitronsyresyklusen eller Krebs syklus, danner to karbondioksid (CO2) molekyler fra en acetyl gruppe. Krebs syklus kan kun fungere i nærvær av oksygen selv om oksygen ikke er direkte involvert i prosessen. (44)
NADH og FADH2 molekyler fra Krebs syklus blir videre oksidert i elektrontransportkjeden som vist i figur 1.2. Protoner blir transportert fra matriksen til intermembranøs rom i mitokondria. Dette skaper en protongradient som blir brukt av ATP syntase til å danne ATP
10
molekyler. Totalt dannes det 36 ATP molelyler, 6 CO2 molekyler og 42 H2O molekyler i løpet av metabolisme av ett glukose molekyl. Dette kalles oksidativ fosforylering. (44)
Ved oksygenmangel (hypoksi), blir pyruvat molekyler metabolisert til melkesyre istedenfor acetyl CoA. Det blir da dannet kun 2 ATP molekyler per glukose molekyl via anaerob metabolisme. (44)
Figur 1.2: Illustrasjon av prosesser i mitokondria. Energien i oksidativ fosforylering, som frigjøres ved oksidasjon av NADH til NAD+, utnyttes gjennom prosesser i indre mitokondriemembran til å drive den energikrevende fosforyleringen av ADP til ATP. Netto ligning for denne prosessen er 2NADH + O2 + 2H+ → 2NAD+ + 2H2O. Bildet fra (44)
1.8.2 Glukosemetabolisme i kreftceller
«Warburgeffekten» eller aerob glykose er et klassisk eksempel på re-programmert metabolisme. Otto Warburg i 1920 kom frem med en observasjon om at tumorer hovedsakelig bruker glykolyse, også i nærvær av oksygen, til energiproduksjon. Kreftceller har økt glukoseforbruk og økt laktatutskillelse sammenlignet med normale celler. De produserer mer laktat enn å oksidere glukose fullstendig i mitokondrie som vist i figur 1.3 (45,46). Økt aerob glykolyse antas å være den syvende egenskapen hos kreftceller utenom de seks egenskapene beskrevet av Hanahan og Weinberg. «Warburgeffekten» gir kreftcellene en vekstfordel ved hypoksi (47).
Re-programmert glukosemetabolisme oppnås ved oppregulering av glukose transportør, GLUT-1, som øker signifikant glukoseinfluks i cytosol. Glukoseopptak i tumor har blitt
11 observert ved hjelp av positron emisjons tomografi (PET) med radioaktiv-merket glukoseanalog 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) (47,48).
Figur 1.3: Illustrasjon av glukosemetabolisme i normale celler og tumorer. A) I nærvær av oksygen metaboliserer normale celler glukose til pyruvat via glykolyse og oksiderer deretter pyruvat til CO2 i mitokondriene (oksidativ fosforylering). Ved oksygenmangel, kan celler generere laktat fra pyruvat istedenfor mitokondriell oksidativ fosforylering (anaerob glykolyse). B) Warburg observerte at kreftceller har en tendens til å konvertere mest glukose til laktat uavhengig av oksygen-tilstede (aerob glykolyse). Bildet fra (49).
Onkogener som Ras og Myc, og mutante svulstundertrykkere som TP53, har vist seg å være assosiert med aerob glykolyse. Denne glykolysen øker ytterligere under de hypoksiske forholdene ved at hypoksiresponssystemet oppregulerer glukosetransportører og flere enzymer.
Ras onkoprotein, hyposki og Akt onkogen øker nivåene av transkripsjonsfaktorene, HIF1α og HIF2α, som igjen oppregulerer glykolyse (47,48,50).
1.8.3 Fettsyremetabolisme i muskelceller
Fettsyrer er sentrale komponenter i lipidmetabolismen, og danner deler av cellemembraner, lipiddråper eller lipoproteiner (51). Fettsyrer kan hentes fra dietten eller syntetiseres i celler gjennom metabolske pathways som de novo lipogenese og lipolyse (52). Avhengig av nærings-
12
og energiforholdene, kan fettsyrer raskt oksideres i peroksisomer og mitokondrier for å opprettholde den cellulære homeostasen (53). Det finnes forskjellige typer fettsyrer med spesifikke biofysiske egenskaper basert på kjedelengde og metningsgrad, inkludert langkjedede fettsyrer som oljesyre. Oljesyre og flerumettede omega-3 fettsyrer har antiinflammatoriske egenskaper og virker beskyttende mot enkelte metabolske sykdommer assosiert med insulinresistente tilstander og åreforkalkning (54).
Fett er lagret som triglyserider (TAG) i fettvevet og mobiliseres fra fettvevet i form av frie fettsyrer (FFA) i plasma. Fettsyreoksidasjon finner sted hovedsakelig i skjelett- og hjertemuskulatur, og lever. Mennesket får fett i form av TAG gjennom kosthold. Lipaser utskilt fra pankreas spalter ett TAG-molekyl til tre FFA og ett glyserolmolekyl i tarmen. FFA aggregerer lett for å danne miceller som tas opp av enterocyttene. Inne i enterocyttene vil FFA re-esterifiseres til TAG og pakkes sammen med proteiner og fosfolipider for å danne kylomikroner. Kylomikroner transporteres først inn i lymfesystemet og til slutt i sirkulasjonssystemet (55,56).
For at FFA skal tas opp av andre celler, brytes kylomikronene ned av enzymet lipoprotein lipase (LPL). Etter opptak fra plasma blir FFA aktivert av acyl-CoA syntetase til langkjedet acyl-CoA i cytosol som vist i figur 1.4. Siden mitokondriemembranen er impermeabel for acyl-CoA, vil karnitin palmitoyltransferase 1 (CPT1) omdanne langkjedet acyl-CoA til acylkarnitin.
Acylkarnitin fraktes inn i mitokondriene. Inne i mitokondriene gjendannes langkjedet acyl- CoA, som videre nedbrytes til acetyl-CoA gjennom β-oksidasjon for å generere energi. For hver syklus oksideres to karbonatomer fra fettsyrekjeden til ett acetyl-CoA-molekyl, ett NADH- molekyl og ett FADH2-molekyl. Acetyl-CoA dannet under β-oksidasjon går videre i Krebs syklus som beskrevet i avsnitt 1.5.1. (55,56).
Peroksisomproliferatoraktivert reseptor (PPAR) og lever X reseptorer (LXR) har rolle i regulering av metabolske prosesser som glukose- og lipidmetabolisme (57). PPARα er uttrykt i vev som skjelettmuskulatur og aktiverer β-oksidasjon av fettsyrer i lever i tillegg til påvirkning på glukosehomeostasen. PPARγ øker lagring av fettsyrer i form TAG i fettvev (58). PPARβ som også er hovedsakelig uttrykt i skjelettmuskulatur er involvert i fettsyreoksidasjon i skjelettmuskulatur, regulerer blodglukose og kolesterolnivået (57).
13 Figur 1.4: En enkel illustrasjon av fettsyremetabolisme. Karnitin palmitoyltransferase 1 (CPT1) omdanner langkjedet acyl-CoA til acylkarnitin. Acylkarnitin transporteres inn i mitokondriene ved hjelp av karnitin:acylkarnitin-translokase (CACT). Inne i mitokondriene gjendannes langkjedet acyl-CoA.
Bildet fra (59).
LXR er kjernereseptorer som spiller en viktig rolle i lipid i regulering av lipid- og kolesterolmetabolisme. Mens LXRα er hovedsakelig uttrykt i leveren, er LXRβ uttrykt i de fleste vev (60,61). Selv om LXR sin rolle i glukosemetabolisme er ikke helt kartlagt har LXR- aktivering med agonister vist å nedregulere gener involvert i nydannelse av glukose (glukoneogenese), og indusere genekspresjon av GLUT-4 i fettvev (62).
1.8.4 Fettsyremetabolisme i kreftceller
Fettsyrer kan bidra i kreftprogresjon ved flere mekanismer som vist i figur 1.5. De fremmer ulike aspekter av tumorcelleutvikling, progresjon og overlevelse, og gir kreftcellene membranbyggesteiner, signalmolekyler og økt mitokondriell ATP. Kreftceller kan skaffe fettsyrer gjennom økt de novo lipogenese, lipidopptak og lipolyse som øker vekst og spredning
14
av kreftceller (63,64) (65). Re-programmert lipidmetabolisme spiller en kritisk rolle i patogenese av cancer kakeksi (66).
Kreftceller krever flere lipider enn normale celler, og utvikler derfor mekanismer for å øke lipidopptaket. Dette oppnås ved å oppregulere celleoverflatereseptorer for plasmalipider som FAT/ CD36. CD36 har vist seg å være en markør for initiering av metastasering (67). Det er også vist oppregulering av fettsyrebindende proteiner (FABPs) som fremmer lipidopptak i kreftceller (63). For å støtte den raske veksten og spredningen av kreftceller tilfører endringer i lipidmetabolske signalmolekyler nødvendige substrater for fosfolipidsyntese og metabolske drivstoff gjennom oksidasjon i mitokondrier (65).
Figur 1.5: Illustrasjon av re-programmert lipidmetabolisme ved kreft. Endring i lipidmetabolisme støttet rask vekst og proliferasjon av kreftceller. De gir signalmolekyler, substrater nødvendige for fosfolipidsyntese, og energi gjennom oksidasjon i mitokondriene. Bildet fra (63).
De novo fettsyresyntese er undertrykt i de fleste normale celler. Den oppregulerte fettsyresyntesen i tumorceller gjenspeiles av økt aktivitet av forskjellige lipogener enzymer som acetyl-CoA-karboksylase (ACC) og fettsyresyntase (FASN), og ATP-sitratlyase (ACLY) (64,65). Den økte fettsyresyntesen og oppregulering av enzymer skyldes sannsynligvis økt
15 uttrykk av transkripsjonsregulatorene som sterolregulerende elementbindende proteiner (SREBP) i kreftceller (68). Analyse av pasienter med pankreaskreft viste at ekspresjonsnivået til SREBP-1 var signifikant høyere i kreft i bukspyttkjertelen enn i tilstøtende normalt vev (69).
Frie fettsyrer blir esterifisert til triglyserider som inkorporeres i lipiddråper, og skilles ut ved lipolyse for å øke fettsyrenivået (70). Monoacylglycerol lipase (MAGL) er intracellulær lipase med økt uttrykk og enzymatisk aktivitet i noen aggressive kreftformer som bidrar med å øke fettsyrenivå i kreftceller (63).
1.9 Modulatorer av mitokondriell oksidativ fosforylering
Inhibitorer av kompleks i mitokondria har vist antitumoraktivitet på de svulstene som er avhengige av oksidativ metabolisme og de er derfor av interesse for onkologisk forskning (71).
Antimycin A og rotenon binder seg henholdsvis til kompleks III og kompleks I i elektrontransportkjeden. Inhibering av elektrontransportkjeden forårsaker kollaps av protongradienten over den indre mitokondriemembranen, som eventuelt fører til tap av membranpotensialet. Inhibering fører også til økt produksjon av frie radikaler (ROS) og reduksjon i cellulær ATP (72) (71).
Oligomycin inhiberer ATP syntase (kompleks V). Den viser ATP produsert av mitokondrier som bidrar til å dekke det energibehovet i cellene (73).
Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) er en frakobler (eng:
uncoupler) av oksidativ fosforylering. ATP dannes ved kobling (eng: coupling) av to prosesser – elektrontransportkjeden og fosforylering. FCCP frakobler fosforylering ved å danne kanaler i indre mitokondriemembran som gir kollaps av protongradienten, og dermed hindrer dannelse av ATP. Respirasjon vil foregå helt til alt tilgjengelig oksygen er redusert (74). FCCP gir derfor et mål på den maksimale respirasjonshastigheten cellen kan oppnå (73).
16
1.10 Mål for oppgaven
Det har tidligere blitt vist at det skilles ut peptider fra en pankreaskreftcellelinje (PANC-1) som kan endre energimetabolismen i muskler. Foreløpig er det gjort få studier som har undersøkt hvordan pankreaskreft påvirker humane muskelceller. Hovedmålet for denne masteroppgaven var derfor å studere hvordan kondisjonert medium fra PANC-1 og primære pankreasceller (hPEC) påvirker energimetabolisme i muskelceller. Følgende delmål for oppgaven ble satt:
- Undersøke genekspresjon av utvalgte gener i PANC-1 og hPEC involvert i kakeksi - Undersøke effekt av kondisjonert medie fra PANC-1 og hPEC og mitokondrielle
modulatorer på glukose- og fettsyremetabolisme i muskelceller
- Undersøke effekt av kondisjonert medie fra PANC-1 og hPEC på glykogensyntese i muskelceller i nærvær og fravær av insulin
- Undersøke effekt av kondisjonert medie fra PANC-1 og hPEC på fosforylering av AKT og AS160 i muskelceller i nærvær og fravær av insulin
- Undersøke effekt av kondisjonert med medium fra PANC-1 og hPEC på genekspresjon av utvalgte gener i muskelceller
17
2 Materiale og metode
2.1 Materialer
2.1.1 Kjemikalier og reagenser
Tabell 2.1: Oversikt over kjemikalier og reagenser benyttet i denne oppgaven
Leverandør Kjemikalium/reagens
Agilent Technologies Inc. (Cedar Creek, TX, USA)
Nuclease-free H2O, 25 ml
Agilent Total RNA Isolation Mini Kit
Applied Biosystems Power-SYBR® Green PCR Master Mix
Taqman Reverse Transcription Reagents-kit American Type Culture Collection – ATCC
(Manassas, VA, USA)
Pankreaskreftcellelinjen (PANC-1)
BioRad (København, Danmark) Bio-Rad Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards
Bio-Rad Protein Protein Assay Dye Reagent Concentrate
Bromfenylblått
ClarityTM Western ECL substrates SDS
Tris/glycine/SDS-buffer Tween 20
Cell Biologics (Chicago, IL, USA) Complete Human Epithelial Cell medium med Supplement Kit
Human Primary Pancreatic Epithelial cells (hPEC)
Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)
Monoklonalt antistoff pAKT og total AKT
Monoklonalt antistoff pAS160 og total AS160
Invitrogen (Carlsbad, California, USA) Primere
18
Lonza (Verviers, Belgia) Bio Whittaker® DPBS (Phosphate Buffered Salin)
Life technologies (Carlsbad, California, USA)
Dulbecco´s Modified Eagle medium med glutamax (DMEM/ Glutamax-I 1 g/l glukose)
Dulbecco’s Modified Eagle medium med høy glukose (4,5 g/l glukose, L-glutamin, 25mM HEPES)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Salin (DDPBS u/ Ca2+ og Mg2+)
Fungizone (250 µg/ml amphotericin B) Trypsin 0,25 %
Novo Nordisk A/S (Bagsværd, Danmark) Insulin, ActRapid® Penfill® 100IE/ml PerkinElmer® (Boston, MA, USA) [1- 14C]oleic acid 100 µCi/ml
D-[ 14C (U)]glucose 100 µCi/ml OptiPhase Supermix
Sigma- Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) Antimycin A
Bovint serumalbumin (BSA)
Carbonyl cyanid p-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP)
Dimetylsulfoksid (DMSO) Glukose
HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-1- piperazineetansulfonsyre) Eikosapentaensyre (EPA) L-karnitin
Natriumhydroksid (NaOH) Oligomycin
Oljesyre (OA) Rotenon Glykogen
Tryptanblått 0,4 % løsning
19
Thermo Fisher HighCapacity cDNA Reverse Trancription
Kit
Power SYBR™ Green PCR Master Mix (5 ml)
RNase inhibitor
Penicillin- streptomycin (10 000 IE/ml) SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate
2.1.2 Utstyr
Tabell 2.2: Oversikt over utstyret benyttet i denne oppgaven
Leverandør Utstyr
Applied Biosystems (Foster City, California, USA)
2720 Thermal Cycler
BioRad (København, Danmark) Trans-Blot® TurboTM Mini-size Transfer nitrocellulose (membran)
Trans-Blot® TurboTM Mini-size Transfer nitrocellulose (membran) Steaks
Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) ChemidocTM XRS+ System with Image LabTM Software
Bio-Rad PowerpacTM HC
4-20 % Mini-Protean® TGXTM Precast Protein Gels
Biosan (Riga, Latvia) V-1 Plus, Personal Vortex
Corning Inc. (Corning, NY, USA) 96-brønners Corning® CellBind® Surface brett med lokk
6-well Corning® CellBIND® tissue culture plates
50 ml Centrifuge Tube, CentriStar™ Cap 15 ml Centrifuge Tube, CentriStar™ Cap Costar (Kennebunk, ME, USA) Pipetter
20
EKF Diagnostics EKF pre-filled “Safe-Lock” reaction cups
Biosen C-line
Eppendorf AG (Hamburg, Tyskland) Safe-Lock Tubes, 1,5 ml Instrumentverkstedet (Teknisk avdeling,
Universitetet i Oslo, Norge)
Trappestativ, inkludert metallskruer, metallplate og silikonmembran Invitrogen (Carlsbad, California, USA) Countess™ Automated Cell Counter Kubota Corporation (Tokyo, Japan) Kubota Compact Tabletop Centrifuge 2010
Olympus (Tokyo, Japan) Olympus CKX41 microscope med
digitalkamera
Packard (Schwadorf, Austria) Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer
PerkinElmer (Waltham, Massachusetts, USA)
Isoplate™-96
MicroBeta2 2450 Microplate Counter TopSeal®-A gjennomsiktig film Unifilter®- 96 GF/B
Wallac Victor™ X4 Mµltimode Plate Reader
Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)
Countess™ Cell Counting Chamber Slides Heraeus™ Fresco™ 21 Centrifuge
Heraeus™ Megafuge™ 16R Centrifuge MicroAmp™, 8 tube strip
MicroAmp™ Fast optical 96- well reaction plate
MicroAmp™ Optical Adhesive Film Nunc™ MicroWell™ 96-brønners microplate
Nanodrop Lite Spectrophotometer StepOnePlus™ Real-Time PCR System VWR® International (Radnor,
Pennsylvania, USA)
Easyflask Nunclon 25 cm2 Easyflask Nunclon 75 cm2
Microcentrifuge MiniStar Silverline Eppendorf® Safe-Lock rør 1,5 ml
21
2.2 Humane primære epitelceller fra pankreas (hPEC)
2.2.1 Utsåing
Humane primære epitelceller fra pankreas (hPEC) var nedfryst i kryorør ved -196 °C i en nitrogentank. Cellene gjennomgikk flere passasjer før de ble overført i ampullene for nedfrysing. Ampullen fra nitrogentank ble fraktet til labben i en isboks. Ampullen var først tint i hånda før cellesuspensjon (1 ml) ble overført til et 15 ml sentrifugerør og tilsatt 3,5 ml oppvarmet hPEC-medium.
DMSO, et frysebeskyttende middel, ble benyttet ved nedfrysning av celler for å hindre celleødeleggelse. Dette løsemiddelet er toksisk for celler og det var derfor nødvendig å fjerne det før celler ble dyrket i dyrkningsflasker. Cellesuspensjon ble sentrifugert ved 1300 rotasjoner per minutt (rpm) i 5 minutter i Kubota Compact Tabletop Centrifuge 2010. Cellepelletten som ble dannet i sentrifugeringsprosessen ble deretter resuspendert i 1 ml proliferasjonsmedium etter at supernatanten, som inneholdt DMSO, ble sugd av og kastet. Cellene ble dyrket i flere NUNC 75 cm2 EasyFlasker, og tilsatt hPEC-medium til et totalvolum på 10 ml i hvert celleflaske. Flasken ble plassert i en inkubator (5 % CO2, 37 °C). Mediet ble skiftet hver andre til tredje dag frem til cellene ble 80-100% konfluente.
2.2.2 Proliferasjon og splitting
hPEC-mediet ble sugd av og cellene vasket to ganger med 5 ml DPBS, fosfatbufret saltvann.
Etter fjerning av DPBS ble det tilsatt 1 ml 0,25% trypsinløsning for å løsne cellene fra flaskens overflate. Celleflasken ble plassert i en inkubator (5% CO2, 37 °C) i 3-5 minutter. For å løsne cellene ordentlig ble celleflasken dunket et par ganger på sidene. Det ble tilsatt 4 ml hPEC- medium for å avslutte trypsinering. Antall celler i cellesuspensjonen ble talt ved å overføre cellesuspensjon og tryptanblå i 1:1 forholdet på en Countess slide. Countress automated cell counter ble brukt til tellingen. Ca. 1 million celler ble overført til en ny celleflaske med totalvolum på 10 ml oppvarmet hPEC-mediet. Celleflasken ble plassert i inkubator (5 % CO2, 37 °C). Mediet ble skiftet hver andre til tredje dag frem til cellene ble 80-100% konfluente.
Etter 80-100% konfluens, ble cellene splittet videre i flere NUNC 75 cm2 EasyFlask.
22
2.3 Pankreaskreftcellelinjen (Panc-1)
2.3.1 Utsåing
Panc-1 ble sådd ut på samme måte som beskrevet for hPEC i avsnitt 2.2.1. Istedenfor hPEC- medium ble det brukt Panc-1 medium.
2.3.2 Proliferasjon og splitting
Panc-1 ble splittet på samme måte som beskrevet for hPEC i avsnitt 2.2.2. Det ble tilsatt mindre cellesuspensjon til en ny celleflaske, siden Panc-1 celler prolifererte hurtigere enn hPEC.
Figur 2.1: Bilder av pankreascellene under dyrkning. A. Humane primære epitelceller fra pankreas (hPEC). B. Pankreaskreftcellelinjen (Panc-1). Bildet fra (75).
2.4 Humane skjelettmuskelceller
2.4.1 Donorkarakteristika
Humane skjelettmuskelceller (satelittceller) ble isloert fra musculus vastus lateralis. Denne delen av muskel befinner seg på utsiden av lårmuskelen. Disse satellitcellene ble hentet fra seks donorer – stillesittende normalvektige (kroppsmasseindeks (KMI) < 25 kg/m2) eller overvektige (KMI > 25 kg/m2) menn.
Tabell 2.3 viser en oversikt over donorkatakteristika av de seks donorene.
23 Tabell 2.3: Oversikt over donorkatakteristika av satelittceller benyttet i oppgaven
Donorkode Kjønn Alder KMI (kg/m2)
171 Mann 47 26,6
272 Mann 48 25,0
275 Mann 47 22,2
287 Mann 44 25,8
262 Mann 49 27,0
267 Mann 47 26,6
2.4.2 Utsåing
Humane skjelettmuskelceller ble sådd ut på samme måte som beskrevet for hPEC. Istedenfor hPEC-medium ble det brukt proliferasjonsmedium.
2.4.3 Splitting
Etter 80-90% konfluens ble det gamle mediet i 75 cm2 NUNC flakser sugd av og cellene ble vaset to ganger med 10 ml DPBS. Etter fjerning av DPBS ble det tilsatt 1 ml 0,25%
trypsinløsning for å løsne cellene fra flaskens overflate. Celleflasken ble plassert i en inkubator (5% CO2, 37 °C) i 3-5 minutter. For å løsne cellene ordentlig ble celleflasken dunket et par ganger på sidene. Det ble tilsatt 4 ml proliferasjonsmedium for å avslutte trypsinering. Antall celler i cellesuspensjonen ble talt som beskrevert for hPEC. Det ble overført egnet antall celler til de brønnene i brønners-brett. Brettene ble deretter satt i inkubator (5 % CO2, 37 °C). Mediet ble skiftet hver andre til tredje dag frem til cellene ble 80-90 % konfluente.
2.4.4 Proliferasjon og differensiering
Etter at cellene oppnådde 80-90 % konfluens, ble proliferasjonsmedium byttet med differenseringsmedium. Differenseringsmediet ble byttet andre til tredje dag i ca en uke.
Cellene differensierte fra myoblaster til myotuber i denne fasen.
24
Figur 2.2: Humane skjelettmuskelceller. Humane skjelletmuskelceller under proliferasjon.
(Bildet tatt av Stefan Maricic)
2.5 Forsøk med kondisjonert medium
2.5.1 Uttak av kondisjonert medium fra celleflasker
På første dag ble cellene sådd ut i to celleflasker for hPEC og fire celleflasker for PANC-1 som beskrevet for hPEC. hPEC ble sådd ut i 10 ml hPEC-medium og PANC-1 ble sådd i 10 ml PANC-1 medium. På andre dag ble medium skiftet i celleflaskene slik at begge celletypene fikk samme medie (PANC-1 medie) i 48 timer før mediet ble samlet. Mediet ble overført til 15 ml rør og sentrifugert ved 1000 g i 15 minuter ved 4 °C for å fjerne døde celler. Etter sentrifugering ble mediet forsiktig overført til nytt 15-ml rør og fryst ved -80 °C.
2.5.2 Glukosejustering av kondisjonert medium
For å ha lik glukosekonsentrasjon i utgangspunktet i alle mediene ble det gjort glukosejustering.
Det ble først målt konsentrasjon av glukose på Biosen C-line. En brikke for glukosemåling ble brukt i apparatet. Apparatet ble kalibrert med standardløsning og testet med en testløsning.
Verdiene for testløsningen skulle ligge i referanseområde 5,37-6,69 mM. 20 µl kondisjonert medium ble overført i eppendorf rørene med glukose-hemolyserende løsning, blandet og satt i apparatet for avlesing. Dette ble gjentatt for alle rørene.
25 Glukosekonsentrasjon ble justert basert på glukosemålinger på Biosen C-line. En løsning av glukose på 1 molar (M) ble brukt til å justere glukosekonsentrasjon henholdsvis i de mediene.
2.5.3 Behandling av humane muskelceller med kondisjonert medium
Humane muskelceller som ble sådd ut i brettene med brønner til ulike forsøk ble behandlet med kondisjonert medium. Cellene ble differensiert i en uke – første tre dager med differensieringsmedium og deretter 50/50 kondisjonert medium og differensieringsmedium de siste fire dagene. Medium ble byttet hver andre til tredje dag. Andre metoder ble gjennomført etter behandling med kondisjonert medium.
2.6 Kvantitativ real-time polymerasekjedereaksjon (qPCR)
2.6.1 Utsåing og høsting av hPEC og Panc-1 celler til qPCR
Mediet på brettet ble sugd opp. Brønner ble deretter vasket to ganger med 1 ml DPBS. DPBS ble ikke sugd opp ved andre gang, dette for å opprettholde fuktighet i brønnen. Det ble sugd opp DPBS fra den ene brønnen, og tilsatt 250 µl RNeasy Plus Lysis Buffer (lyseringsbuffer).
Spissene ble byttet for hver brønn. En skraper ble brukt til å skrape celler på overflaten i brønnen. Den seige løsningen ble overført til eppendorf rør med merket etikett på. Dette ble gjentatt for alle brønnene i brettet. Boks med alle eppendorf rørene ble fryst ved -80 °C.
2.6.2 Utsåing og høsting av humane muskelceller kondisjonert med medie fra hPEC og Panc-1 celler til qPCR
Humane muskelceller i kryørene fra 6 donorer ble overført til et sentrifugerør. Cellene ble sådd ut i seks 75 cm2 NUNC-flasker på samme måte som beskrevet for hPEC. Medium ble skiftet hver andre til tredje dag.
Når cellene var 80-90% konfluente ble celler sådd ut til forsøk i 25 cm2 NUNC-flasker. Medium ble sugd opp og cellene ble vasket 2 ganger med 5 ml DPBS. Etter fjerning av DPBS ble det tilsatt 1 ml 0,25% trypsinløsning for å løsne cellene fra flaskens overflate. Celleflasken ble plassert i en inkubator (5% CO2, 37 °C) i 3-5 minutter. For å løsne cellene ordentlig ble celleflasken dunket et par ganger på sidene. Det ble tilsatt 4 ml proliferasjonsmedium for å
26
avslutte trypsinering. Antall celler i cellesuspensjonen ble talt som beskrevert for hPEC. Det ble sådd 200 000 celler per flaske i ni 25 cm2 NUNC-flasker ved å overføre ønsket mengde cellesuspensjon og tilsetting av proliferasjonsmedium til et totalvolum på 3 ml i hver celleflaske. Celleflaksene ble plassert i inkubator. Mediet ble byttet hver andre til tredje dag til cellene oppnådde 80-90% konfluens.
Ved 80-90% konfluens ble proliferasjonsmedium byttet med differensieringsmedium.
Differensieringsfasen foregikk i 7 dager som beskrevet i avsnitt 2.5.3. 3 flasker ble kondisjonert med medium fra hPEC, 3 flasker kondisjonert med medium fra PANC-1 og 3 flasker til kontroll med PANC-1 medium.
Humane muskelceller ble deretter høstet til qPCR. Mediet ble sugd opp, og cellene vasket 2 ganger med 2,5 ml DPBS. 500 µl RNeasy Plus Lysis Buffer (lyseringsbuffer) ble tilsatt, og cellene skrapet forsiktig med en skraper. Den seige løsningen fra hver celleflaske ble overført til totalt ni eppendorf rør med merking på etikett. Boks med de eppendorf rørene ble frosset ved –80 °C og oppbevart til isolering av RNA.
2.6.3 Isolering av RNA
Eppendorf rørene med cellelysat ble tinnet. Cellelysat ble homogenisert ved å overføre de til QIAshredder spinnkolonner plassert i 2 ml samlerør, og sentrifugert ved 14 800 rpm i 2 minutter. Genomiske DNA ble filtrert bort ved å overføre det homogeniserte lysatet til gDNA Eliminator spinn kolonner plassert i 2 ml samlerør, og sentrifugert ved 10 000 rpm i 30 sekunder. Spinn kolonner ble kastet.
Et volum på 500 µl av 70% etanol ble tilsatt og dette ble blandet godt ved pipettering.
Blandingen ble overført til RNeasy spinnkolonner plassert i 2 ml samlerør. Kolonner ble sentrifugert ved 10 000 rpm i 15 sekunder og filtratet ble kastet bort. Dette ble gjort totalt to ganger med 500 µl av 70% etanol siden spinnkolonner har kapasitet opptil 700 µl væske. Til hver spinnkolonne ble det tilsatt 700 µl Buffer RW1, og sentrifugert ved 10 000 rpm i 15 sekunder. Deretter ble det tilsatt 500 µl Buffer RPE to ganger til hver spinnkolonne, og sentrifugert ved 10 000 rpm i 15 sekunder ved første gangen og 2 minutter andre gangen.
Filtratet ble kastet bort etter hvert sentrifugering, og samlerøret ble kastet bort etter siste sentrifugering.
27 RNeasy spinnkolonner fra siste trinnet be plassert i nye 2 ml samlerør og sentrifugert ved 14 800 rpm i 1 minutt. Samlerørene ble kastet bort. Spin kolonner ble plassert i 1,5 ml samlerør med lokk, og tilsatt 30 µl Rnase-fri vann direkte på hver membran til de spinnkolonnene. RNA ble eluert i vannet etter å ha blitt sentrifugert ved 10 000 rom i 1 minutt.
2.6.4 Kvantifisering av RNA med NanoDrop
For å kunne kvantifisere mengde RNA i prøvene ble det målt absorbans ved 260 nm på NanoDrop Lite Spektrofotometer. Det ble først målt absorbans av 2 µl elueringsbuffer, i dette tilfelle Rnase-fri vann, som blank prøve. Det ble deretter målt absorbans av 2 µl av hver prøve.
Denne kvantifiseringen ble brukt til å bestemme mengde prøve som skulle benyttes ved cDNA- syntese. Prøvene ble fryst ved –80 °C for videre analyse.
2.6.5 cDNA-syntese
Taqman Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) ble benyttet til denne prosessen.
Et volum tilsvarende 0,3 ug RNA ble oveført til et mini-Eppendorfrør (MicroAmp) fra hver prøve, og tilsatt nukleasefritt vann til et totalvolum på 13,2 µl. Det ble tilsatt 6,8 µl reaksjonsblanding til hvert rør og blandet sammen. Mini-eppendorfrørene ble plassert i 2720 Thermal Cycler for cDNA syntese. Denne prosessen foregikk i 3 faser. I første fasen ble prøvene eksponert for primere ved 25 °C i 10 minutter. I neste fasen ble prøvene eksponert for revers transkriptase ved 37 °C i 80 minutter, og til slutt i siste fasen, ble revers transkriptase inaktivert ved 85 °C i 5 minutter. Prøvene med cDNA ble frosset ved -20 °C til qPCR.
2.6.6 qPCR
Det ble laget en cDNA-miks fra 2 µl av hver prøve og en standardrekke basert på cDNA- miksen. En standard 1000 ble laget ved å fortynne cDNA-miksen med nukleasefritt vann i 1:5 ratio. Standard 500, 250 og 125 ble laget fra standard 1000.
Det ble også laget en SYBR Green PCR-miks med spesifikke primere til de enkelte genene. 2,5 µl av hver standard, fortynnende cDNA-prøve og nukleasefritt vann ble tilsatt til alle aktuelle brønnene i en MicroAmp Optial Reaction Plate. 22,5 µl av reaksjonsblanding ble tilsatt til hver brønn i platen. Platen ble plassert i StepOnePlus Real-time PCR Thermal Cycling Block for cDNA-amplifisering.
28
2.7 Substratoksidasjonsmetoden
2.7.1 Substratoksidasjonsforsøk
Substratoksidasjonsmetoden er basert på metode beskrevet av Wensaas et al. (76). Denne metoden muliggjør målinger av akkumulering og oksidasjon av 14C -merkede substrater.
Eksperimenter ble gjennomført i 96-brønners brett fra avsnitt 2.7.1. En ‘sandwich’ lages bestående av 96-brønners brett, silikonplate og en filterplate som vist i figur 2.3. 14CO2 frigjøres og fanges opp i filteret og radioaktiviteten måles. Den målte radioaktiviteten tilsvarer mengde radioaktiv substrat som har blitt oksidert av cellene.
Humane muskelceller sådd ut i 96-brønners brett med 12800 celler per brønn. Cellene ble vasket, trypsinert og talt som beskrevet i avsnitt 2.2.2. 100 µl av celleblanding ble overført til hver brønn i brettet. Etter 80-90% konfluens med proliferajonsmedium, ble cellene behandlet med kondisjonert medium som beskrevet i avsnitt 2.5.3. En tredjedel av de brønnene ble tilsatt kondisjonert medium fra hPEC, en tredjedel med kondisjonert medium fra Panc-1 og en tredjedel med Panc-1 medium.
Etter behandling med kondisjonert medium ble medium sugd opp, og det ble tilsatt 50 µl radioaktivt medium, basert på enten [1- 14C]oljesyre eller D-[ 14C (U)]glukose, til hver av de aktuelle brønnene. Det ble laget en ‘sandwich’ av komponenter som vist i figur 2.3. Det ble tilsatt 20 µl 1 M NaOH til filterflaten. Det ble plassert metallskruer i hver av de fire hjørnene mellom cellebrettet og filterplaten, og en silikonmembran. Stillingen ble låst med trappestativet.
Dette ble plassert i inkubator ved 37 °C i 4 timer. Denne delen av metoden kalles trapping.
29 Figur 2.3: Utstyr brukt til substratoksidasjonsforsøk. A. 96-brønners Corning CellBIND brett.
B. Silikonplate med metallskruer. C. 96-brønners UniFilter brett. D. Metallplate som gir trykk over hele brettet. Disse komponentene ble satt sammen til en ‘sandwich’ som vist på bildet til høyre. Bildet fra (76).
Etter 2 timer i inkubatoren ble trappestativet tatt ut og demontert. Radioaktivt medium ble sugd opp og cellene ble vasket 2 ganger med 150 µl DPBS, etterfulgt av lysering med 200 µl 0,1 M NaOH. Det ble satt en plastfilm på cellebrettet for å lukke det, og fryst ved -20 °C. Brønnene i filterbrettet ble tilsatt 40 µl Optiphase Supermix og brettet forseglet med TopSeal-A film. Etter 2 dager i romtemperatur ble CO2 målt på Wallac MicroBeta2 Microplate Counter. CO2- målinger ble justert med proteinmålinger ved Bradford metode i avsnitt 2.7.4.
30
Figur 2.4: Prinsippet for substratoksidasjonsmetoden. Det radioaktivt merket substrat tas opp og oksideres i cellene. Dette frigir 14CO2 som fanges i filterbrettet fuktet med NaOH. CO2-mengden som blir fanget kvantifiseres som muliggjør måling av mengde merket substrat (oljesyre eller glukose) som er oksidert av cellene. Bildet fra (76).
2.7.2 Effekt av antimycin A, rotenon, oligomycin og FCCP
Trapping ble gjennomført på samme måte som beskrevet i 2.7.1 i tillegg til at cellene ble behandlet med 2,5 µM antimycin A, 0,5 µM rotenon, 1 µg/ml oligomycin eller 1 µM FCCP.
Disse ble tilsatt til det radioaktive mediet.
2.7.3 Celleassosiert radioaktivitet (CA)
96-brønners brett med cellelysate ble tatt ut av fryseren og tint i inkubator. Etter tining ble 50 µl cellelysat fra hver brønn først overført til Bradford brett og deretter ble 50 µl overført til et 96-brønners CA brett. Dette ble gjort for å få renest mulig lysat til CA. I tomme brønner i brettet ble det tilsatt 50 µl av det radioaktive mediet, minst fire paralleller, som ble brukt i forsøket.
Brønnene i brettet ble tilsatt 100 µl Optiphase Supermix og brettet forseglet med TopSeal-A film. Brettet ble talt på på Wallac MicroBeta2 Microplate Counter.
31
2.7.4 Bradford proteinmåling
Bradford metode ble anvendt til å måle total proteinkonsentrasjon. Den ble vanligvis utført samtidig med CA. Bio-Rad protein Assay Reagent Concentrate inneholder et fargestoff Coomassie Brilliant Blue G-250 som binder seg til proteiner. Det muliggjør måling av proteiner ved absorbans på 595 nm. Ved binding av fargestoffet med proteiner vil fargen endrer seg fra rød til blå. Desto mer protein det er i prøven, desto høyere absorbans.
BSA standarder (0, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 µg BSA/ml 0.1 M NaOH) og 96-brønners brett med cellelysat ble plassert i inkubator til tining. Bio-Rad konsentrat ble fortynnet 1:5 med destillert vann. 50 µl BSA standarder ble tilsatt til kolonne 1 og 2, og 50 µl av cellelysatet fra hver brønn ble overført til de tomme brønnene. 200 µl av Bio-Rad løsningene ble tilsatt til de aktuelle brønnene. Etter 5 minutter ble brettet analysert i Wallac Victor X4 Multimode Plate Reader.
2.8 Glykogensyntese
2.8.1 Tillaging og tilsetting av isotopmedium
Det ble først laget isotopmedium til forsøket. Ønsket mengde isotop [14C (U)]glukose (NEC 042V) med stock konsentrasjon på 100 µCi/ml ble blandet med DMEM m/glukose (10 mM Hepes), til fire 6-brønners brett. Insulin med stock konsentrasjon på 0,6 mM ble fortynnet 1:10 til 60 µM, dvs 10 µl insulin blandet med 90 µl DMEM medium.
Det ble tilsatt 1 µl insulin i 3 brønner i hver brett med sluttkonsentrasjon på 0,1 µM. Med 3 brønner uten insulin og 3 brønner med insulin i 6-brønners brett, ble det tilsatt 500 µl radioaktivt medium til hver brønn. Det som er igjen ble satt i kjøleskapet for seinere telling. Det ble satt på sealing tape på brettet og inkubert ved 37 °C i 3 timer. Etter 3 timer i inkubering, ble medium forsiktig sugd av, og brettene vasket to ganger med 1 ml DPBS.
Det ble tilsatt 350 µl av 1 M KOH i hver brønn. Brettet ble forseglet med TopSeal-A film og fryst ved -20 °C over natt.
32
2.8.2 Glykogensyntese
Før prosedyren, ble det laget fersk 120 mg/ml glykogen ved å blande 0,12 g glykogen i et eppendorf rør med 1 ml dH20.
Cellebrett ble tatt ut av fryseren og satt på is i en isboks. 10 µl av cellelysatet fra hver brønn ble overført til et 96-brønners brett for Pierce proteinmåling (se avsnitt 2.8.3).
300 µl av lyserte celler ble overført til 2 ml rør plassert i en isboks, og tilsatt 95 µl 60% KOH.
50 µl av 120 mg/ml glykogen ble tilsatt i alle rørene som gav en sluttkonsentrasjon på 20 mg/ml glykogen. Etter blanding av prøvene med vortex, ble rørene inkubert i 20 min på varmeblokka ved 80 °C. Prøvene ble satt tilbake på is og tilsatt 1,5 ml iskald 96% EtOH. Prøvene ble blandet med vortex og sentrifugert ved 10 000 rpm i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble forsiktig pipettert ut og prøvene satt tilbake på is. 1 ml 70% EtOH ble tilsatt i prøvene, blandet med vortex og sentrifugert på samme måte. Etter fjerning av supernatanten og lufttørking ble det tilsatt 500 µl dH20. Prøvene ble blandet med vortex og stod 20 minutter i romtemperatur.
Prøvene ble overført til telleglass og tilsatt 3 ml Optiphase Supermix (tellevæske). 50 µl av oppsamlet medium-rester fra avsnitt 2.8.1 ble overført til eget telleglass og tilsatt 3 ml tellevæske. Et telleglass til kontroll ble kun tilsatt 3 ml tellevæske. Prøvene stod i 15 minutter på benken før de ble satt i Scintillasjonstelleren for telling.
2.8.3 Pierce proteinmåling
Pierce metoden brukes til å måle protein fra glykogensyntese. Det ble laget en «working reagens» (WR) med 50:1 BCA reagens A og BCA reagens B. BSA standarder (0, 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 og 1 mg/ml BSA) ble laget i 1 M KOH. 10 µl fra hver standarder, med 2 paralleller hver, ble tilsatt i kolonne 1 og 2 i 96-brønners brett. 10 µl av hver prøve, med 2 paralleller hver, ble tilsatt fra kolonne 3 og utover. 200 µl av WR ble tilsatt i hver brønn. Brettet ble forseglet og inkubert ved 37 °C i 30 minutter. Brettet ble avkjølt i romtemperatur og deretter satt i Victor Nivo Multimode Plate Reader for analysering.
