Efectes d’una dieta rica amb antioxidants en l’envelliment cerebral en rates

(1)

Facultat de Ciències

Memòria del Treball de Fi de Grau

Efectes d’una dieta rica amb antioxidants en l’envelliment cerebral en rates

Maria Barceló Nicolau Grau de Bioquímica

Any acadèmic 2015-16

DNI de l’alumne: 43476427X

Treball tutelat per Antoni Miralles Socias Departament de Biologia

S'autoritza la Universitat a incloure aquest treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línia, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació

Autor Tutor Sí No Sí No

X X

Paraules clau del treball:

envelliment, estrès oxidatiu, cervell, antioxidants, monoamines, SIRT1

(2)

(3)

Resum

L’envelliment és un procés progressiu i universal que provoca el declivi de la funcionalitat de l’organisme, augmentant el risc de mort. Es caracteritza per un increment del dany oxidatiu degut a la producció elevada de radicals lliures i espècies reactives d’oxigen (ROS), lo que potencia el risc de patir malalties degeneratives. El cervell és l’òrgan que presenta la major taxa de consum d’oxigen, de forma que és més susceptible al dany oxidatiu i al deteriorament de les capacitats cognitives i motores. Els ROS actuen sobre els enzims implicats en la síntesi de les monoamines, reduint la seva activitat en la síntesi de neurotransmissors, com la dopamina, la serotonina i la noradrenalina, en les regions cerebrals principalment implicades en els processos cognitius i motors: l’hipocamp i l’estriat.

S’ha demostrat que l’administració farmacològica de substàncies antioxidants, com polifenols, resveratrol, melatonina, vitamina E..., presents de forma natural en diversos aliments, millora les funcions cerebrals incrementant els nivells d’aquestes monoamines. Alguns tenen la capacitat d’activar les sirtuïnes, especialment la SIRT1, la qual s’ha relacionat amb els efectes beneficiosos de la restricció calòrica i l’augment de l’esperança de vida. Aquesta activa diverses vies fisiològiques implicades en evitar l’envelliment i presenta una acció beneficiosa sobre el cervell. En aquest treball es pretenia estudiar els efectes d’una dieta rica en antioxidants sobre l’envelliment cerebral de rates velles mitjançant la realització de diverses proves comportamentals, la determinació dels nivells de monoamines i la quantificació de la SIRT1 en el cervell. Les rates tractades demostraren un cert increment en les monoamines i la SIRT1, però les funcions cognitives i motores no milloraren de manera significativa. Per tant, les quantitats d’antioxidants presents en els aliments no serien suficients per retardar l’envelliment del cervell i es necessitaria una major aportació per aconseguir els resultats esperats.

Abstract

Aging is a universal process that causes progressive decline of an organism’s function, increasing the risk of death. It is characterized by an increased oxidative damage due to the high production of free radicals and reactive oxygen species (ROS), which increases the risk of degenerative diseases. The brain is the organ with the highest rate of oxygen consumption, so it is more susceptible to oxidative damage and impaired motor and cognitive skills. ROS act on enzymes involved in the synthesis of monoamines, reducing its activity in the synthesis of neurotransmitters, such as dopamine, serotonin and norepinephrine, in the brain regions mainly involved in cognitive and motor abilities: the hippocampus and the striatum. It has been shown that a pharmacological administration of antioxidants, such as polyphenols, resveratrol, melatonin, vitamin E..., present naturally in various foods, improves brain function by increasing the levels of these monoamines. Some of them have the ability to activate sirtuins, particularly SIRT1, which is related to the beneficial effects of caloric restriction and increased lifespan. SIRT1 activates different physiological pathways involved in avoiding the effects of aging and has a beneficial effect on the brain. The aim of this work was to study the effects of a diet rich in antioxidants on the brain aging of old rats by performing behavioral tests, the determination of monoamines levels and the quantification of SIRT1 in the brain. Treated rats showed an increase in monoamines and SIRT1, but motor and cognitive functions did not improve significantly. Therefore, the amount of antioxidants present in food wouldn’t be enough to slow down brain aging and it would take a major contribution to achieve the expected results.

(4)

Índex

INTRODUCCIÓ ... 5

OBJECTIU ... 9

MATERIALS I MÈTODES ... 9

1. Animals i tractament ... 9

2. Proves comportamentals ... 10

2.1. Radial maze ... 10

2.2. Reconeixement d’objectes ... 11

2.3. Rota-‐rod ... 12

3. Obtenció de mostres cerebrals ... 12

4. Determinació cromatogràfica per HPLC-‐ED de monoamines, precursors i metabòlits ... 13

4.1. Preparació de mostres ... 14

4.2. Determinació cromatogràfica per HPLC-‐ED ... 14

5. Detecció i quantificació de SIRT1 per tècniques immunològiques (Western Blot) ... 14

5.1. Preparació de les mostres ... 14

5.2. Mètode de l’àcid bicinconínic (BCA) per a la determinació de proteïnes ... 15

5.3. Western Blotting ... 15

6. Anàlisi estadístic ... 18

RESULTATS ... 19

1. Proves comportamentals: Anàlisi de les capacitats cognitives i motores ... 19

1.1. Memòria de treball espacial ... 19

1.2. Memòria de treball episòdica ... 20

1.3. Coordinació motora ... 21

2. HPLC-‐ED ... 22

3. Western blotting ... 25

DISCUSSIÓ ... 25

CONCLUSIONS ... 29

BIBLIOGRAFIA ... 29

(5)

INTRODUCCIÓ

En els últims anys, l’envelliment de les persones a un ritme accelerat, la ràpida disminució de les taxes de fertilitat i l’augment en l’esperança de vida ha donat lloc a un increment de la població envellida.¹ Per aquest motiu, han anat agafant força les investigacions dirigides a entendre les bases moleculars relacionades per ajudar a conèixer els processos implicats en la disfunció i així desenvolupar millors estratègies terapèutiques.²

L’envelliment és un procés universal, intrínsec i multifactorial que provoca la pèrdua progressiva de la funcionalitat de l’organisme i un major risc de mort.^2,3 Es caracteritza per ser declivi funcional depenent del pas del temps que afecta la majoria dels organismes vius.⁴ Encara que avui en dia segueix essent un repte determinar les seves causes, degut a la complexitat dels mecanismes implicats, es considera que l’acumulació amb el temps de dany cel·∙lular és la raó principal.^1,4 Això deriva en una sèrie de processos que contribueixen al fenotip de l’envelliment: comunicació intercel·∙lular alterada, inestabilitat genòmica, desgast dels telòmers, alteracions epigenètiques, pèrdua de la homeòstasi proteica, desregulació en la detecció de nutrients, disfunció mitocondrial, senescència cel·∙lular i esgotament de les cèl·∙lules mare.⁴

A nivell molecular, es postula que un augment continuat en la formació de radicals lliures i espècies reactives d’oxigen (ROS), proteïnes mal plegades i l’acumulació de proteïnes i orgànuls disfuncionals incrementa el risc de patir processos degeneratius, tals com malalties cardiovasculars, distròfia muscular, osteoporosi, artritis, càncer, accidents cerebrovasculars i diversos trastorns neurològics, com Alzheimer, Parkinson i Huntington.¹ La teoria dels radicals lliures planteja la hipòtesi que un increment en el dany oxidatiu de macromolècules causat pels ROS i el fracàs dels mecanismes de protecció per contrarestar-‐los provoca un declivi de les funcions cel·∙lulars, especialment a nivell mitocondrial.^1,2

Els mitocondris són els orgànuls encarregats de la producció d’energia a la cèl·∙lula mitjançant l’obtenció d’ATP per fosforilació oxidativa. La cadena de transport electrònica consumeix més del 90% de l’oxigen captat per la cèl·∙lula, de forma que és molt probable que es produeixin ROS a causa d’una reducció incompleta de l’oxigen a aigua. En condicions normals aquesta producció de ROS es troba controlada, però en una situació d’estrès el rati s’incrementa, provocant dany oxidatiu a macromolècules essencials, com proteïnes, lípids i DNA. Això dóna lloc a mort cel·∙lular, lo que afecta l’esperança de vida de la majoria dels òrgans vitals de l’organisme.²

Com que el lloc de major producció de ROS són els mitocondris, també són els que més sofreixen els seus efectes. El fet que el DNA mitocondrial (mtDNA) manqui d’histones, el microambient oxidatiu que s’estableix, l’eficiència limitada de reparació del mtDNA i la seva proximitat al focus d’origen dels ROS, fa que sigui molt vulnerable al dany oxidatiu.^2,4 Per tant, si aquest dany no es repara, pot provocar una disfunció de la cadena de transport electrònica, donant lloc a la formació de més ROS.

D’aquesta manera s’estableix un cercle viciós que acaba en l’esgotament de l’energia de la cèl·∙lula i apoptosi.²

Per altra banda, el cervell és l’òrgan amb la major taxa de consum d’oxigen de l’organisme i presenta unes defenses antioxidants modestes, lo que provoca que les neurones siguin molt susceptibles a patir dany oxidatiu. Això s’ha considerat com un dels principals causants dels efectes deleteris que ocorren en l’envelliment i les malalties neurodegeneratives.^1,5,6 En l’estudi de l’envelliment cerebral,

(6)

diversos grups han observat que es produeix una acumulació de dany oxidatiu sobre el DNA, ocasionant que es modifiqui el patró d’expressió de diversos gens i disminueixi la seva capacitat de reparació.¹ Si més no, també s’ha vist que aquesta acumulació és diferent segons la regió cerebral, de forma que algunes àrees són més vulnerables que altres. Hi ha una major proporció de DNA modificat en la regió promotora de diversos gens implicats en la plasticitat sinàptica, el transport vesicular i de proteïnes mitocondrials. Amb això es posà de manifest la relació que hi ha entre el dany oxidatiu i la pèrdua de la memòria i les funcions cognitives associada a l’envelliment, ja que es produeix una alteració de la funcionalitat sinàptica.¹

El deteriorament de les funcions cognitives i motores s’ha associat a canvis metabòlics, funcionals i estructurals que sofreix el cervell envellit, inclús en absència de malaltia.^3,7 Aquests canvis produeixen una disminució en la neurotransmissió monoaminèrgica de les regions implicades en els processos cognitius i motors, com l’hipocamp i l’estriat.³ A més, s’ha observat que determinats tipus de neurones del cervell de rates envellides, entre elles les de l’hipocamp, en realitat no disminueixen en nombre, sinó que acumulen contínuament dany oxidatiu al seu DNA.¹

Algunes investigacions han demostrat que els ROS inactiven els enzims limitants de la via de síntesis de les monoamines, la tirosina hidroxilasa (TH) i la triptòfan hidroxilasa (TPH), lo que explicaria el descens dels nivells de les principals monoamines en diferents regions cerebrals durant l’envelliment.^3,5 Concretament, la TH es troba implicada en la síntesis de les catecolamines dopamina i noradrenalina, mentre que la TPH catalitza la formació de la indoleamina serotonina.^8–10 En aquest sentit, els experiments fets a rates velles amb tractaments crònics de substàncies antioxidants, com resveratrol, melatonina o vitamina E, han provat ser efectius a l’hora d’incrementar els nivells de monoamines. Això s’ha associat a un efecte protector sobre la TH i la TPH davant agents oxidants, de forma es va observar una millora en les funcions cognitives i motores.^2,3,5,11 Molts d’aquests composts antioxidants es troben presents de forma natural a la dieta i s’ha vist que tenen efectes en la fisiologia cerebral, ja que poden modificar l’envelliment del cervell i la patogènesi de les malalties neurodegeneratives.¹¹ Per tant, per tal de promoure la millora de la salut i la longevitat, s’ha suggerit l’ús d’aquests ingredients.²

La dieta mediterrània ha estat declarada com una bona estratègia per a la prevenció de malalties i millorar la qualitat de vida. S’ha vist que redueix el risc de patir malalties cerebro-‐ i cardiovasculars, càncer, malalties respiratòries, diabetis i trastorns neurodegeneratius, que són els principals causants de mort en el món. Aquesta dieta es caracteritza pel gran consum de fruites, verdures, gra, etc. El consum de peix és regular, mentre que el de carn, productes lactis i dolços és més baix. També és comú el vi negre i l’oli d’oliva (com a principal font de greix).¹²

El grup de substàncies antioxidants més abundants a la dieta mediterrània i que contribueixen als seus efectes beneficiosos són els polifenols. Els polifenols consisteixen en metabòlits secundaris de plantes que comprenen un gran nombre de composts (més de 8000) caracteritzats per presentar anells aromàtics que contenen un o més grups hidroxils.^7,12–14 Normalment es troben a fruites, verdures, te i vi negre. S’han associat amb la reducció del risc de desenvolupar demència i amb la millora de la funció cognitiva en l’envelliment normal,^13,15 ja que s’ha observat que poden travessar la barrera hematoencefàlica on duen a terme accions neuroprotectores i neuromoduladores.¹⁵

Un tipus de polifenol que en els últims anys ha atret l’atenció de molts investigadors és el resveratrol (3,5,4’-‐trihidroxi-‐trans-‐estilbè, Figura 1), una fitoalexina que es produeix de forma natural en la pell

(7)

del raïm vermell, al vi negre (essent la font més important), a les mores, al cacauet, entre d’altres.^2,14,16 És produït en una gran varietat de plantes sotmeses a un estrès ambiental, on té propietats antifúngiques. Existeixen dos isòmers del resveratrol (cis i trans) els quals tenen diferents funcions biològiques i se sap que el trans no és tòxic.²

Figura 1. Estructura química del trans-‐resveratrol.

S’ha vist que el resveratrol presenta efectes protectors en diverses patologies, ja que duen a terme tota una sèrie d’efectes biològics: antioxidant, anti-‐plaquetes, inhibició de la peroxidació lipídica, activitat vasorrelaxant, antiinflamatori, anti-‐càncer, anti-‐mutagènic, protector front a la patologia ateroscleròtica i cardioprotector. Aquestes propietats s’han associat a la seva capacitat de reduir l’estrès oxidatiu ja que, a part de ser un antioxidant per sí mateix, també indueix l’expressió d’enzims antioxidants.^2,12 A més, es tracta d’un potent activador de la sirtuïna 1 (SIRT1).^7,13,14,16

Les sirtuïnes són histones desacetilases (HDACs) de classe III que s’ha vist que regulen una gran varietat de processos fisiològics, tals com inflamació, senescència cel·∙lular/envelliment, apoptosi/proliferació cel·∙lular, diferenciació cel·∙lular, metabolisme, pluripotència de les cèl·∙lules mare, regulació del cicle cel·∙lular...^14,17–19 Una de les primeres sirtuïnes identificades fou nomenada Sir2 (silent information regulator) i es trobava a llevats, on actuava com un factor encarregat del silenciament de molts de gens. Més tard es va relacionar amb l’allargament de l’esperança de vida.¹⁸ Posteriorment, en mamífers s’identificaren set sirtuïnes (SIRT1-‐SIRT7) que eren homòlogues a Sir2, on la SIRT1 és la que presenta una major similitud respecte la seqüència genètica.^2,16,18 Les sirtuïnes 1, 2, 3, 5 i 6 presenten una activitat desacetilasa dependent de NAD⁺, mentre que per la SIRT7 encara no es té molt clar i la SIRT4 actua principalment com una mono-‐ADP-‐ribosil transferasa. Els nivells de NAD⁺ s’ha vist que augmenten en l’exercici, el dejuni i la restricció calòrica, de forma que en aquestes situacions les sirtuïnes dependents s’activarien. Per altra banda, la reducció del NAD⁺ a NADH disminueix la seva activitat.¹⁹

Una de les sirtuïnes més estudiades fins als moment és la SIRT1, que es creu que és l’encarregada dels efectes beneficiosos sobre la salut i la longevitat de la restricció calòrica i el resveratrol.¹⁶ Normalment es localitza al nucli, però pot viatjar al citoplasma quan és necessari que actuï sobre dianes citoplasmàtiques.¹⁹ S’encarrega de desacetilar tant histones, promovent la formació d’heterocromatina i la repressió transcripcional, com proteïnes que no són histones. Entre aquestes proteïnes es troben: p53, NF-‐kB, PGC-‐1α, FOXO, LXR, PARP, HIF-‐1α... de forma que té la capacitat de regular el metabolisme, la supervivència cel·∙lular, l’envelliment, la inflamació, la funció immunològica i moltes altres funcions biològiques (Figura 2).^2,13,20

(8)

Figura 2. Esquema d’algunes substàncies que activen la SIRT1 (resveratrol i melatonina) i les dianes moleculars sobre les que aquesta actua, modificant així tota una sèrie de funcions relacionades amb l’envelliment (Adaptat de Ramis et al., 2015).²

El fet que la SIRT1 precisi de NAD⁺ com a cofactor per dur a terme la seva funció, fa que la seva activitat es trobi molt lligada a l’estat energètic i metabòlic de la cèl·∙lula.² Per tant, SIRT1 es troba molt vinculada al rati NAD⁺/NADH i una depleció del NAD⁺ és una de les causes de dany genotòxic a les cèl·∙lules.¹ En l’envelliment disminueixen els nivells de NAD⁺ en els teixits, de forma que l’activitat de la SIRT1 disminueix i s’incrementa la formació de ROS en el mitocondri.²⁰ També s’ha suggerit que l’activació persistent de la resposta al dany produït al DNA produeix una pèrdua de la seva activitat.² Aquesta proteïna presenta una elevada expressió durant el desenvolupament i en el cervell de mamífers adults, on s’ha relacionat amb diversos processos biològics com resistència a l’estrès, reducció de l’apoptosi i prevenció de la degeneració axonal, entre d’altres.¹ També s’ha associat amb un increment de la viabilitat neuronal, possiblement mitjançant l’estimulació de la via de les proteïnes quinases activades per mtiògens (MAPK).¹³ La SIRT1 s’expressa sobre tot en les neurones de l’hipocamp i la seva absència s’ha vist que provoca un deteriorament de diverses habilitats cognitives, com la memòria.²

Una altra substància que s’ha vist que pot activar la SIRT1 és la melatonina (N-‐acetil-‐5-‐

metoxitriptamina), una indoleamina de producció endògena que també es troba present en diversos aliments. Se sintetitza a partir de l’aminoàcid essencial L-‐triptòfan i es tracta d’un producte de secreció de la glàndula pineal. També presenta activitat antioxidant de forma que pot eliminar els radicals lliures que es formin, així com pot incrementar l’activitat dels enzims antioxidants endògens.

A més, diversos estudis han afirmat que la melatonina i el resveratrol duen a terme una acció sinèrgica, ja que presenten efectes beneficiosos similars.²

Per últim, com ja s’ha comentat anteriorment, la restricció calòrica també indueix l’activació de la SIRT1.²¹ La restricció calòrica es defineix com la reducció de la ingesta calòrica aproximadament en un 30%, sense comprometre el manteniment de tots els nutrients essencials i provocar malnutrició.

Això s’ha associat amb un increment de l’esperança de vida i la protecció contra malalties metabòliques.^2,22 Aquesta situació no solament augmentant els nivells i l’activitat de la SIRT1, sinó que modifica el rati NAD⁺/NADH cap a una major producció de NAD⁺, activant la sirtuïna encara més.^14,22 La modulació nutricional que s’aconsegueix mitjançant la restricció calòrica ha demostrat ser efectiva contra l’envelliment,¹ ja que actua en un ampli espectre de teixits: fetge, ronyó, múscul esquelètic, teixit adipós, cèl·∙lules β pancreàtiques i cervell.^23,24

(9)

La restricció calòrica retarda l’acumulació cel·∙lular de molècules modificades a causa del dany oxidatiu associat a l’envelliment. Redueix l’increment de la peroxidació lipídica, evita l’acumulació de proteïnes oxidades i eleva el recanvi proteic, així com també redueix el dany oxidatiu sobre el DNA,² a través de la SIRT1.¹⁹ En el cervell, les vies de senyalització implicades en l’acció anti-‐envelliment de la SIRT1 permeten que es produeixi una resposta adaptativa contra l’estrès, de forma que es millora la capacitat a resistir un major estrès mitjançant la reparació i supervivència cel·∙lular. Per tant, aquesta condició s’ha associat amb una millor activitat elèctrica i sinàptica dels circuits neuronals.⁷ Té un efecte beneficiós sobre el deteriorament de l’aprenentatge i la memòria que es produeix durant l’envelliment en rosegadors i en humans.²

OBJECTIU

L’objectiu d’aquest treball és estudiar en rates velles el possibles beneficis d’una dieta rica en antioxidants (polifenols, resveratrol, melatonina, vitamina E...) a nivell comportamental (memòria de treball espacial amb el laberint radial; memòria episòdica amb la prova del reconeixement d’objectes; i la coordinació motora amb el cilindre rotatori) i neuroquímic (determinació dels nivells i la síntesi dels neurotransmissors monoaminèrgics al cos estriat i a l’hipocamp, mitjançant cromatografia per HPLC-‐ED; i determinació de SIRT1 a l’hipocamp per la tècnica immunològica Western Blot), millorant el deteriorament ocorregut amb el pas del temps al cervell i retardar així l’aparició de malalties neurodegeneratives.

MATERIALS I MÈTODES

1. Animals i tractament

Durant l’experiment es varen emprar 18 rates mascle Wistar adultes (pes de 535 ± 25 g, 2 animals per gàbia) lliures de patògens específics (SPF) (Charles River, Barcelona), per poder observar els efectes beneficiosos a llarg termini (6 mesos de tractament) que podria tenir una dieta rica en antioxidants sobre el deteriorament cognitiu i motor deguts a l’envelliment, en comparació a rates joves de 4 mesos d’edat (7 en total). Aquests animals es mantingueren en l’estabulari de la Universitat de les Illes Balears (Tipus II, registre núm. ES704000000540 de la Conselleria d’Agricultura, Pesca i Alimentació de la Comunitat Autònoma de les Illes Balears), adequat per a la investigació amb animals SPF, fins assolir l’edat necessària per dur a terme les diferents proves de l’estudi.

Les rates residiren en gàbies de metacrilat (Panlab S.L., Barcelona) amb encenall de fusta com a material de nidificació (Ultrasorb, Panlab). S’ubicaren en una cambra amb unes condicions ambientals determinades i controlades: temperatura (22 ± 2°C), humitat (70%) i cicle de llum-‐foscor 12h/12h (amb el canvi de llum a les 8:00 h y a les 20:00 h), emprant llums fluorescents de 250-‐300 lux de llum indirecta.

Fins als 14 mesos aquestes rates foren alimentades ad libitum amb una dieta comercial estàndard (Panlab A04) i lliure accés a aigua. Arribats a aquest punt, els animals foren separats en dos grups.

Per una banda, el grup control es formà amb 12 rates que es varen seguir alimentant amb les mateixes condicions que antes, és a dir, amb una dieta comercial ad libitum, fins als 20 mesos. Per altra banda, als 6 animals restants se’ls restringí la quantitat de menjar del que disposaven a 30

(10)

mg/rata/dia per assegurar els requeriments nutricionals suficients per animals d’aquesta edat. A aquestes últimes, durant els 6 mesos següents (fins que tingueren 20 mesos), també se’ls subministrà aliments rics en antioxidants (procedents de mercats i supermercats locals) 3 pics per setmana (aproximadament 20-‐25 g per animal). Cal destacar que en el cas dels animals tractats tan sols hi havia un animal per gàbia per assegurar que tots s’alimentaven de la mateixa quantitat de menjar.

Aquesta dieta tan específica (Figura 3) consistia en una sèrie de fruites i verdures (bròcoli, pastanagues, tomàtigues, pomes, prunes, raïm, taronges, nous, ametlles...) i cereals (com civada i blat). A més, a part de tenir lliure accés a l’aigua durant tot el tractament, disposaven d’un altre bevedor que contenia diferents tipus de sucs (de pinya, de fruits rojos...) o tes (com te verd i te vermell). Per fer un seguiment dels efectes de la dieta rica en antioxidants sobre les habilitats cognitives i motores de les rates es van anar fent una sèrie de proves comportamentals (veure apartat de Materials i mètodes) antes de començar el tractament (als 14 mesos), a la meitat (17 mesos) i al final d’aquest (als 20 mesos). En els períodes que les rates havien de dur a terme les proves comportamentals se’ls administrava la dieta quan aquestes finalitzaven.

Figura 3. Exemples dels diferents aliments emprats en la dieta (Font: Laboratori de Neurofisiologia).

Els animals foren tractats amb concordança al Conveni Europeu sobre la Protecció dels Animals Vertebrats Utilitzats per Experimentació i altres fins científics (Directiva 86/609/EEC), essent els protocols seguits durant la investigació aprovats pel Comitè d’Ètica d’Experimentació Animal de la Universitat de les Illes Balears.

2. Proves comportamentals

Les proves comportamentals realitzades per analitzar la capacitat cognitiva i motora dels animals s’efectuaren abans d’iniciar el tractament, és a dir, quan les rates tenien 14 mesos. Es tornaren a realitzar a meitat del tractament (17 mesos) i al finalitzar aquest (20 mesos). Després de les primeres proves, se seleccionaren quines rates formarien part de cada grup per tal que fossin el més homogenis possibles. Així, com s’indica als resultats, el paràmetre estadístic corresponent no detectaria diferències significatives entre els dos grups abans de l’inici del tractament (14 mesos).

2.1. Radial maze

El Radial maze, també conegut com laberint radial (Panlab S.L., Barcelona, Espanya), consisteix en una base central octogonal de 28 cm de diàmetre de la qual emergeixen 8 braços (70 x 11 cm) equidistants (Figura 4). Mitjançant aquesta prova es permet analitzar la memòria de treball espacial dels animals.^5,17,25

(11)

Figura 4. Dispositiu del Radial maze o laberint radial (Font: Laboratori de Neurofisiologia).

Prèviament a la realització del test les rates es deixen en dejú 24-‐48 hores (depenent de l’edat de l’animal) però amb lliure accés a l’aigua, de forma que se situen petites quantitats de menjar en els extrems dels braços del laberint que serveixen com a reforç positiu per tal que l’animal s’introdueixi dins ells. Es comença la prova dipositant la rata al centre de l’estructura i es fa un seguiment del recorregut que duu a terme anotant els braços als quals entra i el temps total transcorregut, així com també el nombre d’errors comesos, és a dir, els braços als quals no ha entrat i les reentrades a braços ja visitats. El test es donarà per finalitzat quan l’animal hagi entrat a tots els braços o quan hagi passat un temps màxim de 20 minuts. Finalment, els resultats s’analitzen mitjançant el programa informàtic Smart v2.5 (Panlab S.L.).

2.2. Reconeixement d’objectes

Mitjançant el test de reconeixement de nous objectes es pot analitzar la memòria episòdica en rates velles. Es tracta d’un test basat en l’habilitat exploratòria espontània dels animals on s’analitza la capacitat d’integrar nova informació i recuperar la informació ja adquirida a curt termini (10 minuts).^17,26,27

El test es realitza dins l’estructura de camp obert (78 cm de diàmetre i parets de 60 cm d’altura) que està construït amb fusta i metacrilat. En la seva base s’hi troben dibuixades dues marques a 23 cm del centre que indiquen on s’han de col·∙locar els objectes d’experimentació. Mitjançant aquesta prova s’avaluen dos paràmetres: el temps d’exploració de cada objecte i el recorregut dut a terme. El reconeixement d’objectes consta de dues fases (Figura 5):

1) Habituació. En primer lloc s’ha d’acostumar l’animal al lloc on es realitzarà la prova, és a dir, el camp obert. Es deixa que explori lliurement i així es vagi familiaritzant a l’entorn.

D’aquesta forma, 3 dies antes al test es col·∙loca cada animal dins el dispositiu sense els objectes que s’empraran en l’experiment durant 10 minuts. Durant aquesta fase és important que la rata vegi l’experimentador perquè no s’espanti quan el vegi durant la fase de test o quan senti el renou del cronòmetre (que es va prement aleatòriament) (Figura 5A).

2) Prova. Per dur a terme aquesta fase s’han de seguir una sèrie de passes:

a) Rehabituació. Just antes de començar tot el procés es posen els animals dins el camp obert 1 minut sense objectes perquè el reconeguin.

b) Familiarització. Se situen dos objectes iguals en color, forma i grandària (cubs de plàstic de 6x6 cm) en les marques corresponents amb l’ajuda de la veta adherent.

Després es col·∙loca la rata en el centre i es deixa que explori els dos objectes un màxim de 10 minuts (Figura 5B).

c) Retard. Es deixa passar 10 minuts antes de realitzar el test.

(12)

d) Test. Se substitueix un dels dos objectes per un altre completament diferent en forma, color i grandària (bitlla de 8x5 cm) i es deixa un exactament igual als anteriors. Llavors es torna col·∙locar l’animal al centre del camp obert i es deixa explorar un màxim de 10 minuts (Figura 5C).

Figura 5. Imatges de les diferents fases del reconeixement d’objectes: A) dispositiu del camp obert amb l’animal en la fase d’habituació; B) fase de familiarització amb dos objectes idèntics; C) fase de test, on es troben dos objectes distints (Font:

Laboratori de Neurofisiologia).

2.3. Rota-‐rod

Aquest aparell (Panlab S.L.) consta d’una roda (8 cm de diàmetre) col·∙locada a una altura de 42 cm (Figura 6). Amb el Rota-‐rod s’aconsegueix analitzar la coordinació motora dels animals.²⁸

Figura 6. Dispositiu de Rota-‐rod (Font: Laboratori de Neurofisiologia).

La prova es duu a terme en dues fases:

1) Entrenament. Té com a objectiu que els animals s’acostumin a realitzar l’exercici i a aguantar damunt la roda un cert temps antes de caure. Amb el mode de manteniment la velocitat de la roda és constant a 4 rpm per així entrenar l’animal.

2) Test. Es deixa l’animal damunt la roda amb el mode de manteniment i quan s’estabilitza es canvia al mode acceleració, on es va augmentant progressivament la velocitat de rotació de 4 a 40 rpm en un minut. Cada rata ha de repetir 5 vegades la prova deixant uns quants minuts entre cada trial perquè així puguin recuperar-‐se. S’anota el temps que es mantenen damunt la roda i la velocitat a la que arriben.

3. Obtenció de mostres cerebrals

Una vegada acabat el tractament i quan les rates tenien 20 mesos d’edat, aquestes foren sacrificades per decapitació per posteriorment procedir amb l’extracció de teixit cerebral. Trenta minuts abans del sacrifici, se’ls injectà intraperitonealment 100 mg/kg de NSD-‐1015 (Sigma-‐Aldrich, Madrid, Espanya), tant al grup control com al grup que havia seguit la dieta (veure apartat 4). Una vegada sacrificades les rates, es començà la dissecció del cervell sobre una placa d’alumini a 4°C. Es van

A) B) C)

(13)

extreure les regions cerebrals de l’hipocamp i l’estriat, les quals es congelaren immediatament amb nitrogen líquid i s’emmagatzemaren a -‐80°C per usar-‐les posteriorment.

4. Determinació cromatogràfica per HPLC-‐ED de monoamines, precursors i metabòlits La síntesi i metabolisme dels neurotransmissors monoamines, concretament les catecolamines i indoleamines, en els diferents grups de rates es va poder conèixer a partir de l’anàlisi de les regions cerebrals riques en terminals nerviosos monoaminèrgics, és a dir, l’hipocamp i l’estriat.

Concretament, a l’hipocamp hi ha una major abundància dels sistemes serotonèrgic (serotonina) i noradrenèrgic (noradrenalina), mentre que en l’estriat hi predomina el dopaminèrgic (dopamina).

El motiu d’injectar NSD-‐1015 (clorhidrat de 3-‐hidroxibenzil-‐hidrazina) poc abans del sacrifici es deu a que es tracta d’un inhibidor de l’enzim descarboxilasa de L-‐aminoàcids aromàtics (AADC), implicada en la ruta de síntesi de catecolamines i indoleamines. Gràcies a la seva acció es pot determinar l’activitat dels enzims tirosina hidroxilasa (TH) i triptòfan hidroxilasa (TPH), ja que ambdós són enzims limitants de les rutes de síntesi de les diferents monoamines (Figura 7).

Figura 7. Representació esquemàtica de les rutes biosintètiques de catecolamines i indoleamines en les regions cerebrals de l’hipocamp i l’estriat. Amb una creu vermella s’indica el punt en el que el NSD-‐1015 inhibeix la descarboxilasa de L-‐

aminoàcids aromàtics (AADC).

L’enzim TH es troba implicat en la síntesi de dopamina (DA) i noradrenalina (NA), el qual catalitza la transformació de la tirosina en el precursor comú de la DA i la NA, la dihidroxifenilalanina (DOPA).^8,10 L’enzim TPH participa en la formació de la serotonina (5-‐hidroxitriptamina o 5-‐HT) transformant el triptòfan en el seu precursor, el 5-‐hidroxitriptòfan (5-‐HTP).⁹ Inhibint la AADC amb el NSD-‐1015 es produeix una acumulació dels precursors de les monoamines, de forma que serveix com un indicador de l’activitat in vivo de les dues hidroxilases.²⁹ La cromatografia líquida d’alta resolució amb una posterior detecció electroquímica (HPLC-‐ED) permet determinar la concentració de DA, NA, 5-‐HT, els seus precursors i alguns metabòlits. Concretament, es quantificaren els nivells de: àcid 3,4-‐

dihidroxifenilacètic (DOPAC) i àcid homovanílic (HVA), que s’obtenen a partir de la DA; i de l’àcid 5-‐

hidroxindolacètic (5-‐HIAA), procedent de la 5-‐HT.^8,9 Cal destacar que aquesta tècnica no permet la determinació de metabòlits de la NA. Si més no, els nivells dels precursors no són representatius ja

(14)

que la inhibició del NSD-‐1015 provoca una acumulació d’aquests durant els 30 minuts antes que les rates siguin sacrificades.

4.1. Preparació de mostres

Cada una de les regions cerebrals extretes es pesaren i s’introduïren dins tubs amb 1 mL de tampó (0.4 M HClO4, 0.01% K2EDTA i 0.1% Na2S2O4). Posteriorment, s’homogeneïtzaren les mostres amb Ultra-‐Turrax (Tipus Tp 18/10) durant 30 segons a màxima velocitat. L’homogenat obtingut fou centrifugat a 30.000 g durant 5 minuts a 4°C (centrífuga refrigerada Biocen 22R Ortoalresa, amb rotor 222) i el sobrenedant resultant es filtrà mitjançant filtres de tefló de 0.45 μm (Millex®-‐LH; PTFE Hydrophilic, Millipore, Darmstadt, DE). Finalment, el filtrat obtingut s’emmagatzemà a -‐80°C fins el moment de processar les mostres.

4.2. Determinació cromatogràfica per HPLC-‐ED

Els nivells de precursors, monoamines i els seus metabòlits corresponents es determinaren mitjançant HPLC-‐ED en una columna en fase reversa Spherisorb S3 ODS1 (3 μm de grandària de partícula, 4.6 mm x 10 cm; Waters) acoblada a una a una precolumna Tracer ODS2 C18 (2-‐5 μm de grandària de partícula; Teknokroma). La fase mòbil aquosa (KH2PO4 0.1 M; àcid octà sulfònic 2.1 M;

K2EDTA 0.1 M i metanol 11.5% (v/v) ajustat a un pH de 2.72 amb H3PO4 al 85%) fou impulsada a un flux de 0.8 mL/min per una bomba de doble pistó (Waters M-‐510). Les molècules foren detectades a través d’una cèl·∙lula amb un elèctrode de treball de carboni vitri amb un potencial de 0.75 V (Waters Concorde Electrochemical Detector). Llavors, la corrent produïda es monitoritzà emprant una interfase Waters bus SAT/IN Module connectada a un ordenador, on gràcies al software Empower Pro (Waters) s’analitzaren les concentracions dels diferents composts a partir del cromatograma obtingut (Figura 8). Aquestes es calcularen interpolant l’altura del pic del cromatograma obtingut amb una corba estàndard realitzada en paral·∙lel per a cada compost amb patrons externs.

Figura 8. Esquema del funcionament de HPLC.

5. Detecció i quantificació de SIRT1 per tècniques immunològiques (Western Blot) 5.1. Preparació de les mostres

Una vegada aïllat l’hipocamp de les diferents mostres cerebrals, es pesà i s’homogeneïtzà amb un homogeneïtzador d’aspes Ultraturrax en dos cicles de 10 segons al 80% de la velocitat màxima en una proporció 1:15 pes/volum de tampó d’homogeneïtzació (50 mM Tris-‐HCl, 1 mM EDTA potàssic, 2% SDS, amb aigua miliQ, pH 6.8) que contenia inhibidors de proteases (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma P8340): ABESF (1.04 mM), leupeptina (20 μM), E64 (14 μM), pepstatina A (15 μM), bestatina (40 μM) i aprotinina (0.8 μM); així com inhibidors de fosfatases: cantaridina, (-‐)-‐p-‐bromolevamisole

(15)

oxalat i caliculina A (Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, Sigma P0044) en una concentració final d’1%

v/v.

Posteriorment, les mostres se sotmeteren a sonicació per polsos (dos cicles de 10 segons) i d’aquí es guardaren 50 μL d’homogenat per realitzar la determinació de proteïnes pel mètode de l’àcid bicinconínic o BCA (apartat 5), mentre que la resta de la mostra va ser emmagatzemada a -‐80 °C fins conèixer la concentració proteica. Una vegada determinada (veure apartat 5.2), cada una de les mostres de teixit cerebral fou diluïda amb el tampó d’homogeneïtzació amb l’objectiu d’obtenir una concentració proteica de 6 μg/μL. Després es feia una dilució 1:1 amb el tampó de càrrega Laemmli 2x (50 mM Tris-‐HCl, 2% SDS, 10% glicerol, 2.5% 2-‐mercaptoetanol, 0.1% blau de bromofenol, pH 6.8) obtenint una concentració final de 3 μg/μL. Un cop fet, les proteïnes es desnaturalitzaren encalentint les mostres durant 4 minuts a 95 °C y es guardaren a -‐20°C per la seva posterior utilització.

5.2. Mètode de l’àcid bicinconínic (BCA) per a la determinació de proteïnes

La determinació de la concentració proteica de les mostres es va realitzar amb el mètode del BCA ja que les mostres contenien SDS (detergent aniònic) i és compatible amb una concentració de fins a un 1% de SDS. Aquesta tècnica es basa en el fet que les proteïnes reaccionen amb l’ió coure (Cu²⁺) a través del seu enllaç peptídic de forma que el redueixen a Cu⁺ en un medi alcalí (reacció de Biuret).

D’aquesta manera, dues molècules d’àcid bicinconínic tenen la capacitat de reaccionar amb un ió Cu⁺ generant un producte soluble en aigua que produeix una coloració púrpura i presenta un màxim d’absorbància a una longitud d’ona de 562 nm.

L’obtenció del producte púrpura s’aconsegueix mitjançant el que es coneix com reactiu de treball, el qual està compost per un reactiu A (carbonat de sodi, bicarbonat de sodi, àcid bicinconínic i tartrat de sodi en una solució de NaOH 0.2 N) i un reactiu B (sulfat de coure al 4%) que s’afegeixen a les mostres de proteïnes amb una relació 50:1 (A:B). Els valors d’absorbància es llegiren a un espectrofotòmetre (BioPhotometer, Eppendorf, Hamburg, Alemania) a 562 nm front a un blanc de reactiu. Finalment, per tal de poder establir una relació entre absorbància i concentració proteica es va construir una recta patró a partir d’estàndards de proteïna. En aquest cas s’emprà l’albúmina bovina sèrica (BSA, 1 μg/μL) i es feren dilucions de concentració coneguda. Mitjançant la interpolació dels valors d’absorbància a valors de concentració a través del patró es pogué determinar la quantitat de proteïna present en cada mostra.

5.3. Western Blotting

El Western Blot és una de les tècniques més àmpliament emprades per a la detecció i identificació de proteïnes mitjançant anticossos (tècnica immunològica), que en aquest cas ha permès la identificació i la quantificació de la SIRT1 en mostres d’hipocamp de rates. El mètode està constituït per diverses passes: separació mitjançant electroforesi de les proteïnes presents en la mostra, transferència de les proteïnes del gel d’electroforesi a una membrana de nitrocel·∙lulosa (que immobilitza les proteïnes), fixació a la membrana dels anticossos corresponents (que reconeixen la proteïna d’interès en l’estudi) i revelatge (detecta i permet quantificar la quantitat de proteïna present).

La separació de proteïnes es dugué a terme mitjançant electroforesis en gels de poliacrilamida en condicions desnaturalitzants SDS-‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) (Figura 9).³⁰ S’empraren gels discontinus de poliacrilamida on es podien diferenciar dues zones: un gel concentrador de la mostra (stacking gel), compost per un 4%

d’acrilamida/bisacrilamida, 166 mM Tris-‐HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.2% persulfat amònic i 0.08%

(16)

N,N,N’,N’-‐tetrametiletilendiamina (TEMED); i un gel de resolució o separació de les proteïnes (running gel o resolving gel) constituït per un 10% d’acrilamida/bisacrilamida, 0.75 M Tris-‐HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, 0.05% persulfat amònic i 0.05% TEMED. Aquests gels presentaven una grandària de 7x10 cm amb 1 mm d’espessor.

Figura 9. Electroforesi en gels SDS-‐PAGE. En aquesta imatge es poden observar tant el gel concentrador (stacking gel) com el gel de resolució (resolving gel).

En el gel concentrador de cada un dels gels s’introduïren unes pintes de tefló que formaren els 15 carrils o pouets on s’hi introduïren les mostres a separar. Concretament, es carregaven 13,5 μL de mostra per carril (que corresponia a 40 μg de proteïna). En el primer carril de cada gel es carregaven 3 μL del marcador de pesos moleculars o estàndard acolorit Prestained SDS-‐PAGE Standard-‐Broad-‐

Range (Bio-‐Rad), que consisteix en una mescla de 8 proteïnes amb pesos moleculars coneguts (entre 10 i 200 kDa aproximadament). Una vegada les mostren foren introduïdes al stacking gel, els gels foren sotmesos a una corrent continua de 80 volts durant 20 minuts fins que les proteïnes arribaven al resolving gel, on en aquest moment s’augmentava la corrent a 120 volts i es deixava així fins que finalitzés la separació (aproximadament 90 minuts). El tampó d’electroforesi emprat tenia un pH de 8.5-‐8.6 i consistia en 25 mM Tris base, 0.2 Glicina i 0.1% SDS.

Posteriorment, les proteïnes eren transferides a una membrana de nitrocel·∙lulosa amb un diàmetre de porus de 0.45 μm (Schleicher & Schuell, Alemanya) aplicant un camp elèctric. Aquesta part del procés és la que es coneix com western blot en sí, on les proteïnes passen a un medi més estable i rígid que permet que estiguin més accessibles i interaccionin amb altres molècules per permetre la seva detecció (al contrari del gel d’electroforesi). Per dur a terme l’electrotransferència, el gel i la membrana es col·∙loquen un front l’altre i s’envolten d’un conjunt de papers de filtre (3MM Whatman) i esponges compressores, on tot està subjecte per una estructura de plàstic i submergit dins un tampó específic per la transferència (25 mM Tris-‐HCl, 60 mM Glicina, 20% metanol, pH 8.4) (Figura 10). Després es deixa a 4°C durant aproximadament dues hores i mitja a 110 volts.

(17)

Figura 10. Imatge il·∙lustrativa de la col·∙locació dels distints materials que envolten el gel de poliacrilamida i la membrana de nitrocel·∙lulosa per dur a terme l’electrotransferència.

La identificació de les proteïnes és possible mitjançant anticossos amb una tècnica coneguda com immunoblotting. Aquest mètode es basa en la capacitat dels anticossos de reconèixer molècules específicament, conegudes com antígens. És a dir, les proteïnes d’estudi actuen com antígens de forma que els anticossos s’uneixen a elles, en una zona determinada coneguda com epítop, a través d’interaccions no covalents (ponts d’hidrogen, forces de Van der Waals, interaccions iòniques, atraccions hidrofòbiques).

Antes d’incubar les membranes amb els anticossos, en acabar la transferència, aquestes van ser rentades per tal d’eliminar l’excés de metanol amb tampó Tris salí o TBS (20 mM Tris-‐HCl, 137 mM NaCl, pH 7.6). Posteriorment, s’incubaren les membranes durant 1 hora a temperatura ambient amb una solució que consistia en tampó TBS que contenia un 10% de llet en pols desnatada i 0.1% Tween-‐

20 (monolaureat de polioxietileno-‐sorbitan, un detergent que ajuda a eliminar el renou de fons a l’hora de revelar la membrana). Gràcies a les proteïnes presents en la solució amb llet es permet que es bloquegin les membranes ja que aquestes s’uneixen inespecíficament a totes les regions de la membrana que no han adsorbit proteïnes procedents del gel després de l’electrotransferència.

D’aquesta forma, a l’hora d’introduir els anticossos aquests no duran a terme interaccions inespecífiques amb altres proteïnes no desitjades i s’augmenta la probabilitat que s’uneixin als seus respectius antígens.

Posteriorment al bloqueig, les membranes es tornaren a rentar, aquesta vegada amb TBS Tween (TBS amb un 0.1% de Tween-‐20), i s’incubaren tota la nit a 4°C amb una solució que contenia l’anticòs primari (5% de llet en pols i 0.5% de BSA en tampó TBS Tween). Per poder detectar específicament la SIRT1 s’emprà un anticòs primari policlonal que consistia en una IgG de conill contra la SIRT1 (pèptid immunògen aminoàcids 1-‐130 de SIRT de rata) obtingut de Merk Millipore (07-‐131, lot 2428681) i es trobava en una dilució 1:1000 dins la solució. Per altra banda, es va emprar la β-‐actina com housekeeping (proteïna que no modifica la seva expressió en aquestes condicions en concret) i s’usà un anticòs monoclonal anti-‐β-‐actina de rata (clon AC-‐15, Sigma A1978, lot 084M4770V, dilució 1:10000).

Seguidament es rentaren de nou les membranes amb TBS Tween antes d’incubar-‐les amb l’anticòs secundari (per SIRT1: goat anti-‐rabbit HRP-‐linked antibody de Cell Signaling, #7074, lot 0025, dilució 1:5000; per β-‐actina: horse anti-‐mouse HRP-‐linked antibody de Cell Signaling, #7076, lot 0031, dilució 1:5000) durant una hora a temperatura ambient. En aquest cas, l’anticòs es trobava conjugat amb