fordøyelsessystem
Polysacchardies from plants in a in vitro digestive system
Marikken Dølven
Institutt for kjemi, bioteknoligi og matvitenskap (IKBM) Masteroppgave 60 stp. 2011
Forord
Denne masteroppgaven ble utført på Nofima AS, på Ås, i perioden januar til desember 2011.
Oppgaven utgjør 60 studiepoeng av totalt 120 studiepoeng i studieprogrammet Master i matvitenskap (retning mat og helse), Instituttet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap (IKBM) på Universitetet for miljø- og biovitenskap (UMB).
Først og fremst vil jeg takke mine to gode veiledere på Nofima; hovedveileder Svein Halvor Knutsen og tilleggsveileder Simon Ballance for veiledning og støtte gjennom hele perioden.
Jeg er utrolig takknemlig for all den tid og energi dere har satt av til meg, og ikke minst for at dørene deres alltid har vært åpne når jeg har hatt spørsmål. Dere har gitt meg et svært lærerikt år!
Videre så ønsker jeg å rette en stor takk til Trygve Helgerud på Nofima, som har bidratt med sin kunnskap og erfaring med HPLC gjennom hele perioden. Tusen takk for at du har vært så hjelpsom! Og hjertelig takk til Nils Kristian Afseth for hjelp til FT-IR spektrofotometer.
Lene Ruud Lima og Anne Helene Bjerke har også vært til umåtelig stor hjelp. Tusen takk for praktisk hjelp og tips til utfordringer jeg har møtt på laboratoriet!
Og sist, men ikke minst; tusen takk til internveileder på IKBM, Gerd Vegarud!
Ås, 14. desember 2011.
……….
Marikken Dølven
Sammendrag
Fokuset i denne oppgaven har vært rettet mot kostfiber i bygg (byggris) og brokkoli, og det har blitt utført eksperimenter for å framstille og å kvantifisere disse. Det har blitt brukt fire ulike in vitro fordøyelsesmodeller som delvis har blitt sammenlignet opp mot hverandre: NSP (ikke-stivelses polysakkarider/non-starch polysaccharides)-analyse basert på Englyst et al.
1994, enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010), in vitro enzymatisk fordøyelse for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999), og en metode som er basert på sistnevnte, men hvor de standardiserte og kommersielt tilgjengelige enzymene er byttet ut med humane fordøyelsesenzymer donert av frivillige menn og kvinner (Almaas et al. 2006;
Ulleberg et al. 2011).
Mengdene kostfiber funnet i byggris og brokkoli varierte med hensyn til metode;
enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden ga en noe høyere mengde kostfiber enn summert karbohydratinnhold funnet i henhold til NSP-metoden. Da metodene baserer seg på mye av den samme metodikken er det derimot ingenting som tilsier at resultatene skal bli forskjellige. Det ble funnet følgende mengder kostfiber per 100 gram tørrstoff: 9-14 gram i ubehandlet byggris, 10-15 gram i kokt byggris, 18-27 gram i rå brokkoli og 25-37 gram i blansjert brokkoli. Av dette utgjorde vannuløselig kostfiber mest i samtlige prøver, men mengde vannløselig kostfiber utgjorde en større andel i prøvene som på forhånd var varmebehandlet. Ut i fra størrelsesfraksjonering med eksklusjonskromatografi (HPLC, SEC- GPC) på prøver av vannløselig kostfiber, ble det funnet at byggris hadde en større gjennomsnittlig molekylstørrelse enn brokkoli, samt at ubehandlede prøver hadde en lavere gjennomsnittlig molekylstørrelse enn varmebehandlede.
Mengden fritt sukker (glukose, fruktose og sukrose) samt glukose og maltose fra nedbrutt stivelse gjort tilgjengelig i løsning etter endt fordøyelse i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode, ble undersøkt ved hjelp av HPAEC-PAD. Det ble fra kokt byggris funnet 81 gram, fra ubehandlet byggris 69 gram, fra rå brokkoli 20 gram og fra blansjert brokkoli 13 gram. Disse verdiene er basert på pr 100 gram tørrstoff. In vitro fordøyelse med humane enzymer var den metoden som ga mest avvikende resultat i forhold til de øvrige metodene benyttet i denne undersøkelsen.
Videre så ble effekten av større partikkelstørrelser og økte prøvemengder undersøkt i forhold til mengde grovisolert kostfiber og tilgjengeliggjort sukker i simulert fordøyelse. Økt prøvemengde og økt partikkelstørrelser ga en høyere mengde vektbasert kostfiber, samtidig som mengden sukker gjort tilgjengelig i fordøyelsen ble redusert. Dette antas å skyldes ufullstendig hydrolyse av stivelse under simulert fordøyelse, som følge av for store partikkelstørrelser og/eller for stor prøvemengde.
Hvorvidt de ulike råvarene i ”Det sunne måltidet”; laks, byggris og brokkoli, påvirket hverandre under fordøyelse, ble undersøkt ved å fordøye to og to av råvarene eller alle tre sammen, i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. Resultatene viste at den benyttede metoden ikke klarte å fordøye laksen, samt at laksen ikke påvirket stivelsesomsetningen.
Blansjert brokkoli ble undersøkt nærmere med hensyn på grovkarakterisering av pektin. Et høyt innhold av uronsyre indikerte et betydelig innhold av pektin. Forestringsgraden viste seg å ligge på mellom 40 og 50 %, akkurat på grensen mellom høy-metoksyl (HM; >50 %) pektin og lav-metoksyl (LM; <50 %) pektin i kommersielle pektinpreparat
Abstract
The focus in this paper has been on dietary fibre in barley rice and broccoli, and experiments have been carried out to produce and quantify them. Four different methods of in vitro digestion have been used and compared against each other: NSP (non-starch polysaccharides)-method based on Englyst et al. 1994, enzymatic-gravimetric method (McCleary et al. 2010), in vitro enzymatic digestion for hydrolysis of starch and protein (Aura et al. 1999), and a method based on the last one, but where the commercial enzymes are replaced by human digestive enzymes aspirated from the gastric compartment and duodenal lumen from men and women volunteers (Almaas et al. 2006; Ulleberg et al. 2011).
The quantities of dietary fibre found in barley rice and broccoli varied with respect to the method; the enzymatic-gravimetric method and the Aura-method gave higher amounts compared to the NSP-method. Since the methods are based on almost the same methodology, there are no reasons why the results are different from each other. The following amounts of dietary fibre per 100 grams dry weight was found: 9-14 grams in untreated barley rice, 10-15 grams in cooked barley rice, 18-27 grams in raw broccoli and 25- 37 grams in blanched broccoli. The water-insoluble fibre accounted for most of the dietary fibre in all of the samples, but the water-soluble fibre accounted for a bigger part in the samples that were heat-treated. With size exclusion chromatography (HPLC, GPC-SEC) it was found that the water-soluble fibre form barley rice had a greater average molecular weight, compared to the water-soluble fibre from broccoli. It was also found that the untreated samples had a lower average molecular weight than the samples that were heat-treated.
The free sugars (glucose, fructose and sucrose) and glucose and maltose from hydrolyzed starch made available in solution after digestion, were examined by chromatography. It was found 81 grams form cooked barley rice, 69 grams from untreated barley rice, 20 grams from raw broccoli and 13 grams from blanched broccoli. These values are based on per 100 grams dry weight. The results from the in vitro digestion with human enzymes differed most compared to the results from the other methods used in this examination.
Furthermore, the effect of larger particle sizes and increased sample volumes was investigated relative to the amount of crude dietary fibre and sugar released in simulated digestion. Increased sample amounts and larger particle sizes resulted in a higher amount of crude dietary fibre, based on weight, simultaneously as the amount of released sugars during digestion decreased. This is probably due to incomplete starch hydrolysis during digestion, as a consequence to large particle sizes and/or large sample amounts.
Whether the different components in “Healthy meals”; salmon, barley rice and broccoli had an effect on each other during digestion, was investigated by digestion of two and two or all three of them together, according to the enzymatic-gravimetric method. The results reviled that the method was unable to digest the salmon, and that the salmon had no impact on the starch digestion.
Blanched broccoli was investigated further with respect to rough characterization of the pectin. A high content of uronic acid indicate a significant content of pectin. The degree of esterification was found to be between 40 and 50 %, right on the threshold between high- methoxyl (HM; > 50 %) and low-methoxyl (LM; <50 %) in commercial pectin.
Innholdsfortegnelse
Forord ... I Sammendrag ... III Abstract ... V Innholdsfortegnelse ... VII
1 Hensikt med oppgaven ... 1
2 Introduksjon ... 3
2.1 Innledning ... 3
2.2 Kostfiber ... 5
2.2.1 Helsepåstander... 6
2.3 Fordøyelse ... 7
2.3.1 Fordøyelse av karbohydrater ... 10
2.3.2 In vitro fordøyelsesmodeller for å simulere human fordøyelse ... 11
2.3.3 Prosessering påvirker fordøyelighet av stivelse ... 12
2.4 Bygg (Hordeum vulgare) ... 13
2.4.1 Kornet ... 13
2.4.2 Stivelse i bygg ... 14
2.4.3 Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose ... 15
2.4.4 Kostfiber ... 16
2.4.5 Prosessering av bygg ... 17
2.5 Brokkoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck) ... 18
2.5.1 Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose ... 18
2.5.2 Kostfiber ... 19
2.5.3 Varmebehandling av brokkoli ... 21
2.6 Kromatografi ... 22
2.6.1 High-performance anion-exchange chromatography med pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) ... 22
2.6.2 Gass-væske kromatografi med flammeionisasjonsdetektor (GLC-FID) ... 24
3 Materialer og metoder ... 25
3.1 Prøveopparbeidelse ... 25
3.1.1 Boil-in-bag byggris fra Møllerens ... 25
3.1.2 Byggris fra Sjåk ... 26
3.1.3 Brokkoli ... 26
3.1.4 Laks ... 27
3.2 In vitro fordøyelsesmetoder ... 27
3.2.1 Metode for måling av total NSP (non-starch polysaccharides) ... 27
3.2.2 Bestemmelse av totalt kostfiber ved enzymatisk-gravimetrisk metode ... 33
3.2.3 In vitro enzymatisk fordøyelse med kommersielle enzymer for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999) ... 37
3.2.4 In vitro fordøyelse med humane enzymer (Almaas et al. 2006) ... 38
3.3 Øvrige analysemetoder ... 41
3.3.1 Bestemmelse av totalt karbohydrat som alditolacetater med gass-væske kromatografi ... 41
3.3.2 Måling av uronsyre vha spektrofotometri (Englyst et al. 1994) ... 42
3.3.3 Undersøkelse av fritt sukker - ekstraksjon i vandig metanol ... 44
3.3.4 Separering av fiber inn i vannløselig- og uløselig del og molekylstørrelsesjekk vha. HPLC, GPC-SEC (Gel Permeation/Size Exclusion chromatography) ... 45
3.3.5 Måling av total stivelse ... 46
3.3.6 Kvantitativ og kvalitativ analyse av pektin fra brokkoli ... 47
4 Resultater ... 52
4.1 Rådata ... 52
4.1.1 Kromatogram fra HPAEC-PAD ... 52
4.1.2 Kromatogram fra GLC ... 53
4.2 Bygg og brokkoli før fordøyelse ... 54
4.2.1 Total stivelse og fritt sukker ... 54
4.2.2 Karbohydratsammensetning ... 56
4.3 Byggris og brokkoli etter in vitro fordøyelse ... 58
4.3.1 Grovisolerte kostfiberfraksjoner i byggris og brokkoli ... 58
4.3.2 Sukkersammensetning i kostfiber ... 60
4.3.3 Undersøkelse av om byggsort, mengde startmateriale og prøvepreparering gir ulikt utbytte i mengde grovioslert kostfiber ... 61
4.3.4 Undersøkelse av om ulike komponenter påvirker hverandre i mengde grovisolert kostfiber ... 64
4.3.5 Tilgjengelig sukker etter fordøyelse ... 65
4.4 Vannløselig- og uløselig kostfiber ... 68
4.4.1 Molekylstørrelsesjekk... 71
4.5 Pektin i blansjert brokkoli ... 73
4.5.1 FT-IR spekter av fraksjoner fra pektinisoleringen ... 77
5 Diskusjon ... 80
5.1 Bygg og brokkoli ... 80
5.2 Produkter etter fordøyelse – sammenligning av fordøyelsesmodeller ... 82
5.2.1 Kostfiber – ufordøyelig materiale ... 82
5.2.2 Mortet byggris og økt mengde prøvemateriale ... 85
5.2.3 Grovisolert kostfiber fra prøver bestående av flere komponenter ... 86
5.2.4 Sukker gjort tilgjengelig under in vitro fordøyelse ... 86
5.2.5 Vannløselig- og uløselig kostfiber ... 89
5.3 Kvantitativ og kvalitativ analyse av pektin i blansjert brokkoli ... 91
5.4 Videre arbeid ... 94
6 Konklusjon ... 95
7 Litteraturliste ... 96
Vedlegg 1: Utregning av en spesifikk komponent i en ukjent prøve fra HPAEC-PAD og GLC 103 Vedlegg 2: ERM-referansetabell ... 106
Vedlegg 3: Oversikt over mengde frigjort sukker og standardavvik tilhørende figur 4.12 .... 107
Vedlegg 4: Standardkurve fra molekylstørrelsesjekk med HPLC-SEC ... 108
1 Hensikt med oppgaven
- Å analysere fiberinnhold i byggris og brokkoli i henhold til konvensjonell anerkjent metodikk (Englyst et al. 1994).
- Å utvikle en metode som, i tillegg til data for kvantitativt og kvalitativt kostfiberinnhold, også gir mulighet til å isolere fraksjoner som tilfredsstiller kravene til fiber for bruk i videre forsøk.
- Å sammenligne følgende in vitro fordøyelsesmodeller opp mot hverandre:
a) NSP-analyse basert på Englyst et al. 1994
b) Enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010)
c) In vitro enzymatisk fordøyelse for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al.
1999)
d) Og en metode som er basert på sistnevnte, men hvor de kommersielle enzymene er byttet ut med humane fordøyelsesenzymer (Almaas et al. 2006; Ulleberg et al.
2011).
- Å gå nærmer inn på kostfiberstrukturen i brokkoli, spesielt med tanke på pektin, da det var gjort svært lite på dette området da arbeidet med oppgaven startet.
2 Introduksjon
2.1 Innledning
Fokuset i denne oppgaven har vært rettet mot kostfiber i rike karbohydratkilder som et helkornprodukt av bygg (byggris) og brokkoli. Det er utført eksperimenter for å framstille og å kvantifisere disse. Et hovedpoeng i forbindelse med dette har vært å bryte ned stivelse, for så å fjerne dette sammen med lavmolekylært sukker (glukose, fruktose, sukrose). I de ulike eksperimentelle oppsettene har det derfor vært benyttet amylaser for å hydrolysere stivelse, sammen med proteaser for å bryte ned protein. Metodikken for å fjerne lavmolekylære degraderingsprodukter av karbohydrat og protein (fordøyd materiale) har vært basert på enten utfelling av alkoholuløselig polymert materiale, oppsamling av uløselig restmateriale ved sentrifugering, fjerning av lavmolekylære forbindelser med dialyse, eller kombinasjoner av disse. Dette uløselige, eller ikke dialyserbare materialet, avhengig av metode, er å betrakte som ufordøyd materiale eller kostfiber. Avhengig av innfallsvinkel, kan alle disse eksperimentelle oppsettene betraktes som modeller for in vitro fordøyelse, samtidig som det isolerte eller detekterte materialet er å betrakte som kostfiber etter gjeldene definisjoner og standard metodikk for bestemmelse av kostfiber i næringsmidler.
Det har blitt brukt fire ulike in vitro metoder for enzymatisk degradering og fjerning av komponenter som representerer fordøyd materiale, med påfølgende analyse/oppsamling av kostfiber (= ufordøyd materiale). Disse har vært a) en metode hvor enzymatisk behandling er kombinert med syrehydrolyse og en kromatografibasert metode for deteksjon av de enkelte monosakkaridene (NSP-analyse basert på Englyst et al. 1994), b) en modifikasjon av en enzymatisk-gravimetrisk metode hvor det isolerte kostfibret kun er renset og registrert med vekt (McCleary et al. 2010), c) en enzymatisk metode utviklet for fordøyelse av stivelse og protein (Aura et al. 1999), og d) en variant av den siste hvor de definerte, standardiserte og kommersielt tilgjengelige enzymene er byttet ut med humane gastrointestinale (GI) enzymer som inneholder en naturlig blanding av ulike fordøyelsesenzymer (Almaas et al. 2006).
Disse fire metodene er delvis blitt sammenliknet opp mot hverandre, men hovedarbeidet har bestått i å analysere fiberinnholdet i henhold til konvensjonell anerkjent metodikk (Englyst et al. 1994) og å utvikle en metode som, i tillegg til data for kvantitativt og kvalitativt
kostfiberinnhold, også gir mulighet til å isolere fraksjoner som tilfredsstiller kravene til fiber for bruk i videre forsøk (metode b over). For å kunne gjøre disse kvantitative sammenligningene er også fiberpreparatene fra metodene b) og c) undersøkt for sukkersammensetning.
De utvalgte råvarene er, sammen med laks, hovedbestanddelene i ”Det sunne måltidet”, som er et samarbeidsprosjekt mellom Nasjonalt institutt for ernærings- og sjømatforskning (Nifes), Nofima AS og Universitetet for miljø- og biovitenskap. Prosjektets mål er å studere hvorvidt måltider basert på tradisjonelle norske råvarer kan forbygge og behandle livsstilssykdommer, med hovedfokus på overvekt og metabolsk syndrom, som har hatt en betydelig økning i antall forekomster de siste årene (Helsedirektoratet 2011).
For å klare opp i en potensiell forvirrende faktor bør det nevnes at karbohydrater kan deles inn i to hovedgrupper: sukker og lett fordøyelige karbohydrater samt komplekse og vanskelig fordøyelige karbohydrater. Den første gruppen er det man finner mye av i blant annet brus, godteri, hvitt mel, pasta, polert ris og poteter. Disse matvarene inneholder fritt sukker (glukose, fruktose, sukrose) og stivelse som hydrolyseres og tas raskt opp i kroppen, og som dermed gir en stigning i blodsukkeret. Den andre gruppen finner man i blant annet produkter som inneholder en vesentlig mengde av de ytre lagene av kornet, og i grønnsaker.
Disse består av komplekse polysakkarider og er ufordøyelige (per definisjon: kostfiber), slik at de fortsetter til tykktarmen hvor de fungerer som mat for de gode tarmbakteriene. Dette gås nærmere inn på senere. I en mellomstilling her finnes enkelte stivelsesformer som, enten på grunn av deres krystallinske struktur eller er pakket inn fysisk, eventuelt inkorporert i råvaren/ferdig produkt, er lite tilgjengelige for fordøyelsesenzymene våre.
Dette gjør dem ”langsomme” eller resistente, hvorav de siste er å betrakte som kostfiber og substrat for tarmfloraen. Et høyt innhold av fiberkomponenter, men også fett er et vesentlig bidrag til denne reduserte tilgjengeligheten (dette utdypes i 2.3.3).
2.2 Kostfiber
Definisjonen av kostfiber har variert over tid, og i 2009 kom Codex Alimentarius Commission med en ny definisjon:
”Kostfiber betyr karbohydratpolymerer, inkludert lignin, med ti eller flere monomere enheter som ikke hydrolyseres av endogene enzymer i tynntarmen hos mennesker og tilhører følgende kategorier: a) spiselige karbohydratpolymerer naturlig til stede i matvaren; b) karbohydratpolymerer som har blitt utvunnet fra råmateriale ved hjelp av fysiske, enzymatiske eller kjemiske hjelpemidler, og som har blitt vist å gi en fysiologisk gevinst i forhold til helse, demonstrert av generelt godkjente vitenskapelige bevis til kompetente myndigheter; c) syntetiske karbohydratpolymerer som har blitt vist å gi en fysiologisk gevinst i forhold til helse, vist av generelt godkjente vitenskapelige bevis til kompetente myndigheter.” (Codex Alimentarius Commission 2009; Helsedirektoratet 2011)
Kostfiber kan deles inn i to grupper; vannløselig- og uløselig kostfiber. Eksempler på vannløselig kostfiber er β-glukan (kan også være vannuløselig) og pektin, mens cellulose, hemicellulose, lignin er vannuløselige (Saladin 2010). I kontrast til stivelse og sukker fordøyes ikke kostfiber i mennesker, og gir dermed lite energi, men den er likevel en viktig komponent i kostholdet av andre grunner. Selv om disse polysakkaridene ikke brytes ned av kroppens egne enzymer vil bakteriene i tykktarmen fermentere dem og danne flere nedbrytningsprodukter, deriblant kortkjedede fettsyrer: eddiksyre, propionsyre og smørsyre (Newman & Newman 2008) som bidrer med energi til verten (mennesket). Et annet og nyere begrep på denne gruppen ufordøyelige karbohydrater som fungerer som mat for de gode bakteriene (probiotika) i tykktarmen er prebiotika.
2.2.1 Helsepåstander
Kostfiber antas å forbygge opp til flere lidelser som forbindes med metabolsk syndrom, og det jobbes i dag med å få flere til å spise mer kostfiber, da de fleste ligger under det anbefalte inntaket som er 25-35 gram per dag (Helsedirektoratet 2011).
Hovedrollen i forebyggingen av hjerte- og karsykdom blant kostfibrene går til det vannløselige kostfibret β-glukan som finnes i havre og bygg. Dette skyldes mest sannsynlig β- glukan sin effekt på viskositeten i tarminnholdet, som antas å redusere og hemme absorpsjonen av lipider og kolesterol (Wang et al. 1992), og dermed gi et lavere nivå av triglyserider i blodet (Slavin 2001). Også arabinoxylan har vist seg å danne viskøse løsninger og dermed bidra til den kolesterolreduserende effekten. Ved å gi økt viskositet i mageinnholdet får man i tillegg en forlenget fordøyelse og lengre metthet, slik at et kosthold rikt på fiber vil redusere det totale inntaket av mat og følgelig gi en lavere kroppsmasseindeks (KMI) på sikt (Helsedirektoratet 2011).
Videre så antas det at løselig kostfiber (spesielt β-glukan) binder gallen i tarmen slik at de skilles ut med avføringen, noe som resulterer i at LDL (low-density lipoprotein)-kolesterolet i kroppen brytes ned for å bidra i dannelse av ny galle (Van Horn et al. 2008). På den måten har endringer i gallesyremetabolismen i respons til β-glukan også blitt sett i sammenheng med den kolesterolreduserende effekten, og dermed også effekten av redusert risiko for hjerte- og karsykdom (Helsedirektoratet 2011; Kahlon et al. 1993).
Høyt blodsukker etter et måltid (postprandial hyperglykemi) kan bidra til økt risiko for diabetes (Helsedirektoratet 2011). Løselig kostfiber har vist seg å redusere det postprandiale blodsukkeret (Slavin 2001; Symons & Brennan 2004) slik at mengden insulin som skilles ut etter et måltid også er lavere. Dette skyldes kostfibrets lave glykemiske indeks, som vil si at det gir en svak stigning i blodsukkeret over tid, i stedet for den raske økningen som skjer ved inntak av raskt fordøyelige karbohydrater.
Disse påstandene, som både er dokumenterte og foreløpig usikre, viser at ting henger sammen i utviklingen av diverse lidelser, som til sammen kan resultere i tilstanden metabolsk syndrom.
2.3 Fordøyelse
I den humane fordøyelsesprosessen går maten gjennom en mekanisk og kjemisk oppdeling og størrelsesreduksjon, slik at kroppen lettere skal kunne absorbere og omsette næringsstoffer som er pakket inn i celler og cellevegger i maten. Munnen og magen og deres fordøyelsesvæsker har hovedansvaret for at denne oppdelingen skjer, mens tynntarmen står for det meste av absorpsjonen (Kong & Singh 2008).
Figur 2.1: Oversiktsbilde over fordøyelsessystemet. Det nederste bildet viser hvordan lever og galleblære er i kontakt med duodenum (ADAM). Gallen skilles ut av leveren og oppbevares i galleblæren.
Figur 2.2: Oversiktsbilde av tynntarm og tykktarm. Den første delen av tynntarmen kalles doudenum, andre og midterste del er jejunum, mens den siste delen kalles ileum. Fra ileum beveger kymus seg over i tykktarmen (ADAM).
Munn
Fordøyelsen starter i det man inntar maten, med mekanisk og kjemisk oppdeling ved hjelp av henholdsvis tygging og utskillelse av spytt. Spytt inneholder slim og enzymene α-amylase og lingual lipase. Amylasen starter nedbrytningen av stivelse allerede i denne prosessen (Hoebler et al. 2002), mens den linguale lipasen ikke aktiveres før den når magens sure miljø (pH > 2), samtidig som amylasen inaktiveres (Saladin 2010). Når maten forlater munnen fraktes den ned i magen via spiserøret ved hjelp av peristaltiske sammentrekninger som dytter maten nedover (Siddiqui et al. 1991).
Mage
Magen er delt inn i fire regioner; fundus, korpus (kropp), antrum og pylorus, og hovedfunksjonene er oppbevaring, miksing og tømming av mat, samt noe fordøyelse. De fire områdene i magen har hver sine ansvarsområder, med korpus og fundus som reservoar for ufordøyd mat og ansvarlig for tømming av væske, mens antrum tar seg av blanding og siling av mat, og fungerer som en pumpe for magetømming av fast materiale (Urbain et al. 1989).
Lagringskapasiteten til magen oppnås ved at den kan utvide seg, slik at den maksimalt kan romme et innhold på rundt fire liter hos en voksen person (Kong & Singh 2008; Saladin 2010), mens utskillelse av magesaft og peristatiske sammentrekninger gjør at innholdet kan blandes og homogeniseres. Magesaften som skilles ut fra kjertler i magen inneholder i hovedsak saltsyre (HCl), gallesalter og fordøyelsesenzymer, i hovedsak gastrisk lipase og pepsin (Kong & Singh 2008; Saladin 2010). pH i tom mage varierer fra 1,3 til 2,25 i friske mennesker, mens inntak av mat vil øke pH til mellom 4,5 og 5,8 grunnet bufferkapasitet i matvarene, men dette avhenger av komponentene i måltidet (Dressman et al. 2007).
Saltsyren aktiverer enzymene pepsin og lingual lipase, bryter opp bindevev og cellevegger fra plantemateriale, dreper patogene bakterier og konverterer treverdig jern (Fe3+) til toverdig jern (Fe2+), som absorberes i tynntarmen og brukes i syntesen av hemoglobin (Saladin 2010).
Pepsinets hovedoppgave er å bryte ned proteiner fra maten til kortere peptidkjeder, som så sendes videre til tynntarmen hvor fordøyelsen fullføres. I tillegg til disse enzymene skilles det også ut gastrisk lipase, som sammen lingual lipase fra spyttet, fordøyer 10-15 % av fettet i maten. Resten av fettfordøyelsen skjer i tynntarmen (Saladin 2010).
Når magen, ved hjelp av peristaltiske bevegelser, presser maten mot pylorus som er lukkemuskelen mellom mage og tarm, vil den trekke seg sammen for å redusere magetømmingen slik at mageinnholdet bearbeides ytterligere. Magen vil etter hvert gjøre om innholdet til en delvis fordøyd flerfaset blanding kalt kymus, som er en kombinasjon av separate faser av fett, vandige løsninger og fast materiale. Kymus som får passere fra magen og over i tynntarmen (duodenum) har en partikkelstørrelse på maksimalt én til to millimeter
Figur 2.3: Magesekkens fire regioner (Kong & Singh 2008)
(Thomas 2006), og rundt tre milliliter overføres av gangen (Saladin 2010). På den måten rekker tarmen å nøytralisere magesyren og fordøye litt og litt. Hvor lenge maten oppholder seg i magen avhenger av energiinnholdet i måltidet: kymus med en kaloritetthet på 1 kilokalori (kcal) per milliliter (mL) tømmes fra magen med en hastighet på cirka 2 til 2,5 mL per minutt, mens kymus på 0,2 kcal/mL tømmes med en hastighet på cirka 10 mL per minutt (Dressman et al. 1998).
Tarm
De videre trinnene i fordøyelsen og absorpsjon av næringsstoffer skjer i tynntarmen, hovedsakelig i duodenum og jejunum (figur 2.2), hvor kymus blandes med gallesalter og saft fra bykspyttkjertel og lever. Bukspyttkjertelen skiller ut bukspytt som er en basisk blanding av enzymer, zymogener (inaktive forløpere til fordøyelsesenzymer), enzyminhibitorer, natrium bikarbonat, etc. Natrium bikarbonat er en svak base som nøytraliserer magesyren (Saladin 2010). Enzymene fra bukspyttkjertelen er blant annet pankreatisk α-amylase som fordøyer stivelse; trypsin og chymotrypsin som fordøyer protein; pankreatisk lipase som fordøyer fett; karboksypeptidase som hydrolyserer aminosyren på karboksylenden (-COOH) i små peptider; og ribonuklease og deoksyribonuklease som fordøyer henholdsvis RNA og DNA (Saladin 2010). For at lipase skal aktiveres er den avhengig av kalsium og gallesalter (Boisen & Eggum 1991). Det finnes også enzymer som er spesifikke for fordøyelse av oligosakkarider og disakkarider i tynntarmes børstesøm, disse gås nærmere inn på i 2.3.1.
Når næringsstoffene har blitt absorbert gjennom veggene i tynntarmen sendes kymus videre til tykktarmen (Kong & Singh 2008) hvor blant annet ufordøyelige karbohydrater fermenteres av tarmbakteriene.
2.3.1 Fordøyelse av karbohydrater
Stivelse brytes først ned til oligosakkarider som er opp til åtte glukoseenheter lange, deretter til disakkaridet maltose og trisakkaridet maltotriose (Gray 1992), og til slutt til monosakkaridet glukose som absorberes i tynntarmen. Prosessen starter, som nevnt tidligere, allerede i munnen hvor α-amylase fra spyttet hydrolyserer stivelse til oligosakkarider. Amylasen har en optimal virkning ved pH 6,8 til 7, slik det er i munnen
(Saladin 2010). Enzymet inaktiveres raskt av syren i magen, men kan fortsette fordøyelsen i én til to timer etter den har ankommet magesekken, avhengig av sammensetningen av måltidet. Dette skjer fordi den ”gjemmer” seg inne i maten og på den måten unnslipper syren (Saladin 2010). Amylasen virker derfor lengre dersom måltidet er større eller fetere, spesielt i fundus hvor magebevegelsene er svakest og maten brytes ned sakte. Når pH i vellingen nærmer seg 4,5 vil amylasen inaktiveres og brytes ned av pepsin, sammen med proteiner fra maten. (Saladin 2010)
Fordøyelse av stivelse fortsetter i duodenum, når kymus blandes med amylase fra bukspyttkjertelen. Stivelsen blir da brutt ned til oligosakkarider og maltose innen kort tid (Saladin 2010). Fordøyelsen er komplett når kymus kommer i kontakt med børstesømmen på epitelcellene. To av enzymene som befinner seg i børstesømmen; dekstrinase og glukoamylase, hydrolyserer oligosakkarider som er tre eller flere residuer lange. Det tredje enzymet, maltase, hydrolyserer maltose til glukose (Saladin 2010). Maltose er til stede i noe mat, men disakkaridene det finnes mest av er sukrose (rørsukker) og laktose (melkesukker), som fordøyes av henholdsvis sukrase og laktase i børstesømmen. Resultatet er monosakkaridene glukose og fruktose fra sukrose, og glukose og galaktose fra laktose, som absorberes raskt (Saladin 2010). Personer som lider av laktoseintoleranse mangler helt eller delvis enzymet laktase slik at de har problemer med å fordøye laktose.
2.3.2 In vitro fordøyelsesmodeller for å simulere human fordøyelse
For å forstå hva som skjer under fordøyelse av karbohydrater har det blitt utviklet en rekke in vitro fordøyelsesmodeller. Generelt utgjør simulering av fordøyelsen tre trinn: munn, mage og tarm, under tilnærmede fysiologiske forhold. Men hvordan de fysiologiske forholdene oppnås varierer mellom de ulike modellene. Eksempler på slike variasjoner er hvor finmalt det som skal fordøyes er ved start, hvor lenge de ulike prosessene varer (for eksempel tid i magen), valg av stivelsesspaltende enzym, temperaturer, pH, og andre faktorer. Slike forskjeller, spesielt trinnene som etterligner tygging, kan ha signifikant påvirkning på den relative beregningen av glykemisk potensial for en gitt matvare rik på karbohydrater (Woolnough et al. 2008). Men uansett hvor mye forskning som gjøres på området vil en in vitro modell sannsynligvis aldri kunne måle seg med det som faktisk skjer in
vivo, til det er det for store fysiologiske utfordringer, og for store ulikheter mellom hvert individ.
På grunn av dette bør man ha et kritisk syn på refererte in vitro fordøyelsesmodeller i litteraturen, med hensyn på sammenligning av resultater fra de ulike modeller. Av de metodene som benyttes i denne oppgaven er NSP-metoden (Englyst et al. 1994) og enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010) standardisert i forhold til analyse av kostfiber; det er ikke modellen til Aura (Aura et al. 1999), verken med kommersielle eller humane enzymer fra mennesker. Selv om de to førstnevnte er standardisert for kvantifisering av kostfiber, er det vesentlige ulikheter mellom dem; enzymatisk gravimetrisk metode inkluderer både NSP, lignin og noe resistent stivelse i det grovisolerte kostfibret, mens NSP-metoden kun detekterer NSP (Anderson 1990), som kvantifiseres indirekte via mengde monosakkarider i prøvematerialet.
2.3.3 Prosessering påvirker fordøyelighet av stivelse
Først er det viktig å påpeke at ikke all stivelse nødvendigvis er fordøyelig stivelse, og man kan dele stivelsen inn i tre grupper; raskt fordøyelig stivelse, sent fordøyelig stivelse og resistent stivelse. Resistent stivelse fordøyes ikke i tynntarmen hos friske mennesker, og den gir derfor heller ingen økning i blodsukkeret. Den fortsetter til tykktarmen hvor den fermenteres av mikroorganismene og fungerer derfor som kostfiber (BeMiller 2007).
Faktorer som påvirker fordøyeligheten av stivelse er blant annet grad av gelatinisering, størrelse på granulene, amyloseinnhold, stivelse-protein interaksjoner, stivelse-lipid komplekser, og grad av krystallisering, inkludert det som dannes av retrogradring under prosessering (BeMiller 2007). Varme øker biotilgjengeligheten av stivelse ved å splitte stivelsesgranulene og gjøre stivelsen mer tilgjengelig for amylasen, slik at nylig varmebehandlet stivelse vil være lett fordøyelig (Brand et al. 1985). Men dersom en matvare inneholdende stivelse varmebehandles for så å bli avkjølt, vil stivelsen omdannes til resistent stivelse som et resultat av krystallisering og retrogradering av amylose og amylopektin, og dermed ikke være mulig å fordøye (BeMiller 2007). Dette er årsaken til at tilhengere av den såkalte lavkarbo-dietten kan spise kokt og avkjølt potet med god samvittighet.
2.4 Bygg (Hordeum vulgare)
Foredlet bygg (Hordeum vulgare) tilhører familien Poaceae (gressfamilien), stammen Triticeae og slekten Hordeum. Det er uklarheter angående hvor planten stammer fra, men flere mener at H. vulgare har blitt utviklet gjennom mutasjoner av Hordeum spontaneum, som fortsatt er å finne i deler av Asia og nordlige deler i Afrika (Harlan & Zohary 1966;
Zohary & Hopf 1988).
2.4.1 Kornet
Byggkornet (figur 2.4) består av inneragne, forblad, selve kornet og hovedakset. Inneragne og forblad utgjør skallet i et modent byggkorn. Cellulose, lignin og silisium (silica) er hovedkomponentene i cellene i inneragne og forbladene, som dør når kornet er modent.
Skallet omslutter kornet slik at de adherer til overflaten hos genotyper med skall, mens hos avskallede genotyper vil ikke dette skje. (Harlan 1920).
Endospermen utgjør den største delen av kornet, og består av aleuronen, subaleuronen og den stivelsesrike endospermen. Aleuronlaget er et proteinrikt lag av celler som ligger rett under nucellus og frøskallet, og strukturen i de tykke celleveggene i aleuronen holdes oppe av polysakkaridene arabinoxylan og β-glukan.
Skallet utgjør om lag 13 % av kornet, mens den stivelsesrike endospermen utgjør klart mest;
cirka 76 % (Kent & Evers 1994). Det er i de ytre lagene man finner det som kalles kli og kim, og det er her det meste av kostfibret, vitaminer og mineraler befinner seg.
Figur 2.4: Tverrsnittet av et byggkorn (Newman & Newman 2008)
2.4.2 Stivelse i bygg
Den største komponenten i gruppen karbohydrater er stivelse, som anses å være et løselig polysakkarid og hovedkilden til energi i bygg, både til en konsument og til vekst av en ny plante etter spiring. Stivelse er også den komponenten i bygg som varierer mest i mengdeinnhold; 45 % i korn med lite innhold og opp til 65 % i dem med mye, anhengig av miljømessige vekstbetingelser og fyllingsgraden av endospermen. Stivelsen lagres kun i endospermen i et modent korn, men fordeles ujevnt. Sentralt lokaliserte endospermceller inneholder høyere nivåer stivelse enn celler i subaleuronen, som ofte inneholder mer protein (Newman & Newman 2008).
Stivelse i bygg er satt sammen av to polymerer; amylopektin og amylose. Amylopektin er et forgrenet polysakkarid hvor -(1,4)-D-glukose enheter er forgrenet via -(1,6)-D-glukose bindinger, mens amylose er hovedsakelig en rett kjede av -(1,4)-D-glukose enheter. Selv om amylose anses som en lineær komponent i stivelse, finnes det forgreninger også i dette molekylet (MacGregor & Fincher 1993). Sidekjedene i amylosen fra bygg har ikke blitt fullstendig karakterisert, men de kan variere i størrelse; alt fra fire til hundre glukoseenheter
(Takeda et al. 1984). Amylopektinet i bygg er et stort molekyl (Banks et al. 1972), men til tross for dette har den en relativt lav viskositet i løsninger sammenlignet med amylose, dette skyldes blant annet forgreningene som øker løseligheten. Amylosemolekylene er mindre enn amylopektinmolekylene, og befinner seg i en heliksstruktur. (MacGregor & Fincher 1993).
I de fleste byggtyper utgjør amylopektin 72 til 78 % av stivelsen, mens amylose utgjør de resterende 22 til 28 %. Selv om bygg ofte inneholder amylopektin og amylose i en ratio på 3:1, inneholder visse varieteter stivelse som består av 95 til 100 % amylopektin, og det finnes minst tre sorter som inneholder 40 til 70 % amylose av det totale stivelsesinnholdet.
Betegnelsen ”waxy” gis til byggsorter som inneholder mye amylopektin, og ”ikke-waxy” bygg vil si dem med en normal ratio på 3:1 av amylopektin og amylose. ”Waxy” bygg inneholder 5 til 8 % mindre total stivelse enn normal ”ikke-waxy” bygg (Ullrich et al. 1986; Xue et al.
1997). Men reduserte nivå av stivlese er ofte forbundet med små økninger i enkle sukker som fruktose, glukose og sukrose, samt fiberkomponenten -glukan (Xue et al. 1997). Bygg som inneholder mer amylose enn normalt (40 til 70 % av totalt) i stivelsen klassifiseres som høy-amylose sorter.
2.4.3 Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose
Lave nivåer av enkle sukker og oligosakkarider (små polymerer) er funnet i byggkornet i tillegg til stivelseskomponenter (Henry 1988). Dette er sukker som absorberes direkte av kroppen under fordøyelse. Monosakkaridene glukose og fruktose er de enkleste karbohydratene, og forekommer i veldig små mengder (<0,2 %), i hovedsak i den modne endospermen. Små mengder av disakkaridet maltose (0,1 til 0,2 %) kan noen ganger finnes i endospermvev nær embryo, mens disakkaridet sukrose, som er en komponent i syntesen av stivelse, representerer 50 % av enkle sukker funnet i byggkorn (Newman & Newman 2008).
Nivåene av sukrose varierer fra 0,74 til 0,84 %, med 80 % av dette lokalisert i embryo (MacGregor & Fincher 1993). Videre så har det blitt funnet nivåer av trisakkaridet raffinose på mellom 0,3 og 0,8 %, også dette er hovedsakelig lokalisert i embryo (Mac Leod 1957).
2.4.4 Kostfiber
Ikke-stivelses polysakkarider, eller non-starch polysaccharides (NSP), i byggkornet er strukturelle komponenter i celleveggene i skall-, aleuron- og endospermvev. NSP utgjør en stor del av kostfibret, men ikke alt. For eksempel så inkluderes ikke det vannuløselige kostfibret lignin og resistent stivelse i NSP (Anderson 1990).
Den største andelen ikke-stivelses polysakkarider i bygg utgjøres av -glukaner, arabinoxylaner og cellulose (Newman & Newman 2008).
Cellulose er en langkjedet polymer av -(1,4) bundet glukoseenheter hovedsakelig funnet i skallet, nært relatert til lignin (Mac Leod 1959), men små mengder er også lokalisert i aleuron og stivelsesrik endosperm (Fincher & Stone 1986). Cellulosen utgjør omtrent 40 % av skallets tørrvekt. I tillegg til å være uløselig i vandige løsninger er cellulosemolekyler relativt lite fleksible på grunn av hydrogenbindinger til nærliggende glukosylenheter (Gardner &
Blackwel.J 1974). Cellulosenivåene varierer fra 4,1 til 4,8 % i skallet bygg og 2,0 til 2,9 % i avskallet bygg (Xue et al. 1997).
Arabinoxylan og -glukaner er komponenter i celleveggstrukturen i både aleuron- og stivelsesrikt endospermvev, men varierer omvendt i deres ratio i disse to vevene.
Arabinoxylan utgjør 70-80 % av celleveggene i aleuronen, mens -glukan utgjør rundt 26 %. I de stivelsesrike celleveggene i endospermen utgjør derimot arabinoxylan 20-25 % og - glukan rundt 70 % (Duffus & Cochrane 1993).
Arabinoxylan i bygg er fra en polysakkaridfamilie hvor det finnes variasjoner i molekylstørrelse, sammensetning, struktur og løselighet (Vietor et al. 1992), følgelig er arabinoxylan både vannløselig- og uløselig (Virkki et al. 2005). Disse polysakkaridene, som prinsipielt sett er satt sammen av arabinose og xylose, har hovedsakelig blitt funnet i aleuron- og endospermcellevegger, men forkommer også i skallet (Aspinall & Ross 1963).
Arabinoxylanene varierer svært mye i deres forhold mellom xylose og arabinose. I skallet har raten vist seg å være rundt 1:9 (Aspinall & Ferrier 1957), men det har også blitt rapportert om en rate på 1:3 i stivelsesrik endosperm- eller aleuronvev (MacGregor & Fincher 1993).
Raten varierer med hensyn på genotype og miljømessige årsaker (Henry 1986).
Av alle komponentene som utgjør det totale kostfibret i bygg, er β-glukanenen antakeligvis den viktigste med tanke på helseeffekter. β-glukan består av tunge lineære kjeder av β- glukosylenheter polymerisert både via β-(1,3)- og β-(1,4)-bindingene. β-glukaner i bygg tilhører en familie polysakkarider som er heterogene i forhold til molekylstørrelse, løselighet og molekylstruktur (MacGregor & Fincher 1993). I motsetning til cellulose, er β-glukanene delvis vannløselige, en egenskap som har sammenheng med de spredte β-(1,3)-bindingene, som gir et molekyl med ganske ulik romlig arrangering sammenlignet med kun β-(1,4)- bindinger.
β-glukannivåene i bygg modifiseres ofte av miljøet, spesielt varme og tørke under modningen av frøet gir som regel økte nivåer β-glukan (Anderson et al. 1978; Bendelow 1975). Men den genetiske bakgrunnen er den viktigste faktoren for det endelige β- glukaninnholdet i kornet. Nivåene av β-glukan varierer fra 2,0 til 11 %, men at det ligger vanligvis mellom 4,0 og 7,0 % (MacGregor & Fincher 1993).
2.4.5 Prosessering av bygg
Avskalling og sliping er prosesser hvor det ytre laget av kornet gradvis fjernes for å lage et spiselig produkt. Skallet representerer 10 til 13 % av tørrvekten til et korn, men under noen forhold kan avskalling i en kommersiell avskallings- eller slipemaskin fjerne så mye som 20 % av kornets tørrvekt (Newman & Newman 2008).
Sliping, som vanligvis skjer etter avskalling, utføres oftest i tre eller flere trinn. Det siste trinnet kalles ofte for polering. Graden av sliping, oftest med prosentbenevning, refererer til mengden av kornet som fjernes under prosessen.
Det har blitt funnet at nivåene av løselig kostfiber øker i fraksjonene opp til rundt 30 % sliping, mens over dette stabiliserer verdiene seg. Stivelsesnivåene vil derimot fortsette å stige opp mot 80 % sliping (Knudsen & Eggum 1984), ettersom stivelsen i hovedsak befinner seg i aleuronen. Sammenligning av sliping av ”non-waxy” og ”waxy” avskallet bygg viser at β- glukannivåene i slipte korn av ”non-waxy” bygg øker opp til rundt 25 % sliping, etterfulgt av gradvis reduksjon desto mer som slipes av kornet. Disse observasjonene kan antyde at
konsentrasjonene av β-glukan er høyest i aleuron, subaleuron og i ytre deler av stivelsesrik endosperm i ”non-waxy” bygg.
I motsetning til dette, indikerte en gradvis økning av β-glukan i de slipte kornene i ”waxy”
bygg en positiv konsentrasjonsgradient av disse komponentene mot midten av kornet.
2.5 Brokkoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck)
Brokkoli er en svært gammel kulturplante som ble dyrket av grekerne og romerne allerede for over 2000 år siden. Den tilhører korsblomstfamilien og slekten Brassica, sammen med blant annet blomkål, som den er en nær slektning av. Brokkolien har lenge vært en viktig matplante, og rundt år 1925 kom den til Amerika med italienske emigranter. Det skulle derimot ta nesten 20 år før den kom til Norge; rett før andre verdenskrig brøt ut i landet begynte de første forsøkene med grønnsaken (Balvoll 1976). I dag spiser nordmenn norsk brokkoli store deler av sommeren, mens i vintermånedene er det for kaldt for vellykkede avlinger slik at mesteparten da importeres.
Brokkolien er som sagt en nær slektning av blomkålen, og likhetstrekkene mellom dem utseendemessig er derfor også relativt store. Det som ved første øyekast skiller de to grønnsakene fra hverandre er fargeforskjellene. Dette skyldes brokkoliens grønne klorofyllrike hode, som har blomsterknopper på alle forgreninger. Forgreiningene er tykke og sprø blomsterstilker som strekker seg oppover slik at hodet løser seg opp, det er dette som er det matnyttige produktet. Brokkolien som dyrkes i Norge er en ettårig plante (Balvoll 1976) slik at opplagsnæring i form av stivelse ikke er nødvendig for den.
2.5.1 Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose
Type og konsentrasjon av fritt sukker påvirker smaken i ulike sorter fra slekten Brassica (Rosa et al. 2001). Av løselige sukker er fruktose, glukose og sukrose de det finnes mest av i Brassica (King & Morris 1994), hvorav fruktose utgjør mellom 48,8 % og 56,9 % av det totale sukkerinnholdet i brokkoli. Glukose kommer på andre plass (29,6 – 35,5 %), mens sukrose utgjør et maksimum på 20,5 % (Rosa et al. 2001).
Det har blitt vist at disse nivåene varierer i forhold til når på året brokkolien er dyrket; det generelle innholdet av frie sukker har vist seg å være høyere i brokkoli som er dyrket vår/sommer (mars-juli), som er det som er aktuelt her i Norge, enn sommer/vinter (august- januar). Om det er første- eller annengangsblomstring har også betydning, da den første blomsten har vist seg å ha et lavere innhold av fritt sukker enn den andre, med unntak av sukrose.
2.5.2 Kostfiber
Ettersom det ikke er gjort like mye forskning på brokkoli i forhold til dens karbohydratinnhold som det er gjort på korn, vil det i dette avsnittet tas utgangspunkt i hvit kål (Brassica oleracea var. capitata), hvor det derimot finnes en del data.
Hvit kål er et medlem i slekten Brassica som det er gjort mange studier på i forhold til karbohydrater og kostfiber. Karbohydratene utgjør hovedkomponenten i hvit kål, og utgjør hele 90 % av tørrvekten, hvorav cirka én tredjedel er kostfiber og to tredjedeler er lavmolekylære karbohydrater (Wennberg et al. 2006).
Det gjennomsnittlige nivået totalt kostfiber ligger på 241 gram per kilogram tørrstoff, hvorav 26 % av dette er løselig. Hovedkomponentene i det løselige kostfibret er uronsyre (56-65 %), arabinose (15-25 %) og galaktose (12 %). Hovedkomponentene i det uløselige kostfibret er derimot glukose (45-56 %), men også her finnes det vesentlige mengder uronsyre (17-26 %), arabinose (6-11 %) og galaktose (6-8 %) (Wennberg et al. 2002).
Store deler av celleveggene i frukt og grønnsaker består av de vannuløselige kostfiberkomponentene cellulose og hemicellulose, det løselig kostfibret pektin, samt vann, små mengder strukturelle glykoproteiner, fenolestere, mineraler og enzymer. Generelt sett så består den polymere sammensetningen av primærcellevegger i tofrøbladede planter av om lag 35 % pektin, 30 % cellulose, 30 % hemicellulose og 5 % protein, men dette varierer.
Under modning, prosessering og lagring skjer det strukturelle endringer i polysakkaridene i celleveggene, mest i pektinene, men også til en viss grad i hemicellulose og materiale bygd
opp av cellulose. Disse endringene er relatert til modifikasjoner i funksjonelle egenskaper (tekstur, reologi) (Sila et al. 2009)
Pektin
Pektinet spiller en viktig rolle i dannelsen av høyere plantecellevegger, som gir styrke og støtte til planten, men som samtidig er svært dynamiske strukturer. Pektin påvirker også ulike celleveggstrukturer, som blant annet porøsitet, overflateladning, pH, og ionebalanse, og er derfor viktig for ionetransporten i celleveggene (Voragen et al. 2009). Den tredje store rollen til pektin i planten er at de bidrar i aktiveringen av plantens forsvarsrespons (Nothnagel et al. 1983).
Pektin er en familie av kovalent bundet svært komplekse polysakkarider i plantecellevegger (Albersheim et al. 1996). Galakturonsyre (GalA) er det sukkeret det finnes mest av, og det utgjør cirka 70 % av pektinet (Mohnen 2008). Gruppen inkluderer blant annet homogalakturonan (HG), rhamnogalakturonanene I (RG-I) og II (RG-II), galaktaner, arabinaner og andre polysakkarider (Cosgrove 2005).
Det vanligste pektin polysakkaridet er HG. Det er en lineær homopolymer bestående av α- (1,4)-koblede GalA-enheter, og det utgjør cirka 60 % av den totale pektinmengden (Mohnen 2008). Det har blitt observert at HG ofte er satt sammen av rundt 100 GalA-enheter (Thibault et al. 1993), men også kortere områder har blitt detektert mellom andre pektin- polysakkarider (Nakamura et al. 2002).
Karboksylgruppene på karbon fem (Gnanasambandam & Proctor 2000) eller seks (Voragen et al. 2009) i GalA, kan til en viss grad metylesterifiseres med metanol, som vil si dannelse av metylestere (-COOCH3). I forhold til grad av metylering (også kalt esterifisering), kan pektin deles inn i to undergrupper: pektin med over 50 % esterifiseing kalles høy-metoksyl pektiner (HM pektiner), mens de med mindre enn 50 % esterifisering kalles lav-metoksyl pektiner (LM pektiner). De gjenværende karboksylgruppene som ikke er esterifisert, er til stede i form av frie syrer (-COOH) eller som salt (-COO-Na+) (BeMiller 2007). Graden og mønsteret av metyleringen av karboksylgruppene er sterkt relatert til pektinets funksjonalitet (Gnanasambandam & Proctor 2000; Houben et al. 2011).
Hovedkjeden til RG-I er satt sammen av repeterte enheter av galakturonsyre og rhamnose:
[α-D-(1,4)-GalpA-α-L-(1,2)-Rhap]. Rha-enhetene i RG-I kan få galaktosyl- og/eller arabinosyl- inneholdende sidekjeder av nøytrale sukker på det fjerde oksygenet (Cosgrove 2005;
Westereng et al. 2008).
RG-II er det mest strukturelt komplekse pektinet, og har lik hovedkjede som HG; α-D-(1,4)- bundede GalA-enheter som inneholder samlinger av fire ulike hetero-oligomere sidekjeder (Voragen et al. 2009). RG-II utgjør omtrent 10 % av det totale pektinet (O'Neill et al. 2004).
Til slutt er det xylogalakturonan (XGA) som er et pektin polysakkarid bestående av en hovedkjede av GalA, lik som HG, med monomere og korte oligomere β-D-Xyl sidekjeder på det tredje oksygenet (Ralet et al. 2009).
Cellulose og hemicellulose
Hemicellulose er en gruppe komplekse polysakkarider med enheter satt sammen av β-D-(1- 4)-glykaner som ligner cellulose. De binder seg til overflaten på cellulose slik at de kun kan ekstraheres fra plantecellevegger ved bruk av en strek alkali (Cosgrove 2005).
Hemicellulosene består av xyloglukan, xylaner (inkludert glukuronoxylan, arabinoxylan og glukuronoarabinoxylan), og mannaner (inkludert glukomannan, galaktomannan og galaktoglukomannan) (Cosgrove 2005). I kontrast til pektin skjer det minimale strukturelle endringer i cellulose og hemicellulose ved oppvarming av plantebaserte matvarer (Sila et al.
2008).
2.5.3 Varmebehandling av brokkoli
Varmebehandling av frukt og grønnsaker er kjent for å øke vannbindingsevnen og gjøre dem mykere. En viktig årsak til økt mykhet er delvis som følge av løseliggjøring og depolymerisering av pektinpolymerer som er involvert i adhesjonen mellom cellene (Greve et al. 1994; Vanburen 1979; Waldron et al. 1997).
Kjemisk depolymerisering av pektinet under varmebehandlingen skjer på grunn av - eleminering og/eller syrehydrolyse, avhengig av graden av metylering og pH; pektin med en
høy grad av metylering er mer utsatt for -eliminering enn pektin med lav grad av metylering (Fraeye et al. 2007; Krall & McFeeters 1998; Sajjaanantakul et al. 1989).
Blansjering kan påvirke den fysiokjemiske strukturen til kostfibret, for eksempel slik at forholdet mellom løselig og uløselig fiber endres, eller viskositeten og den molekylære vekten. Varmebehandling har vist seg å kunne løse opp og degradere uløselig fiber til mindre fragmenter slik at de kan forsvinne ut i kokevannet (Nilsson et al. 2006; Svanberg et al.
1997). Disse endringene kan være et resultat av hydrolyse av glykosidbindinger inne i polysakkaridene eller brudd i hydrogenbindinger mellom polymerene i kostfibret (Krall &
McFeeters 1998; Selvendran & Robertson 1994). Varmebehandling i vann vil også gi tap av lavmolekylære komponenter som mineraler, vitaminer og sukker fra plantecellene og ut i vannet, slik at det blir en relativ økning av andre substanser i brokkolien, som for eksempel kostfiber (Wennberg et al. 2006).
2.6 Kromatografi
Separering og kvantifisering av monosakkarider har i denne oppgaven vært et svært viktig verktøy. For å kunne gjøre det har det i hovedsak blitt brukt to ulike metoder; høytrykks væskekromatografi med puls-amperometrisk deteksjon (HPAEC-PAD) og gass-væske kromatografi med flammeionisasjonsdetektor (GLC-FID).
Begge metodene gir kvalitative og kvantitative analyser av karbohydratsammensetningen i en løsning, men HPAEC-PAD fortekkes i hovedsak ved analyse av enkle monosakkaridsammensetninger og ved analyse av oligosakkarider. GLC-FID brukes derimot til analyse av komplekse løsninger av monosakkarider. Det vil her bli gitt en overfladisk innføring i begge instrumentene, men det gås ikke i detalj.
2.6.1 High-performance anion-exchange chromatography med pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD)
På norsk kan dette oversettes til høytrykks ionebytterkromatografi med puls-amperometrisk deteksjon. Instrument egner seg godt til bestemmelse av polymeriseringsgrad og kvantifisering av mono- og disakkarider. Det er en kromatografisk metode som brukes for
separering av komponenter i løsning, og som blir hyppig brukt i biokjemi og analytisk kjemi for identifisering, rensing og kvantifisering av et stort antall komponenter, som for eksempel sukkerarter næringsmidler. Puls-amperometrisk deteksjon (PAD) brukes sammen med anionbytter-kromatografi, da kombinasjonen av disse gir en sensitiv og selektiv deteksjon av komplekse karbohydratløsninger (Poole 2003).
Det finnes to ulike typer ionebyttere; anionbytter og kationbytter. Anionbytter, som har blitt benyttet her, har et kovalent bundet kation og vice versa (Greibrokk et al. 1994). Analytten i en anionbytter er et anion med forskjellig affinitet til kationet, som dermed påvirker retensjonstiden, som er tiden det tar før molekylene har passert kolonnen. Anionbytteren er følgelig ansvarlig for separasjonen av molekylene. Retensjonstiden avhenger av størrelsen på molekylene samt av hvor sterk tiltrekningskraften er mellom kolonnen og molekylene, og den er svært sentral i identifiseringen av de ulike molekylene (Greibrokk et al. 1994). Det er på forhånd laget en standardkurve for mono- og disakkarid som ønskes å detekteres, hvor retensjonstiden til hvert sukker er bestemt. Når det kjøres prøver med et ukjent innhold av sukker identifiseres de i forhold til retensjonstiden, som er karakteristisk hvert sukker.
Bestemmelse av konsentrasjonen av hvert mono- og disakkarid gjøres ved å sammenligne topparealene i prøven, mot topparelene i standardkurven. En vanlig internstandard er trehalose, som ikke forekommer naturlig i verken bygg eller brokkoli. Trehalosen kommer ut tidlig i kromatogrammet, og interfererer ikke med noen av analyttene. Ved hjelp av forholdet mellom arealet til internstandardtoppen i prøven og arealet av internstandardtoppen standardkurven, vil man kunne regne ut den nøyaktige konsentrasjonen til det ukjente sukkeret (Greibrokk et al. 1994). Konsentrasjonen av internstandard og prøve må også være kjent.
Hovedårsaken til at den benyttes internstandard er for å korrigere for varierende detektorrespons. Andre viktige årsaker er for å korrigere for tap av prøvemateriale (dette er spesielt viktig i GLC, hvor prøvene er svært flyktige), for å korrigere for endringer i injisert volum, og for at det ikke skal være nødvendig å kjøre eksterne standarder for kalibrering før hver analyse (Greibrokk et al. 1994).
2.6.2 Gass-væske kromatografi med flammeionisasjonsdetektor (GLC-FID)
Analyse ved hjelp av gass-væske kromatografi gjøres for å undersøke monosakkarider i et prøvematerialet. I denne oppgaven ble metoden brukt i forbindelse med NSP-analyse og analyse av alditolacetater. Ettersom de karbonbaserte alditolacetatene er svært flyktige er GLC en egnet metode, sammen med FID, som detekterer organiske materialer.
Gass-væske kromatografi vil si at den mobile fasen i systemet består av en gass, mens den stasjonære fasen er en ikke-flyktig væske (Greibrokk et al. 1994). Ved denne typen analyse vil stoffene i analysematerialet vandre gjennom kolonnen med en hastighet som bestemmes av løselighet i stasjonære fase, flyktighet og temperatur. Desto høyere temperaturen er, desto kortere er retensjonstiden gjennom kolonnen, men samtidig kan separasjonen av stoffene bli dårlig dersom temperaturen er for høy (Greibrokk et al. 1994).
Også her brukes det en internstandard og standardkurve for å beregne ukjente mengder av ukjente komponenter i prøvene. Standardkurven settes opp etter analyse av løsninger med kjent vektforhold mellom prøve og internstandard, hvor forholdet mellom topparealene plottes mot vektforholdet (Greibrokk et al. 1994) på samme måte som beskrevet i avsnittet om HPAEC-PAD.
3 Materialer og metoder
I denne oppgaven har fokusert vært rettet mot fordøyelse av blansjert og rå brokkoli, samt kokt og ubehandlet Møllerens boil-in-bag byggris. Laks ble kun brukt i interaksjonsforsøkene og Sjåk byggris ble brukt for å undersøke eventuelle ulikheter mellom mortet og malt byggris i forhold til isolering av kostfiber og tilgjengeliggjort sukker etter simulert fordøyelse.
3.1 Prøveopparbeidelse
3.1.1 Boil-in-bag byggris fra Møllerens
Norgesmøllene har behandlet byggrisen med damp for å få en snarkokt variant, og slipt den.
Opprinnelsen er ukjent, men den er ikke norsk og den er ikke standardisert.
Norgesmøllene er sparsomme med detaljerte opplysninger her og deler av prosessen er patentert og utført av bedriftens samarbeidspartnere.
I. Ubehandlet byggris:
Ubehandlede prøver ble kun malt på Retsch mølle på 0,5 millimeter. De ble så oppbevart ved – 20 ºC gjennom hele perioden.
Tørrstoff i ubehandlet hel byggris: 89 %
II. Varmebehandlet byggris:
Prøver som skulle varmebehandles ble kokt etter anvisning på pakken; i 13 minutter med én teskje salt. Vaskevannet, som ved normal bearbeiding blir helt av, ble ikke analysert.
Innholdet i pakkene ble så avkjølt, fryst og frysetørket. Etter dette ble også disse malt på Retsch mølle på 0,5 millimeter og oppbevart ved – 20 ºC hele perioden.
Tørrstoff i fersk kokt byggris (før frysetørking): 35,6 %
3.1.2 Byggris fra Sjåk
Byggrisen var på forhånd blitt avskallet.
Den ble kokt i et overskudd av vann (100 mL vann per 15 g. byggris) i 45 minutter, avkjølt og oppbevart ved – 20 ºC. Byggrisen ble kun mortet, ikke frysetørket og malt.
Tørrstoff i kokt hel byggris: 29,4 %
Figur 3.1: Til venstre vises Sjåk byggris, til høyre vises Møllerens boil-in-bag snarkokte byggris. Som bildet viser er Møllerens byggris delt opp i mindre biter og det kan se ut til at denne typen er noe mer slipt enn byggrisen fra Sjåk.
3.1.3 Brokkoli
Brokkolien som ble brukt i ”Det sunne måltidet” er dyrket på Skallerød gård på Jeløy i Moss, og er av sorten Ironman. Brokkolien ble høstet 107 dager etter såing. Den ble lagret ved 2 ºC i ett døgn, før den ble delt i buketter med cirka 2 cm stilk fra sekundær gren på buketten.
Midtbuketter på over 36 gram ble delt i to.
I. Rå brokkolibuketter:
Rå brokkolibuketter ble fryst ved hjelp av flytende nitrogen, vakuumpakket og oppbevart ved – 40 ºC før de ble finmalt i kjøkkenmaskin. Deretter ble de oppbevart ved – 20 ºC.
II. Blansjerte brokkolibuketter:
Hele brokkolibuketter ble blansjert ved 97 ºC i fem minutter, avkjølt i isvann, og vakuumpakket. Oppbevart ved – 70 ºC.
Deretter ble de frysetørket, finmalt i kjøkkenmaskin og oppbevart ved – 20 ºC resten av forsøksperioden.
Tørrstoff i fersk ubehandlet brokkoli og i blansjert brokkoli (før frysetørking): 10 %
3.1.4 Laks
Grovmalt Salma-laks fra Bremnes Seashore AS ble tint og trykket sammen slik at tykkelsen var rundt 5 millimeter før den ble vakuumpakket. Den ble så varmebehandlet i to minutter ved 70 ºC, etterfulgt av rask avkjøling i isvann.
Tørrstoff i kokt laks: 33,3 %
3.2 In vitro fordøyelsesmetoder
Det er brukt fire ulike in vitro modeller for fordøyelse; NSP-analyse (Englyst et al. 1994), enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010), in vitro enzymatisk fordøyelse for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999), og en metode som er basert på Aura sin, men hvor de kommersielle enzymene er byttet ut med humane fordøyelsesenzymer (Ulleberg et al. 2011).
3.2.1 Metode for måling av total NSP (non-starch polysaccharides)
Dette er en metode for kvantitativ og kvalitativ bestemmelse av kostfiber som ikke-stivelses polysakkarider, i henhold til Englyst sin metode (Englyst et al. 1994). Metoden baseres på enzymatisk hydrolyse og fjerning av stivelse, etterfulgt av syrehydrolyse av NSP til deres respektive nøytrale monosakkarider (rhamnose, fukose, mannose, galaktose, glukose, xylose og arabinose). Disse identifiseres og kvantifiseres ved gass-væske kromatografi (GLC).
Metoden ble utført på ubehandlet og kokt byggris fra Møllerens samt rå og blansjert brokkoli (fra avsnitt 3.1.1 og 3.1.3), to paralleller av hver. Det ble i tillegg brukt to referanser;
pulverpreparat fra eple (ERM-BC 516) og gulrot (ERM-BC 515), med et kjent innhold av ikke- stivelses polysakkarider som kontroll (Vedlegg 2) (Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) & European Reference Materials (ERM) 1996).
Fremgangsmåte
Det ble første laget en standardløsning bestående av 520 milligram (mg.) rhamnose, 480 mg.
fukose, 4750 mg. arabinose, 4450 mg. xylose, 2300 mg. mannose, 2820 mg. galaktose, 9400 mg. glukose og 2790 mg. galakturonsyre som ble fortynnet til én liter med 50 % benzosyre.
300 mg finmalt prøve ble fordelt i hver sine 50 mL Kimaxrør.
Til hvert rør ble det tilsatt 250 mg. syrevasket sjøsand og ca 15 glassperler slik at pelleten skulle være mulig å knuse i punkt III.
I. Dispersjon og enzymatisk nedbrytning av stivelse – simulert fordøyelse
Prøvene ble tilsatt 2 mL dimetylsulfoksid (DMSO) for å svelle stivelsen (slik at den var tilgjengelig for α-amylase fra Termamyl), og mikset ved hjelp av vorteksmikser slik at alt ble vætet. I løpet av fem minutter ble prøvene vorteksmikset tre til fire ganger. Rørene ble så plassert i kokende vannbad i 20 sekunder før de ble mikset igjen. Etter dette stod de i 30 minutter i det kokende vannbadet.
Rørene ble mikset igjen og tilsatt 8 mL av enzymløsning 1. Enzymløsning 1 bestod av 2,5 mL Termamyl 120 L (Novozymes, 120-138 U/g) fortynnet til 200 mL med varm natriumacetatbuffer (pH 5,2) som på forhånd var varmet til 50 ºC. Enzymløsningen ble blandet godt inn i prøven før rørene ble satt tilbake i det kokende vannbadet i 10 minutter.
Deretter ble de overført til et vannbad som holdt 50 ºC. Der stod de i tre minutter før de ble tilsatt enzymløsning 2. Enzymløsning 2 ble laget ved å løse 1,2 gram Pancreatin (Sigma- Aldrich, P-7545, 8 x USP Unit; 8 x 25 USP units/mg amylase, 8 x 25 USP units/mg protease og 8 x 2 USP units/mg lipase) i 12 mL destillert vann, for så at løsningen ble sentrifugert ved 1500 g i 10 minutter (Heraeus, Multifuge 4KR). 10 mL av supernatanten ble pipettert ut og tilsatt 2,5 mL Promozyme 400 L (Novozymes). Promozyme inneholder pullanase som er et enzym laget spesifikt for å katalysere hydrolysen av (1,6)-bindinger i amylopektin. Det produserer flere lineære, men lavmolekylære molekyler fra forgreningene (BeMiller 2007).
Rørene ble grundig vorteksmikset før de ble innkubert ved 50 ºC i 30 minutter.
Vorteksmiksingen ble gjentatt etter 10, 20 og 30 minutter i vannbadet.
For å stoppe enzymaktiviteten ble prøvene overført til et kokende vannbad i 10 minutter.
II. Felling og vask av residuet totalt NSP
Etter 10 minutter i kokende vannbad ble rørene avkjølt i isvann, før de ble tilsatt 0,15 mL 5 M saltsyre. I løpet av de neste fem minuttene ble samtlige rør vorteksmikset tre ganger mens de fortsatte å stå i isvannet. 40 mL surgjort absolutt etanol ble tilsatt og mikset godt inn i prøvene. Inkubasjon i 30 minutter på is.
Deretter ble prøvene sentrifugert (Heraeus, Multifuge 4KR) ved 1500 g i 10 minutter.
Supernatanten ble fjernet og pelleten løst ved hjelp av miksing i 10 mL 85 % surgjort etanol.
Ytterligere 40 mL surgjort 85 % etanol ble tilsatt og prøvene ble mikset godt. Denne vaskeprosedyren ble gjentatt to ganger.
30 mL aceton ble tilsatt og prøvene ble vorteksmikset. De ble så sentrifugert ved 1500 g i 10 minutter før supernatanten ble fjernet og pelleten fikk lufttørke over natta. Da pelletene ikke var helt tørre dagen etter ble de satt i vannbad ved 50 ºC til all acetonen var dampet av.
III. Syrehydrolyse av residuet
Pelleten ble knust ved hjelp av en morter og tilsatt 5 mL 12 M svovelsyre som ble mikset godt inn i prøven. Cellulosen i prøvene ble svellet ved å innkubere ved 35 ºC i 30 minutter, med vorteksmiksing etter 5, 10 og 20 minutter. 25 mL destillert vann ble tilsatt, og prøvene ble hydrolysert videre i kokende vannbad i en time. I løpet av denne tiden ble prøvene mikset én gang etter ti minutter. Hydrolysen skjer ved at et vannmolekyl bryter glykosidbindingene som holder molekylene sammen, ved hjelp av syre og varme som katalysatorer (BeMiller 2007).
Prøvene ble avkjølt og satt i kjøleskap.
IV. Behandling videre og opparbeidelse av kalibreringsløsning 1 mL av standard sukkerløsning ble tilsatt 5 mL 2,4 M svovelsyre.
1 mL av denne og 1 mL av hver av de hydrolyserte prøvene (to paralleller) ble fordelt i hver sine rør, før 0,5 mL internstandard (1 mg/mL allose) ble tilsatt. Prøvene ble deretter satt i isvann og tilsatt 0,4 mL 12 M ammoniakk. Det ble kontrollert at prøvene var basiske med pH- papir. Ytterligere 0,1 mL 12 M ammoniakk ble tilsatt.
Deretter ble det tilsatt 0,1 mL ammoniakk/natrium-borhydrid og rørene ble innkubert uten kork ved 40 ºC i 30 minutter. Det var i denne prosessen det ble dannet alditoler ved reduksjon av karbonylgruppene. 0,2 mL iseddik ble så tilsatt og mikset godt inn i prøven, før 0,5 mL av hver prøve ble overført til nye 30 mL Kimax-rør.
Prøvene ble tilsatt 0,5 mL methyl-imidazol og 5 mL eddiksyreanhydrid som ble mikset godt inn. De ble stående i 10 minutter før 0,9 mL absolutt etanol ble tilsatt. 10 mL destillert vann ble så tilsatt etter ytterligere fem minutter. Etter enda ytterligere fem minutter ble 0,5 mL bromfenolblått tilsatt, prøvene ble mikset for så å bli satt i isvann. 5 mL 7,5 M kaliumhydroksid ble tilsatt og korken ble skrudd på med en gang for å unngå avdamping.
Etter to minutter ble enda 5 mL 7,5 M kaliumhydroksid tilsatt og fordelt i prøvene ved å vende rørene opp-ned et par ganger. Prøvene stod i isvannet til det ble dannet to faser. Den øverste gule fasen, inneholdende svært flyktige alditolacetater, ble overført til GC-rør.
Analyse med hensyn på nøytrale sukker ble gjort ved hjelp av gass-væske kromatografi (GLC).
