PilZ-domene proteinet ABUW_2255 i Acinetobacter baumannii
-
Funksjonell analyse og effekter på antimikrobiell resistens og motilitet
Anne-Linn Bjerke
Masteroppgave ved seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap
45 studiepoeng Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
15.05.2021
II
III
PilZ-domene proteinet ABUW_2255 i Acinetobacter baumannii
-
Funksjonell analyse og effekter på antimikrobiell resistens og motilitet
Anne-Linn Bjerke
Masteroppgave ved seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap
45 studiepoeng Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
15.05.2021
IV
© Anne-Linn Bjerke 2020
PilZ-domene proteinet ABUW_2255 i Acinetobacter baumannii – funksjonell analyse og effekter på antimikrobiell resistens og motilitet
Anne-Linn Bjerke http://www.duo.uio.no/
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
V
Sammendrag
Antimikrobiell resistens (AMR) er et verdensomspennende problem som vil kunne medføre enorme helsemessige og økonomiske konsekvenser. Resistensutvikling er økende, og fører til begrensede behandlingsmuligheter og terapisvikt for en rekke infeksjonssykdommer. Den gram-negative bakterien Acinetobacter baumannii har stor kapasitet til å erverve
antibiotikaresistensgener via horisontal genoverføring og har meget høy evne til langvarig overlevelse på overflater, noe som gjør den til en av de viktigste nosokomiale patogener globalt. c-di-GMP er et intracellulært signalmolekyl i bakterier. I dette studiet var målet å undersøke om det putative c-di-GMP-signaliseringsgenet ABUW_2255, som koder for et protein med et PilZ-domene, kunne ha en mulig funksjonell rolle i antimikrobiell resistens i A.
baumannii, samt å undersøke andre mulige c-di-GMP relaterte funksjoner for genet. Dette ble gjort ved å undersøke om inaktivering av ABUW_2255 i den multiresistente A. baumannii stammen AB5075 ved innføring av transposon insersjoner ville påvirke evnen til dannelsen av biofilm, twitching motilitet og overflatemotilitet. Eventuell påvirkning på resistensmønster ble tilsvarende undersøkt ved bestemmelse av minimum inhibitorisk konsentrasjon (MIC).
MIC-studiene viste at insersjonsmutanten AB5075-Δ05917 i ABUW_2255 var minimum åtte ganger mer følsom mot tobramycin relativt til referansestammen A. baumannii AB5075 (villtype), og bekreftet i tillegg en tidligere observasjon om at denne insersjonsmutanten var fire ganger mer følsom for amikacin relativt til AB5075 villtype. Tilsvarende endring i resistensmønster ble imidlertidig ikke observert for de to andre insersjonsmutantene i det samme genet. Dersom PilZ-domenet i proteinet kodet for av ABUW_2255 vises å binde c-di- GMP, vil dette studiet være det første som viser en effekt av c-di-GMP-relaterte gener på aminoglykosidresistens. Ytterlige studier vil kreves for å forklare den molekylære
mekanismen for hvordan ABUW_2255 kan påvirke resistensmønster for amikacin og tobramycin. En annen fenotype som ble koblet til ABUW_2255 i dette studiet var twitching motilitet. Det ble observert en sterkt nedsatt evne til å utføre twitching motilitet for samtlige tre insersjonsmutanter i ABUW_2255 relativt til AB5075 villtype. Flere PilZ-domene proteiner er tidligere identifisert å være essensielle for twitching motilitet i andre
bakteriearter, og dette synes å være konservert i A. baumannii AB5075. Videre arbeid bør involvere komplementasjonsstudier av de indentifiserte fenotypene for å undersøke om tap av fenotype kan reddes ved tilbakeføring av en funksjonell genkopi av ABUW_2255.
VI
Forord
Denne masteroppgaven på 45 studiepoeng ble utført i perioden august 2020 til mai 2021 ved universitetet i Oslo, farmasøytisk institutt ved seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap.
Jeg vil rette en stor takk til min hovedveileder professor Ole Andreas Løchen Økstad for hans gode veiledning gjennom hele forløpet og for alle teoretiske bidrag. Takk også til stipendiat Claus Michael Goul Larsen for all hjelp i arbeidet med oppgaven og for presis og tålmodig opplæring på laboratoriet. Takk til begge for deres positive holdninger og for å ha gitt meg innsikt i et spennende fagområde.
En stor takk til familien min for all støtte og alle oppmuntrende ord. Takk også til min fantastiske studiegjeng som har vært med meg gjennom alle utfordringer og gleder i mitt femårige masterprogram ved farmasøytisk institutt.
Anne-Linn Bjerke, Oslo, mai 2021
VII
Forkortelser
ABC ABCh50
ABO ABOA113
ACC «Aminoglycoside acetyltransferase»
AME «Aminoglycoside modifying enzyme»
AMI Amikacin
AMR Antimikrobiell resistens
ANT «Aminoglycoside nucleotidyltransferase»
APH «Aminoglycoside phosphotransferase»
ATC ATCC17978
C Celsius
c-di-GMP Syklisk di-GMP (Bis-(3`-5`)-syklisk dimerisk guanosinmonofosfat) CFU «Colony-forming unit»
DNA «Deoxyribonucleic acid»
EPS «Extracellular polymeric substances»
ESBL «Extended-spectrum beta-lactamase»
ESKAPE Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa og Enterobacter spp
g Gram
gDNA «Genomic DNA»
GEN Gentamicin
HGT “Horizontal gene transfer”
L Liter
LB «Lysogeny broth»
LPS Lipopolysakkarider
M Molar
MDR «Multidrug resistant»
mg Milligram
MHB Mueller Hinton Broth
MIC «Minimum inhibitory concentration»
ml Milliliter
VIII
MQ-vann MilliQ vann
nm Nanometer
OD «Optical density»
ONK Over natt-kultur OXA «Oxacillinase»
PDR «Pandrug-resistant»
qPCR «Quantitative polymerase chain reaction»
Rpm «Rounds per minute»
TOB Tobramycin
TSB «Trypic soy broth»
WHO «World Health Organization»
WT «Wild type»
µg Mikrogram
µl Mikroliter
IX
Innholdsfortegnelse
1 Innledning ... 1
1.1 Antimikrobiell resistens ... 1
1.2 Antibakterielle midler og resistens ... 4
1.3 Syklisk-di-GMP ... 8
1.4 Acinetobacter baumannii ... 10
1.4.1 Antibiotikaresistens hos A. baumannii ... 12
1.4.2 Fasevariasjon ... 14
1.4.3 Biofilm ... 15
1.4.4 Twitching motilitet ... 17
1.4.5 Overflatemotilitet ... 18
1.5 PilZ-domene proteinet ABUW_2255 ... 19
1.5.1 PilZ-domene proteiner ... 20
1.6 Mål med studiet ... 21
2 Materialer ... 22
2.1 Bakteriestammer ... 22
2.1.1 A. baumannii AB5075 transposon insersjonsmutanter ... 22
2.2 Kommersielle kit ... 22
2.3 Reagenser og løsninger ... 23
2.4 Løsninger tilberedt i laboratoriet ... 24
2.5 Vekstmedier ... 25
2.6 Utstyr og apparatur ... 26
3 Metoder ... 28
3.1 Bestemmelse av minimum inhiberende konsentrasjon ... 28
3.2 Måling av biofilmdannelse ... 31
3.2.1 Måling av biofilmdannelse for ATCC17978, ABOA113 og ABCh50 ... 31
3.2.2 Måling av biofilmdannelse for AB5075, AB5075-Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917 ... 34
3.3 Måling av twitching motilitet ... 36
3.4 Isolering av genomisk DNA ... 37
3.5 Isolering av RNA ... 38
3.6 Måling av overflatemotilitet ... 40
X
4 Resultater ... 41
4.1 Effekt på minimum inhibitorisk konsentrasjon (MIC) for aminoglykosid antibiotika ved inaktivering av genet ABUW_2255 ... 41
4.1.1 Optimalisering av testoppsett for MIC-bestemmelse for Acinetobacter baumannii AB5075 og isogene transposoninsersjons-mutanter AB5075-Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917 ... 41
4.1.2 MIC-bestemmelse for utvalgte aminoglykosid antibiotika i A. baumannii AB5075 og isogene mutanter AB5075-Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917 42 4.1.3 Gjentatt MIC-bestemmelse for tobramycin, gentamicin og amikacin hos A. baumannii AB5075 villtype og mutant AB5075-Δ05917 ... 46
4.2 Effekt av inaktivering av ABUW_2255 på biofilmdannelse hos A. baumannii AB5075 ... 50
4.2.1 Piloteksperiment for måling av biofilmdannelse ... 50
4.2.2 Måling og tolkning av biofilmdannelse for A. baumannii AB5075 og isogene transposoninsersjonsmutanter AB5075-Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917 52 4.3 Effekt av inaktivering av ABUW_2255 på twitching motilitet hos A. baumannii AB5075 ... 54
4.4 Undersøkelse av ABUW_2255 ekspresjon ved eksponering for amikacin og tobramycin ved ½ MIC ... 58
4.4.1 gDNA-isolering ... 59
4.4.2 RNA-isolering og måling av konsentrasjon ... 59
4.5 Effekt av inaktivering av ABUW_2255 på overflatemotilitet hos A. baumannii AB5075 ... 60
5 Diskusjon ... 65
5.1 Sammenheng mellom c-di-GMP signalisering og resistens mot aminoglykosider i A. baumannii ... 65
5.2 Effekt av inaktivering av ABUW_2255 på biofilmdannelse ... 68
5.3 Effekt av inaktivering av ABUW_2255 på twitching motilitet ... 69
5.4 Effekt av inaktivering av ABUW_2255 på overflatemotilitet ... 70
6 Konklusjon og videre arbeid ... 71
Litteraturliste ... 72
Vedlegg 1 ... 80
Vedlegg 2 ... 83
Vedlegg 3 ... 89
XI
1
1 Innledning
1.1 Antimikrobiell resistens
Antimikrobielle legemidler er midler som brukes til å forebygge og behandle infeksjoner i mennesker, dyr og planter. Oppdagelse og bruk av denne legemiddelklassen har ført til revolusjonerende endringer i behandling av infeksiøse sykdommer. Men mikrober (bakterier, virus, parasitter og sopp) som forårsaker infeksjonssykdommer har potensiale til å bli
resistente og gjøre antimikrobielle legemidler ineffektive (1). Antimikrobiell resistens (AMR) er når en mikrobe endres til å bli mer eller fullstendig resistent mot antimikrobielle midler som mikroben tidligere var mottakelig for (2). Den økende forekomsten av AMR er et verdensomspennende problem, og ansees av Verdens Helseorganisasjon (WHO) som en av topp ti globale helsetrusler (3).
En infeksjon forårsaket av en resistent mikrobe er mer utfordrende eller umulig å behandle, som gjør valget av antimikrobielt legemiddel komplisert og tidkrevende, og medfører stor risiko for terapisvikt. Dette fører til forlenget sykehusopphold, lengre sykdomsperiode, høyere sjanse for dødelig utfall og det blir også en mer kostbar prosess for samfunnet (4). Uten effektive antimikrobielle legemidler vil medisinske prosedyrer som operasjoner,
kreftbehandling med cellegift og organtransplantasjoner medføre en betydelig høyere risiko (3, 5). Antimikrobiell resistens fører til begrensede behandlingsmuligheter mot alvorlige sykdommer som HIV, malaria, lungebetennelse og tuberkulose, som på grunn av
antimikrobielle midler har hatt et kraftig oppsving i overlevelsesandel (5). I 2014 ble det estimert at 700 000 menneskelige dødsfall årlig kunne tilskrives AMR (1). Etter all
sannsynlighet er dette et lavt estimat på grunn av underrapportering og dårlig overvåkning i mange deler av verden. Den samme rapporten estimerte at antall dødsfall grunnet AMR vil være 10 millioner i år 2050 dersom ingen tiltak blir iverksatt (1).
I tillegg til helseutfordringene AMR gir, er det også økonomiske konsekvenser. Forlengede sykdomsperioder og sykehusopphold gir høyere kostnader for samfunnet, både i form av høyere behandlingskostnader og tap av arbeidskraft ved lengre perioder med sykefravær. Det
2
er anslått at dersom det ikke utføres tiltak vil den samlede økonomiske byrden som følge av antimikrobiell resistens kunne bli opptil 100 billioner US dollar (1).
Årsakene til AMR-problematikken er mange og sammensatte. Utviklingen av mikrobiell resistens er en naturlig evolusjonær respons på selektivt press (6). Overforbruk av antibiotika, både i human- og veterinærmedisin og i jordbruk og husdyrproduksjon akselererer denne prosessen (4). Land med høyt forbuk av antimikrobielle midler har vist å også ha høy resistensforekomst (7). I husdyrproduksjon brukes antibiotika i visse deler av verden i subterapeutike doser som et vekstfremmende middel og for å forebygge sykdom. Denne bruken av antimikrobielle legemidler kan bidra til spredningen av resistente patogener både i produksjonsdyr og mennesker, ettersom bruk av antibiotika i subterapeutiske doser vil fremme resistensutviklig gjennom seleksjon av resistente bakteriestammer (8, 9). Resistente patogener som stammer fra jordbruk og husdyrproduksjon kan spres til mennesker gjennom direkte kontakt mellom dyr og menneske (hovedsakelig bønder), og gjennom forurensede eller ikke tilstrekkelig tilberedte matprodukter. Spredningen kan også skje på en mer indirekte måte gjennom dyreekskrementer som fører til forurensning av miljøet både gjennom
resistente bakterier og ikke-metabolisert antibiotika (10, 11). På grunn av økt
forbrukeretterspørsel i husdyrproduksjonen antas antimikrobielt forbruk å øke med 67% innen 10 år i verden sett under ett, og nært dobles i enkelte land (11).
En annen årsak til AMR-problematikken er at på tross av at det blir observert resistens i stadig flere patogener og med økende alvorlighetsgrad, er det likevel lite nytt som har skjedd i utvikling av nye antimikrobielle legemidler de siste tiårene. For å veilede forskning og
utvikling (FoU) av nye og effektive antibiotika, ble det etter oppdrag fra WHO laget en global prioriteringsliste over antibiotikaresistente bakterier som det kategoriseres som kritisk å finne nye legemidler mot (12). I 2019 ble det identifisert 32 nye antimikrobielle legemidler i klinisk utvikling som har virkning mot WHOs prioriterte patogener. Bare seks av disse ble
klassifisert som nyskapende (3). Nyskapende antimikrobielle midler vil være å foretrekke fremfor analoger, da sistnevnte har problemer med å holde tritt med resistensutviklingen (13).
Forklaringen på mangelen i nyutvikling antas i stor grad å ligge i mangel på lønnsomhet i antimikrobielle legemidler for legemiddelindustrien (14). Mangel på private investeringer og innovasjon i utviklingen undergraver arbeidet med bekjempe AMR (15).
3 O’Niells rapport fra 2016 peker på en rekke tiltak for å bekjempe AMR, vist i figur 1.1.1.
Tiltakene går hovedsaklig ut på å redusere nåværende forbruk og sørge for en bedre og mer bærekraftig modell for utviklig av fremtidige behandlingsalternativer, gjennom økt
internasjonalt samarbeid. For å komme over det økonomiske hinderet legemiddelindutrien står ovenfor, foreslås et globalt innovasjonsfond hvor det allerede er donert store summer (5).
Økt bevisstgjøring til offentligheten er et annet foreslått tiltak, og mye tyder på at dette er et område med forbedringspotensiale (16). I 2016 publiserte den Europeiske kommisjonen en undersøkelse som påpekte en vedvarende mangel på kunnskap om antibiotika blant europeere (17). Å fremme nye diagnostikkmetoder vil gi mer presis behandling og mindre risiko for feilbruk og resistensutvikling(18). Andre tiltak som blir foreslått er å forbedre hygiene og forbedre overvåkningen av forbruk og resistensforekomst (5).
Figur 1.1.1 Ti ulke tiltak for å bekjempe AMR. Figuren er hentet fra rapporten «Tackling Drug- Resistant Infections Globally: final report and recommendations» (5).
4
I WHOs liste over prioriterte patogener hvor det haster med utvikling av nye antimikrobielle midler finnes en gruppe patogener som har fått det passende akronymet ESKAPE, etter patogenenes evne til å «unnslippe» antibiotika gjennom betydelig utviklet antibiotikaresistens (12). Gruppen består av Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa og Enterobacter arter.
Patogenene har utviklet resistens mot mange førstelinjeantibiotika som makrolider,
tetrasykliner og fluorokinoloner, men det er også sett resistens mot siste linje-antibiotika som karbapenemer, glykopeptider og polymyksiner (19).
1.2 Antibakterielle midler og resistens
Antibakterielle midler er legemidler som brukes til å bekjempe infeksjoner forårsaket av bakterier. Antibakterielle midler kan ha sitt utspring i naturen og lages av mikroorganismer (antibiotika), eller delvis eller i sin helhet ha blitt til i syntese på laboratoriet, basert på strukturen til naturlige produkter (antimikrobielle midler) (20). For enkelhets skyld vil begrepet antibiotika brukes i denne oppgaven uavhengig av det antibakterielle middelets opprinnelse.
Antibiotika kan deles i baktericide midler, som dreper bakterien, og bakteriostatiske midler, som hemmer bakteriens vekst. Det er en flytende overgang mellom baktericid og
bakteriostatisk avhengig av konsentrasjon og mikrobe; legemidlene kan være statiske i mindre konsentrasjoner og baktericide i høyere konsentrasjoner (21, 22). En annen inndeling er bredspektret og smalspektret antibiotika. Bredspektret antibiotika hemmer veksten av mange forskjellige bakteriearter, mens smalspektret antibiotika hemmer spesifikt noen få grupper bakterier fordi de hemmer mer spesifikke enzymer eller reaksjoner. I en klinisk setting vil det være fordelaktig å bruke smalspektret antibiotika for å minimere utviklingen av resistens, men dette krever samtidig mer nøyaktig diagnostikk (21).
Antibiotika kan kategoriseres etter virkningsmekanisme, og kan deles inn etter følgende fem hovedmekanismer, med eksempler på antibiotikagrupper:
(1) Forstyrrelse av celleveggsyntese
Penicilliner, monobaktamer, cefalosporiner, karbapenemer (ß-laktamer)
5 (2) Inhibering av proteinsyntese
Aminoglykosider, tetrasykliner, makrolider, kloramfenikol (3) Hemming av nukleinsyresyntese
Metronidazol, fluorokinoloner, rifampicin (4) Hemming av folinsyresyntese
Sulfonamider, trimetoprim
(5) Depolarisering av cellemembranen Polymyksiner, daptomycin
(23, 24).
Antimikrobiell resistens
Oppdagelsen og utnyttelsen av antibiotika revolusjonerte medisinen i første halvdel av 1900- tallet (16, 25). Alexander Fleming, som oppdaget penicillin, var imidlertid raskt ute for å advare mot konsekvensene av feilbruk av sin egen oppdagelse: allerede i 1945 advarte han om potensialet for utvikling av resistens mot penicillin (26).
Bakterier kan være naturlig resistente (som en konsekvens av bakteriens strukturelle eller funksjonelle egenskaper, som for eksempel at antibiotikaens målmolekyl ikke finnes i arten), eller bakteriene kan erverve resistens (23, 27). Resistens kan erverves som et resultat av spontane mutasjoner i genomet, men de fleste resistensgener som er funnet i patogene bakterier er anskaffet gjennom horisontal genoverføring (6). Horisontal genoverføring er overføringen av genmateriale mellom bakterier som ikke er direkte etterfølgere av hverandre.
Genoverføringen har tre hovedmekanismer: Tranformasjon – fritt DNA blir tatt opp av en kompetent bakterie fra omgivelsene; Transduksjon – en bakteriofag overfører resistensgener fra en bakterie og til en annen under sin infeksjonssyklus; Konjugasjon – genetisk materiale overføres fra en bakterie til en annen ved direkte kontakt, for eksempel gjennom pilus- kontakt. Mange resistensgener finnes på mobile genetiske elementer som plasmider eller transposoner, som kan være konjugative og har da evnen til å spres mellom bakterier, også mellom ulike arter. Ofte er det flere resistensgener på et og samme plasmid, som kan gjøre bakterien resistent for flere klasser antibiotika samtidig (27).
Antibakterielle resistensmekanismer forteller om hvordan bakterier unngår antibiotikaens virkning. Resistensmekanismene kan deles i fire hovedkategorier (figur 1.2.1)(24):
6
(1) Hemme opptaket av antibiotikum (2) Modifisere legemiddelets målmolekyl (3) Inaktivering av antibiotikum
(4) Aktiv legemiddeleffluks
Figur 1.2.1 Antibakterielle resistensmekanismer: aktiv legemiddeleffluks gjennom efflukspumper, hemming av antibiotikaopptak inn i cellen, modifisering av legemiddelets målmolekyl og inaktivering av antibiotikum. Figuren er hentet fra (24).
Bakterier kan ha flere av disse mekanismene samtidig. Ved å kombinere flere
resistensmekanismer kan bakterien oppnå resistens på tvers av antibiotikaklasser og dermed være det som kalles multidrug-resistent. En bakterie som er resistent mot en substans i tre eller flere antimikrobielle kategorier kalles multidrug-resistent (MDR). Pandrug-resistens (PDR) betyr resistent mot alle stoffer i alle antimikrobielle kategorier (28). Litteratur om dødelighet og epidemiologi vedrørende pandrug-resistens er enda sparsom, men rapportering om pandrug-resistente bakterier øker globalt, og det finnes dokumenterte tilfeller av dødsfall som følge av pan-resistente bakterier (29, 30).
Aminoglykosider – virkningsmekanisme og resistens
Aminoglykosider er bredsprektrede antibiotika som i utgangspunktet har et smalt terapeutisk vindu, men forbedrede doseringsregimer har ført til lavere toksisitet (31, 32). De er spesielt
7 potente mot Enterobacteriaceae familien, og har også effekt mot mer krevende bakterier som Staphylococcus aureus og P. aeruginosa (33).Aminoglykosider hemmer proteinsyntesen ved å binde til A-setet i 16S ribosomal i 30S ribosomale subenhet, hvor de forskjellige
medlemmene i aminoglykosidklassen har spesifitet for ulike regioner i setet. Bindingen fører til feil i translasjonen, og protein med feil i aminosyresekvensen blir frigitt og gjør skade på cellemembranen og andre steder i bakteriecellen og fører til celledød (34).
Resistens mot aminoglykosider kan foregå på flere måter: enzymatisk modifisering og inaktivering ved hjelp av aminoglykosidmodifiserende enzymer (AMEs), ved å fjerne aminoglykosidene fra cytosol ved hjelp av efflukspumper, nedsatt permeabilitet over membranen og modifikasjoner av 30S ribosomal subenhet, som fører til nedsatt affinitet for aminoglykosidene (35). AMEs består av enzymgruppene acetyltransferaser (ACCs),
nukleotidyltransferaser(ANTs) og fosfotransferaser(APHs), som katalyserer modifikasjonen av -OH eller -NH2 grupper i 2-deoksystreptamin kjernestrukturen eller i sukkerdelene av molekylet. Det finnes flere enn 100 AMEs, og de finnes i mange genetiske miljøer (33, 36).
APHs finnes i stort sett i gramnegative bakterier, men også noen grampositive bakterier som S. aureus og Enterococcus spp (33) ANT var først beskrevet i K. pneumoniae og S. aureus og er senere identifisert i et stort antall arter (33, 36).
Resistens mot aminoglykosidene tobramycin og amikacin (figur 1.2.3) i A. baumannii skjer hovedsakelig gjennom aminoglykosid-modifiserende enzymer (AMEs) (37). Enzymer i alle gruppene AMEs er sett å forårsake resistens mot amikacin og tobramycin i A. baumannii, noen utvalgte er: er ACC(6´)-1 enzymet og ANT(4´) for både amikacin og tobramycin, og ACC(3)-IIa for tobramycin (33). Aminoglykosidresistensgenet aac(6´)-Iad som koder for 6′- N-acetyltransferase er identifisert i A. baumannii, og spiller en sentral rolle i dens amikacin- og tobramycinresistens (38).
8
Figur 1.2.3 Kjemisk struktur for tobramycin og amikacin, som har en felles kjernestruktur med 4,6- disubstituert deoksystreptaminring. Figuren er hentet fra (33).
Amikacin og tobramycin har en felles kjernestruktur med 4,6-disubstituert
deoksystreptaminring, men har ulike substitusjoner til kjernestrukturen (figur 1.2.3), noe som påvirker mottakeligheten for AMEs (33).Det er vist resistens mot aminoglykosider i A.
baumannii også gjennom overaktivitet i efflukspumper og endret permeabilitet (39).
1.3 Syklisk-di-GMP
Syklisk-di-GMP (c-di-GMP) er et universalt bakterielt sekundært signalmolekyl (40). Siden oppdagelsen i 1987 har molekylet blitt tilskrevet stadig flere cellulære funksjoner, som regulering av biofilmdannelse, motilitet, virulens, differensiering og flere prosesser (41, 42).
c-di-GMP blir syntetisert av to molekyler av guanosintrifosfat (GTP) ved hjelp av diguanyl syklaser (DGCs) som inneholder GGDEF-domener (figur 1.3.1). Nedbrytningen skjer ved hjelp av spesifikke fosfodiesteraser, hvis aktivitet er assosiert med EAL eller HD-GYP domener, som er essensielle domener for proteinenes enzymatiske aktivitet (43). Sammen kontrollerer diguanylsyklaser og fosfodiesteraser på denne måten de cellulære nivåene av c-
9 di-GMP, og blir stimulert av ekstracellulære og intracellulære signaler som oksygenforhold, lys, næringstilgang eller nærvær av antibiotika (41, 43).
Figur 1.3.1 Syklisk-di-GMP signalisering. Ved stimulans syntetiserer diguanylat-syklaser med GGDEF-domene c-di-GMP, mens fosfodiesteraser med EAL eller HD-GYD domene degraderer c-di- GMP. Ved å binde til et sekundært sete i diguanylat-syklase enzymet hindrer c-di-GMP denne syntesen å gå over en øvre grense av cellulær akkumulering av c-di-GMP. c-di-GMP binder også til effektormolekyler, som utøver den cellulære responsen til c-di-GMP signalet ved å binde et
målmolekyl («target») som utøver en virkning («output»). Figuren er hentet fra (43).
Overproduksjon av GGDEF-domene proteiner er vist å stimulere syntesen av komponenter i biofilmmatriks, og interfererer med motilitet og virulensfaktorer. Overproduksjon av EAL- domene proteiner har vist den motsatte effekten (43). Å modulere c-di-GMP signalveier representerer mange muligheter, som for eksempel å kontrollere dannelse og oppløsning av biofilm (41).
10
c-di-GMP responsive effektormolekyler
c-di-GMP kontrollerer cellulære prosesser ved å binde til effektormolekyler (figur 1.3.1).
Effektormolekyler kan være proteiner med pilZ-domener, proteiner med degenererte GGDEF- og EAL-domener, RNA-riboswitcher eller transkripsjonelle regulatorer (42, 44).
Riboswitchere er mRNA-regulerende elementer med en spesifikk sekundær struktur. Ved binding til ligander, endres den sekundære strukturen, som fører til endringer i transkripsjon, mRNA-stabilitet eller translasjon hos nedstrømsgener. c-di-GMP har blitt vist å binde til to typer riboswitcher (41). Riboswitcher er for eksempel vist å kontrollere vertskoloniseringen for Clostridium difficile ved å koordinere motilitet, toksinproduksjon, adhesjon til overflater og dannelse av biofilm (40). Degenererte GGDEF domene proteiner har tapt sin enzymatiske effekt ovenfor c-di-GMP, men beholder et bindingssete («I-site») som gjør at de kan fungere som c-di-GMP reseptorer (41). Et eksempel på en slikt degenerert GGDEF-domene protein er responsregulatoren PopA, som promoterer progresjon av cellesyklusen i Caulobacter
crescentus (45). Tilsvarende vil EAL domener som ikke lenger har fosfodiesteraseaktivitet fortsatt ha evnen til å binde c-di-GMP (41). Transkripsjonsfaktorer er c-di-GMP bindende effektorer som kontrollerer transkripsjonsprosesser (43). Et eksempel på en
transkripsjonstregulator er VpsT i Vibrio cholerae som regulerer ekspresjon av motilitet- og matriksproduksjonsgener gjennom binding til c-di-GMP (46).
1.4 Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii er en gram negativ, aerob, opportunistisk patogen bakterie. Den er en av hovedårsakene til nosokomiale infeksjoner, og er assosiert med høy dødelighet (47).
Som et opportunistisk patogen fører bakterien til infeksjon hovedsakelig hos utsatte pasientgrupper som eldre, immunsvekkende eller pasienter som nylig har gjennomgått operasjon (48). Verten (pasientens) utgangspunkt spiller en viktig rolle for utfallet av en infeksjon (49). De hyppigste infeksjonene med A. baumannii er bakteriemi og ventilator- assosierte infeksjoner, men sårinfeksjoner, meningitt og urinveisinfeksjoner forekommer også (37, 49, 50). Selv om A. baumannii hovedsakelig er et nosokomialt patogen, forekommer også samfunnservervede infeksjoner. Den vanligste av disse er pneumoni (85% av rapporterte tilfeller, 2014), og er assosiert med høy alder, alkoholisme og underliggende sykdommer (49).
A. baumannii ansees som en av de mest fremgangsrike MDR-patogenene med henhold til å overvinne effekten av antibiotika, og det er en stadig en økning i antall stammer av A.
baumannii som har oppnådd resistens mot flere antibiotikaklasser (47, 51). Bakteriens
11 fremgang antas å i stor grad kunne tilskrives to faktorer: evnen til å erverve
antibiotikaresistensgener via horisontal genoverføring, og dens evne til overlevelse over tid selv under krevende forhold - kombinert med naturlig resistens mot desinfeksjonsmidler, som gjør at patogenet er svært vanskelig å fjerne fra det kliniske miljøet (49, 52). A. baumannii tilpasser seg raskt nye miljøer som temperaturendring og endret næringstilgang, og kan overleve lange perioder med uttørking og redusert tilgang på næring, som er viktige faktorer i spredning. Bakterien kan smitte etter kontakt med kontaminerte ikke-levende overflater, men smitter også ved direkte kontakt med infiserte individer (53). A. baumannii har fått tilnavnet
«Iraqibacter» etter en stor fremvekst av blodstrøminfeksjoner med A. baumannii blant soldater i konfliktområder i Irak og Afghanistan (54).
Grundige studier på A. baumanniis naturlige forekomst i miljøet mangler (55). Det er kjent at A. baumannii er stort sett funnet i sykehussammenheng, men det finnes også rapporter om isolater fra ikke-humane kilder som grønnsaker, dyr, havbruk og jord, men det er ikke klart om disse isolatene er et resultat av miljøforurensninger fra et sykehusreservoar eller om det viser at det er alternative naturlige reservoarer (49, 56). A. baumannii er blitt isolert fra flere fuglearter, og permanent tilstedeværelse av A. baumannii er sett i habitat for storker (57, 58).
Patogenet er sett i økende forekomst hos dyr innlagt på dyresykehus, og anses der som et mulig sykehuspatogen (59, 60). Det er indikert at A. baumannii kan være et zoonotisk patogen som kan spre seg til husdyr (58).
Kunnskap om A. baumanniis patogenese, virulensmekanismer og mekanismer for
antibiotikaresistens er viktig for å kunne forstå og overkomme resistensproblematikken. A.
baumanniis sykdomsbilde og evne til å utvikle alvorlige infeksjoner er et resultat av flere virulensfaktorer. En rekke virulensfaktorer er identifisert i A. baumannii gjennom genomiske og fenotypiske analyser. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til: poriner,
lipopolysakkarider, fosfolipaser, yttermembranvesikler, systemer for anskaffelse av metaller fra miljøet rundt, protein sekresjonssystemer, motilitet (avsnitt 1.4.4 og 1.4.5) og evne til å danne biofilm (avsnitt 1.4.3). Poriner er kanalproteiner som sitter i den ytre membranen og modulerer bakteriecellens permeabilitet. Porinet OmpA induserer apoptose i humane epitelceller og er viktig for adhesjon og invasjon av epitelceller for A. baumannii (61, 62).
Lipopolysakkarider (LPS) er en komponent i yttermembranen og har immunogen effekt i blodbanen hos mennesker (63). For A. baumannii er den viktig for overlevelse i
12
vevsinfeksjoner og for unngåelse av vertens immunforsvar (62). Fosfolipaser er enzymer som transporteres ut av bakterien etter syntese og virker som membranaktive toksiner på for eksempel eukaryote celler (64). To typer fosfolipaser, fosfolipase C og fosfolipase D, har blitt identifisert som viktige virulensfaktorer i A. baumannii for invasjon og overlevelse i verten (62, 65). Yttermembran vesikler (OMVs) utskilles av den ytre membranen i gramnegative bakterier. I A. baumannii leverer OMVs virulensfaktorer som proteaser og fosfolipaser til vertscellen (66). Anskaffelse av jern er essensielt for vekst og funksjon av bakterielle patogener. A. baumannii lager blant annet sideroforen acinebactin som er viktig for patogenets overlevelse i epitelceller, ved å fungere som jern-chelator som tas opp av
bakteriecellen etter kompleksbinding av jern (62, 67). Dannelsen av acinebactin er vist å være signifikant høyere i MDR A. baumannii isolater sammenlignet med avirulente isolater (68).
Protein sekresjonssystemer skiller ut proteiner fra cytoplasma og over celles membraner og tillater dermed interaksjon med miljøet og verten. Flere slike systemer er blitt identifisert i A.
baumannii, blant dem et type II sekresjonssystem (T2SS) som har vist seg viktig for overlevelse i vertscellen, og et type VI sekresjonssystem (T6SS) hvis funksjon ikke er fullstendig kartlagt og ser ut til å være nokså stammespesifikk, men som blant annet er viktig for kolonisering i vertscellen (62, 69). Et type V protein sekresjonssystem er også identifisert, og er essensiell for dannelse av biofilm og adhesjon (70).
1.4.1 Antibiotikaresistens hos A. baumannii
Utviklingen av resistens i A. baumannii stammer har gradvis begrenset
behandlingsalternativene, og en rekke stammer av A. baumannii er resistente mot de fleste tilgjengelige antibiotika (71). Bakterien har en rekke resistensmekanismer, inkludert aminoglykosidmodifiserende enzymer, efflukspumper, modifisering av målmolekyler, ß- laktamaser og permeabilitetsendringer (62). De fleste av disse resistensmekanismene rammer forskjellige klasser av antibiotika. De er anskaffet hovedsakelig gjennom
integronmobilisering, plasmidmediert konjugasjon eller transposoner (72). A. baumannii er svært effektiv i å inkorporere fremmed DNA ved horisontal genoverføring (62). Kjente resistensmekanismer i A. baumannnii for ulike klasser antibiotika er:
Resistens mot ß-laktamer forekommer i A. baumannii ved hydrolyse, oppregulering av efflukspumper og ved endring av målmolekyl (37). Inaktivering av ß-laktamantibiotika ved hjelp av ß-laktamaser er en viktig del av MDR i A. baumannii. ß-laktamaser er delt inn i fire
13 hovedklasser, A, B, C, og D, og alle fire klassene er identifisert i A. baumannii (73). Klasse A inneholder både smalspektrede ß-laktamaser og ESBL («extended spectrum ß-lactamase»), i tillegg til karbapenemaser (37, 74). ESBL-gener spres raskt via plasmider og andre mobile genetiske elementer, og utviser høy grad av resistens (75). Klasse B kalles også metallo-ß- laktamaser fordi de bruker divalente sinkioner eller andre metallioner for katalysering, og hemmes ikke av ß-laktamasehemmere (74). Disse ß-laktamasene hydrolyserer alle ß-laktamer med unntak av monobaktamer, og er viktige bidragsytere til resistens mot karbapenemer i A.
baumannii (37, 76). Klasse C ß-laktamaser inneholder blant annet kromosomale kodende cefalosporinaser som er «native» for A. baumannii (77). Mutasjoner som fører til
overekspresjon av resistensgenet er funnet hos noen isolater og gir mer bredspektret resistens (62). Klasse D ß-laktamaser kalles oxacillinaser (OXAs), kan inaktivere alle ß-laktamer, og hemmes vanligvis ikke av ß-laktamasehemmere (37, 78). Disse type enzymer finnes i store antall (over 400 identifisert), og mange av dem har karbapenemaseaktivitet (62). Subgruppen av OXA som har denne aktiviteten utgjør en stor del av karbapenemaseandelen i A.
baumannii (71, 79).
Resistens mot tetrasykliner og tigesyklin kan skje via efflukspumper(62). Dette er den vanligste formen for tetrasyklinresistens i A.baumannii og kan også berøre tigesyklin (80).
Tigesyklin er et tetrasyklinderivat som ble utviklet på grunn av mye resistens mot
tetrasykliner, som tidligere har vært et godt egnet behandlingsalternativ mot A. baumannii (37). Resistensen kan også skje gjennom enzymatisk inaktivering av tetrasyklin av enzymer.
Disse enzymene kan også inaktivere tigesyklin. En tredje resistensmekansime mot tetrasyklin er ribosomale beskyttelsesproteiner, som frigjør tetrasyklin fra ribosomet (80).
Resistens mot fluorokinoloner kan skje via overekspresjon av efflukspumper, lav ekspresjon av poriner eller modifikasjon av målenzymer (37, 74). Modifikasjon av målenzymene DNA gyrase og topoisomernase IV fører til svekket affinitet til fluorokinoloner. (81)
Resistens mot kolistin kommer hovedsakelig fra endring av målmolekylet lipid A, som er en del av lipopolysakkarid (LPS). Det kan være forårsaket av en direkte endring av lipid A- komponenten, eller ved tap av LPS-produksjon (71). Det sistnevnte kan skje som følge av mutasjoner i acetyltransferanser som katalyserer biosyntesen av LPS eller mangel på
14
kofaktorer som er nødvendige i dannelsen av LPS (37, 74). Resistensen kan også være forårsaket av endring i permeabilitet i den ytre membranen eller efflukspumper (37).
I behandlingen av infeksjoner av MDR A. baumannii har karbapenemer vært den foretrukne behandlingen (37). Denne bruken har imidlertidig ført til økt karbapenemresistens de siste årene (82). Dette har skapt et alvorlig problem i behandlingen av MDR A. baumannii, da karbapenemresistente stammer som regel er resistente også mot alle andre mye brukte antibiotika (62). Karbapenenresistent A. baumannii er topprioritert for på WHOs liste for forskning og utvikling av nye antibiotika (12). Polymyxiner (kolistin) har tidligere vært underlagt strenge restriksjoner for bruk blant annet på grunn av nyretoksisitet, men brukes nå (2021) som et behandlingsalternativ ved MDR A. baumannii infeksjoner (37, 83). Resistens mot kolistin øker imidlertid også stadig (62). Monoterapi med kolistin er ikke i stand til forhindre resistens, og kombinasjonsterapi kan derfor være en bedre strategi (84).
Kombinasjoner som kolistin/karbapenem og kolistin/karbapenem/rifampicin har vist synergiske effekter mot A. baumannii infeksjoner (62).
1.4.2 Fasevariasjon
Fasevariasjon innebærer at bakterier undergår reversible fenotypiske endringer, ved relativt høye frekvenser sammenliknet med spontane mutasjoner. Det er en adaptiv prosess som fører til mangfold innad i stammer, og kan brukes av patogener for å tilpasse seg nye miljøer, som for eksempel å omgå vertens immunforsvar eller tilpasse seg andre ugjestmilde miljøer (85).
Fasevariasjonen skjer ved at ekspresjon av utvalgte gener skrus av eller på, skjer ved høy frekvens og er reversible ved den samme frekvensen (86). Ved hvilken frekvens fasevariasjon skjer, er karakteristisk for bakteriearten og den regulatoriske mekanismen som står bak (87).
Det er vist at A. baumannii AB5075 danner to kolonifenotyper med av ulik grad av transparens (gjennomsiktighet), kalt henholdsvis «opaque» og «translucent». De to fasene utviser en rekke forskjeller i fenotyper som cellemorfologi, overflatemotilitet, dannelse av biofilm, antibiotikaresistens og virulens. Ettersom stammens egenskaper varierer etter hvilken fenotype kolonien er, er det i eksperimenter viktig å kunne identifisere hvilken kolonivariant man arbeider med, av hensyn til studiets sammenlignbarhet. De ulike fasene for A. baumannii kan ikke undersøkes under vanlige lysforhold, men under «oblique light» hvor ulike
kolonityper kan differensieres fra hverandre (figur 1.4.2.1) (86).
15 Figur 1.4.2.1 Sammenlikning av fasevariasjon studert under forskjellige lysforhold. a) Tre kolonier av A. baumannii AB5075i normale lysforhold. b) De samme tre koloniene under «oblique light». To opaque kolonier omgir en translucent koloni. Figuren er hentet fra (86).
Frekvensen på skifte mellom de to fasene øker med økt celletetthet. Denne effekten har vært tenkt å tilskrives «quorum sensing»-signalisering, gjennom sekresjonen av en ekstracellulær faktor (86). «Quorum sensing» koordinerer genuttrykk og regulering ved høy
populasjonstetthet gjennom sekresjon av ekstracellulære signaler. Nyere studier viser at fasevarasjon styres gjennom en transkripsjonsregulator i TetR-familien, samt et assosiert effluks-system av «resistance-nodulation-cell division» (RND) familien (88). Skiftet fra
«opaque» til «translucent» forekommer ved en høyere frekvens enn motsatt (89).
Det er flere fenotypiske forskjeller mellom «opaque» og «translucent» fase. En av disse er celleform. Ved høy celletetthet (OD600=1,1) er «translucent» celler lengre enn «opaque»
celler. «Opaque» type celler har økt overflatemotilitet og virulens, mens «translucent» celler danner mer effektivt biofilm, har høyere mengde pili og utskiller større mengder ytre
membranvesikler (89). For flere antibiotikaklasser er det ingen ikke signifikant forskjell i resistens mellom fenotypene, blant annet gjelder dette for tetrasykliner, kolistin og rifampicin.
For aminoglykosidene gentamicin, tobramycin og amikacin er det derimot observert at
«opaque» fase er signifikant mer resistent (86). Også andre kliniske stammer av A. baumannii er vist å utføre fasevariasjon, blant dem referansestammen ATCC17978 (86).
1.4.3 Biofilm
Biofilm er samlinger av bakterier som er organisert i en selvprodusert matriks av
ekstracellulære polymerstoffer (EPS). EPS består hovedsakelig av proteiner, DNA, RNA og polysakkarider. Denne strukturen gjør at bakteriene i biofilmen lever svært tett over lengre tid, noe som tillater høy grad av celle-cellekommunikasjon og potensielt horisontal
genoverføring mellom bakteriecellene. Figur 1.4.3.1 viser stegene i dannelsen av biofilm.
a b
16
Figur 1.4.3.1 Stegene i biofilmdannelse: (1) Planktoniske celler fester seg til en overflate (2) Bakteriecellene produserer en matriks av ekstracellulære polymerstoffer (EPS) (3) Dannelse av mikrokoloni med flere lag (4) Moden biofilm som kan ha karakteristisk «mushroom»-form (5) Celler løsner fra biofilmen, går tilbake til planktonisk vekst og kan starte en ny syklus. Figuren er hentet fra (90).
Dannelse av biofilm beskytter bakteriene mot uttørking, antibiotika, ultrafiolett stråling og vertens immunforsvar (91), og en biofilm kan feste seg til både levende overflater, som levende vev, og ikke-levende overflater, som medisinske implantater som katetere eller hofteproteser. Biofilmassosierte infeksjoner på medisinske implantater er krevende å
behandle. Immunforsvaret klarer sjelden bekjempe infeksjonen selv, og på grunn av resistens er antimikrobiell behandlingssvikt vanlig. Ofte kreves det derfor at implantatet fjernes fra kroppen (92, 93). Fordi bakteriene i en biofilm er innkapslet i EPS matriks, vil de være mindre tilgjengelige for diffunderende antibiotika sammenliknet med planktoniske bakterieceller. En annen del av problematikken knyttet til å behandle biofilmassosierte infeksjoner med antibiotika ligger i den metabolske tilstanden til bakteriene i biofilmen.
Biofilm er bygget opp av flere lag, hvor forskjellige subpopulasjoner lever sammen (94).
Bakteriecellene i det innerste laget av biofilmen vil ha begrenset tilgang på næringsstoffer og oksygen, og vil gå inn i en hvilende («dormant») tilstand hvor de gjennomgår en genetisk regulert nedgang i aktiv cellulær metabolisme (95, 96). De vil derfor ikke utføre metabolisme eller replikere i høy nok grad til at antibiotika kan fungere effektivt, ettersom nettopp
biosyntetiske prosesser og essensielle trinn i logaritmisk vekst er mål («target») for mange
17 etablerte antibiotika (97). Oppregulering av efflukspumper ved utsettelse for lavere
konsentrasjoner antibiotika og enzymmediert resistens er andre faktorer som bidrar til resistens i biofilm (93).
I A. baumannii anses biofilmdannelse som en av de viktigste virulensfaktorene for mange kliniske isolater (98). Biofilmdannelse er essensiell for dens evne til å overleve og spre seg i sykehusmiljøer, og bidrar til langvarig overlevelse på overflater, noe som er viktig for at patogenet kan spre seg via og kolonisere på ikke-levende overflater som medisinsk utstyr (53, 98, 99). Det er rapportert om flere faktorer som er med på å regulere dannelsen av biofilm i A.
baumannii, og disse varierer avhengig av klinisk isolat (98). De fleste stammer koder for og produserer en type 1 pilus kalt Csu pilus. Csu pili er essensielle for biofilmdannelse og opprettholdelse på ikke-levende overflater, men ikke på levende overflater (100, 101). I referansestammen ATCC17978 er det vist at c-di-GMP-relaterte gener regulerer
biofilmdannelse i A.baumannii gjennom GGDEF/EAL-domeneproteiner, hvor to diguanylat- syklaser fremmer biofilmdannelse (99).
1.4.4 Twitching motilitet
Twitching motilitet er en type bevegelse i bakterier som foregår på semifaste eller faste overflater under fuktige forhold. Motiliteten krever ikke flageller, men er avhengig av type IV pili (102). Type IV pili danner fleksible strukturer bygget opp av mange individuelle «tråder»
som er flettet sammen i bunter og igjen sammenflettet med hverandre. Selve bevegelsen foregår ved at pilus strekkes ut, og pilustuppen fester seg til overflaten, før pilusstrukturen blir dratt tilbake igjennom bakteriens yttermembran og inn i periplasma. Dette drar bakterien mot punktet der pilustuppen er festet, i en rykkende bevegelse (twitching) (figur 1.4.4.1) (103).
Figur 1.4.4.1 Motilitet utvist av type IV pili: pilus strekkes ut, pilustuppen fester seg til overflaten, pilusen bli dratt tilbake gjennom bakteriens yttermembran og pilus slipper taket i overflaten. Figuren er hentet fra (104).
18
Type IV pili er essensielle i mange bakteriearter også grunnet flere egenskaper, som eksempelvis evnen til å være naturlig kompetent, adhesjon til vertsceller og
mikrokolonidannelse/biofilm (105). Type IV pili har blitt koblet til twitching motilitet i en rekke gramnegative bakterier inkludert Pseudomona aeruginosa, Neisseria arter og Xylella fastidiosa (103, 106). Funksjonen til type IV pili er kontrollert av et stort antall gener, i P.
aeruginosa er for eksempel nesten 40 gener identifisert å være involvert (107). Type IV pili biogenese og twitching motilitet i P. aeruginosa er kontrollert av c-di-GMP signalisering (41). Flere A. baumannii-stammer utviser twitching motilitet, og genomiske analyser har identifisert flere gener assosiert med dannelsen av type IV pili i ulike stammer: Det er imidlertidig få direkte eksperimentelle bevis for at A. baumannii stammer faktisk produserer funksjonelle type IV pili (108). Type IV pili er vist å kunne ha sammenheng med A.
baumanniis motilitet, selv om det er begrenset med informasjon om den eksakte molekylære mekanismen. Det er likevel vist at stammen A. baumannii M2 produserer type IV pili som har en rolle i stammens twitching motilitet, og at genene i pilA, pilD og pilT er essensielle for twitching motilitet her (109). Det er også observert at gener som er forutsett å kode for proteiner som er nødvendige for dannelsen av type IV pili ble oppregulert under vekst i humant serum, noe som kan indikere at type IV pili kan være viktig under bakteriemi (100).
1.4.5 Overflatemotilitet
På tross av at A. baumannii er klassifisert som ikke-motil, utviser flere stammer også motilitet på semifaste overflater, kjent som overflatemotilitet (99). Overflatemotilitet i A. baumannii skjer på overflaten av halvtørt medium. Det er ikke kartlagt hvilke mekanismer som står bak denne typen motilitet (110). Det er spekulert i om type IV pili kan være delvis ansvarlig for overflatemotilitet i A. baumannii, men med sprikende resultater (100). Blant annet ble det i A.
baumannii M2 observert at overflatemotiliteten ikke er avhengig av type IV pili (109). En mulig årsak til dette kan potensielt være fasevariasjon, da det i A.baumannii AB5075 er kjent at kolonifasen har stor innvirkning på evnen til overflatemotilitet, hvor «opaque»
kolonifenotype viser bedre overflatemotilitet sammenliknet med «translucent» kolonitype.
Det kan derfor tenkes at de sprikende studiene skyldes at forskere uten å være klar over det har jobbet med forskjellige kolonifaser av A. baumannii (100). Overflatemotiliteten blir påvirket av flere faktorer som lys, tilgang til jern, quorum sensing og syntese av 1,3-
diaminopropan og lipopolysakkarid (110, 111). I referansestammen ATCC17978 reguleres overflatemotilitet av et syklisk-di-GMP signalnettverk (99). Ettersom mange kliniske isolater
19 av A. baumannii utfører overflatemotilitet kan det potensielt være en viktig egenskap í
infeksjonssammenheng (110).
1.5 PilZ-domene proteinet ABUW_2255
Ved hjelp av bioinformatikk-analyser har forskningsgruppen ledet av Ole Andreas Økstad tidligere identifisert alle putative c-di-GMP signaliseringsgener i genomet til
referansestammen A. baumannii AB5075-UW (Michael Goul Larsen, ikke publisert).
ABUW_2255 koder for et protein som består av 113 aminosyrer og som inneholder et PilZ- domene (figur 1.5.1) som strekker seg fra aminosyrenummer 11 til 75 (figur 1.5.1). Predikert funksjon for proteinet basert på likhet til andre proteiner er som et syklisk-di-GMP bindende effektorprotein (112). Et transposon insersjonsbibliotek er tilgjengelig fra University of Washington (Colin Maoil) for stammen A. baumannii AB5075 (113), og en tidligere masterstudent fant ved screening med ulike antibiotika at en insersjonsmutant (AB5075- Δ05917) i genet med locus tag ABUW_2255 var minimum fire ganger mer følsomt for aminoglykosidet amikacin relativt til villtype (112).
Transposon insersjonen i mutanten AB5075-Δ05917 er markert med tallet 17 over pilen i figur 1.5.1, og er satt inn i en plassering i ABUW_2255 tilsvarende kodonet for metionin 104 (M104). Transkripsjonsstopp som følger av denne insersjonen gjør at metionin (og alle etterfølgenede aminosyrer) presumptivt ikke er funksjonelle i denne mutanten. Tilsvarende er insersjonsmutant AB5075-Δ05916 markert med 16 i figur 1.5.1, og er satt inn i kodonet for serin 105 (S105). Insersjonsmutant AB5075- Δ05915 er markert med 15 i figur 1.5.1, og er satt inn før kodonet for tyrosin 111 (Y111).
Figur 1.5.1 Proteinsekvensen til ABUW_2255 viser et 113 aminosyrer langt protein med et pilZ- domene (i grønt). Svarte piler i proteinets C-terminale ende peker på aminosyrene hvor transposon insersjonsmutanter er satt inn i det tilsvarende kodonet i DNA. Figuren er hentet fra et InterPro sekvenssøk (114).
20
1.5.1 PilZ-domene proteiner
På midten av 2000-tallet ble PilZ-domenet identifisert som et effektorprotein som binder c-di- GMP (44). Mange studier av forskjellige PilZ-domene proteiner har bekreftet domenets evne til å binde c-di-GMP og kontrollere en rekke c-di-GMP-regulerte prosesser. PilZ-domenet binder c-di-GMP gjennom gitte sekvensmotiver kalt RXXXR og [D/N]hSXXG, der h er en hydrofob aminosyre, og noen PilZ-domener mangler disse bindingssekvensene, og er ikke i stand til å binde c-di-GMP (115). I ABUW_2255 er det identifisert partielle
bindingssekvenser, men c-di-GMP binding til ABUW_2255 PilZ-domene er ennå ikke undersøkt ved funksjonelle eksperimenter.
Mange forskjellige PilZ-domene proteiner binder c-di-GMP, noe som gir et stort mangfold i effekter påvirket av domenet. I K. pneumoniae er det identifisert at et protein med PilZ-
domene som er involvert i dannelsen av biofilm, og PilZ-domene proteiner er også observert å kontrollere motilitet i enterobakterier (116, 117). PilZ er funnet å være involert i regulering av biofilmdannelse, motilitet og virulens i Vibrio cholerae (118). I P. aeruginosa er PilZ-domene protein indentifisert som essensielt for type IV pilus dannelse og twitching motilitet (119).
Den cellulære funksjonen til mange proteiner med PilZ-domene er imidlertid ikke kjent.
21
1.6 Mål med studiet
Målet med dette studiet var å undersøke en mulig sammenheng mellom c-di-GMP-
signalisering og antimikrobiell resistens, samt andre mulige c-di-GMP regulerte egenskaper i A. baumannii, ved å kartlegge funksjonen til det putative c-di-GMP signaliserings-genet ABUW_2255, som koder for et PilZ-domene protein. Det ble tatt utgangspunkt i å undersøke om innføringen av insersjonsmutanter i ABUW_2255 ville påvirke utvalgte egenskaper hos A.
baumannii, som dannelse av biofilm, twitching motilitet og overflatemotilitet, som er kjente egenskaper knyttet til c-di-GMP signalisering. Et hovedmål med studiet var dessuten å bekrefte den tidligere observasjonen av nedsatt antimikrobiell resistens mot amikacin i insersjonsmutanten AB5075- Δ05917, og å undersøke effekten på antimikrobiell resistens for to andre tilgjengelige insersjonsmutanter i ABUW_2255, samt å inkludere flere
aminoglykosid antibiotika i analysene. Det var også ønskelig å studere eventuelle endringer i ekspresjon av ABUW_2255 ved eksponering for aminoglykosidantibiotika i en konsentrasjon tilsvarende ½ MIC.
22
2 Materialer
2.1 Bakteriestammer
Bakteriestammer Opprinnelse
A. baumannii AB5075-UW Klinisk isolat fra menneske A. baumannii ATCC17978 Referansestamme fra ATCC
A. baumannii ABOA113 Klinisk isolat fra blodkultur fra pasient i Norge A. baumannii ABCh50 Miljøisolat fra gulv hos kyllingprodusent i Norge
For A. baumannii AB5075-UW vil heretter bevningen AB5075 brukes. «UW» forteller at det er en lokal variant av stammen lagret i fryser ved University of Washington (Colin Manoil lab) (113).
2.1.1 A. baumannii AB5075 transposon insersjonsmutanter
Locus tag Gen Navn Nukleotidplassering av transposon ABUW_2255 PilZ AB5075-Δ05915 Posisjon 331
ABUW_2255 PilZ AB5075-Δ05916 Posisjon 314 ABUW_2255 PilZ AB5075-Δ05917 Posisjon 312
2.2 Kommersielle kit
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) gDNA Eliminator Mini Spin Columns RNeasy Mini Spin Columns
Collection Tubes (1.5 ml) Collection Tubes (2 ml) Buffer RLT Plus
23 Buffer RW1
Buffer RPE RNase-Free Water
DNeasy Ultraclean Microbial Kit (QIAGEN) PowerBead Tubes, Garnet 100
PowerBead Solution MB Spin Columns Solution SL Solution IRS Solution SB Solution CB Solution EB Collection Tubes
2.3 Reagenser og løsninger
Reagenser og løsninger Leverandør
2-Mercaptoetanol Thermo Fisher Scientific
Aceton Merck
Agar Bacteriological No. 1 Oxoid
Agarose Sigma Aldrich
Amikacin disulfat salt Sigma Aldrich
Etanol Antibac
GelRed Merck
Gentamicin sulfat Sigma Aldrich
Gjærekstrakt Oxoid
Glycerol bidistilled 99,5% VWR
KCl Merck
KH2PO4 Merck
Krystallviolett Sigma Aldrich
MilliQ-vann Millipore
24
Muller Hinton Broth 2 Sigma Aldrich
Na2HPO42H2O Sigma Aldrich
NaCl Sigma Aldrich
RNase Away Surface Decontaminant Merck
Tobramycin sulfat salt Sigma Aldrich
Trypton Oxoid
TSB premix Oxoid
2.4 Løsninger tilberedt i laboratoriet
Amikacin disulfat salt, renhet 73%
19,40 mg og 40,04 ble veid ut og løst i 1 ml MQ-vann til konsentrasjoner på 14,16 mg/ml og 29,23 mg/ml. Løsningene ble alikvotert og oppbevart ved -20°C.
Gentamicin sulfat, renhet 60%
16,68 mg og 40,88 mg ble veid ut og løst i 1 ml MQ-vann til konsentrasjoner på 10,01 mg/ml og 24,53 mg/ml. Løsningene ble alikvotert og oppbevart ved -20°C.
Tobramycin sulfat salt, renhet 68,6%
17,60 mg og 40,52 mg ble veid ut og løst i 1 ml MQ-vann til konsentrasjoner på 12,07 mg/ml og 27,80 mg/ml. Løsningene ble alikvotert og oppbevart ved -20°C.
Phosphate-buffered saline (PBS)
32 g NaCl, 0,8 g KCl, 1,08 g KH2PO4 og 7,12 g Na2HPO42H2O veid ut og 3950 ml MQ-vann ble målt opp med målesylinder og tilsatt kolben. Løsningen ble satt på magnetrøring i 1 time.
pH ble målt til 7,4. Løsningen ble alikvotert og oppbevart i romtemperatur.
Aceton:etanol(1:4)
100 ml aceton og 300 ml etanol ble målt opp i målesylinder og deretter tilsatt en 500 ml flaske. Løsningen ble oppbevart i tett glassflaske ved romtemperatur.
25 Glyserol 50%
100,5 ml glyserol (99,5%) ble tilsatt 99,5 ml MQ-vann. Løsningen ble autoklavert og oppbevart ved romtemperatur. Sterilfiltrert med sterilfilter 0,2 µm før bruk.
1x konsentrert TAE
20 ml TAE 50x ble tilsatt til en 1000 ml kolbe og fylt opp til 1000 ml med MQ H2O.
Agarosegel 1%
0,3 g agarosepulver ble tilsatt 30 ml 1xTAE buffer i en 250 ml erlenmeyerkolbe.
Agarosepulveret ble oppvarmet i mikrobølgeovn og oppløst.
Krystallviolett 0,3%
0.3 g krystallviolet («Methyl violet») ble veid ut, destillert vann ble tilsatt til 100 ml.
Løsningen ble satt på røring med magnetrører over natten og deretter sterilfiltrert. Løsningen ble lagret tildekket med aluminiumsfolie ved romtemperatur.
2.5 Vekstmedier
Mueller Hinton Broth (MHB) medium
22 g Mueller Hinton Broth 2 ble veid ut og det ble tilsatt til 1000 ml med destillert vann.
Løsningen ble alikvotert, autoklavert og lagret ved romtemperatur.
Lysogeny Broth (LB) agar
10 g tryptone, 5 gram gjærekstrakt, 10 g NaCl, 12,5 gram Agar bacterial no. 1 ble veid ut og det ble tilsatt til 1000 ml med destillert vann. Løsningen ble autoklavert.
Lysogeny Broth (LB) medium
10 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 10 g NaCl ble veid ut og destillert vann ble tilsatt til 1000 ml.
Løsningen ble autoklavert og lagret ved romtemperatur.
26
Tryptic Soy Broth (TSB) medium
9 gram TSB premix ble veid ut og tilsatt 300 ml destillert vann. Løsningen ble autoklavert og lagret ved romtemperatur.
LB agar 0,3%
LB agar ble smeltet i mikrobølgeovn, før 100 ml ble tilsatt 300 ml flytende LB og blandet godt ved at flasken ble vendt opp og ned gjentatte ganger.
Agarosemedium
1,5 g tryptone, 0,75 g NaCl og 1,5 g agarose ble veid ut, tilsatt til 150 ml destillert ved vann.
Løsningen ble autoklavert.
2.6 Utstyr og apparatur
Utstyr og apparatur Leverandør
Aluminiumsfolie VWR
Analysevekt Sartorius
Arbeidslampe Biltema
Autoklav HMC Europe
Elektroforeseapparat Bio-rad
Eppendorfrør 1,5 ml Eppendorf
Erlenmeyer kolbe VWR
Falconrør 50 ml Sarstedt
Frysebeholder for eppendorfrør for -20°C fryser
Sigma-Aldrich Frysebeholder for eppendorfrør for -80°C
fryser
Thermo Fisher Scientific
Gassbrenner Integra Biosciences
GelDoc XR+ Bio-rad
Glassflasker, diverse størrelser Thermo Fisher Scientific
Inkubator MaxQ 6000 Thermo Fisher Scientific
27 Inkubator C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific
Inokuleringsøser Thermo Fisher Scientific
Kyvetter VWR
LAF-benk HeraSafe KS Thermo Fisher Scientific
Mediumsflaske 30 ml Thermo Fisher Scientific
Mikrobølgeovn Cooktronic 7915 Philips
Mikroskop, Stemi 305 Zeiss
Multikanalpipette Rainin
Oppbevaringsbokser Sistema
Overskålsvekt Heco laboratorieutstyr
Parafilm Bemis
Petriskål Sarstedt
Pipetboy Integra Biosciences
Pipetter, diverse størrelser Rainin, Thermo Fisher Scientific Pipettespisser diverse størrelser, med filter Thermo Fisher Scientific
Pipettespisser diverse størrelser, uten filter Rainin
Plateleser Clariostar BMG-labtech
Precellysrør Saveen Werner
Magnetrører IKA Laboratory Equipment
Semipermeabel film Thermo Fisher Scientific
Sentrifuge Biofuge Heraeus
Sentrifuge Mikro 200 Hettich
Sentrifuge Precellys 24 Bertin
Spektofotometer model 7205 Jenway
Spektrofotometer UV5Nano Mettler Toledo Sprøyte 50 ml til sterilfiltrering Henke-Sass Wolf
Sterilfilter 0,2 µm GE Healthcare
Tannpirkere Jordan
Utstrykningspinne Thermo Fisher Scientific
Varmebad Thermolab GFL
Vortex mikser IKA Laboratory Equipment
28
3 Metoder
A. baumannii er klassifisert som en risikogruppe 2-organisme og alt laboratoriearbeid ble derfor håndtert med biologisk sikkerhetsnivå 2-forholdsregler. Laboratoriearbeidet beskrevet ble utført i vertikal laminær luftstrøm-benk på biosikkerhet nivå 2 laboratorium.
Tilberedning av over natt-kulturer
Alle over natt-kulturer (ONK) ble laget ved å inokulere én enkeltkoloni fra ønsket bakteriestamme eller mutant i 5 ml Mueller Hinton Broth (MHB). Med mindre annet er presisert, ble kolonien overført til en 30 ml-mediumflaske. Kulturen ble inkubert i 16-20 timer ved 37°C med risting på 180 rpm.
3.1 Bestemmelse av minimum inhiberende konsentrasjon
Minimum inhiberende konsentrasjon ble målt for å finne den minste konsentrasjonen som kreves av et antimikrobielt middel for å hemme vekst av bakterien. MIC brukes til å måle bakteriens resistens mot antimikrobielle midler (120). «Broth micro-dilution» ble brukt som metode for å bestemme MIC. Løsninger av antibiotika ble tillaget som beskrevet tidligere i seksjon 2.4. Bestemmelse av MIC ble utført for AB5075 (villtype), AB5075-Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917.
Konsentrasjonene som ble benyttet for antibiotikaene tobramycin og amikacin var basert på informasjon om MIC-verdier fra tidligere studier på A. baumannii AB5075 (121, 122). For gentamicin er konsentrasjonen basert på MIC-verdier fra andre multiresistente stammer av A.
baumannii, da denne ikke var bestemt for A. baumannii 5075 (123). Tabell 4.1.1 viser MIC- verdier hentet fra tidligere studier for A. baumannii AB5075 for tobramycin, amikacin og gentamicin.
29 Tabell 3.1.1. MIC-verdier for A. baumannii AB5075 for antibiotikaene amikacin, gentamicin og tobramycin fra tidligere studier. * viser til at konsentrasjonen er basert på MIC-verdier fra andre multiresistente stammer av A. baumannii. For hver antibiotika er testmetoden spesifisert. Verdiene er hentet fra tidligere studier av stipendiat Claus Michael Goul Larsen.
Antibiotika MIC (µg/mL) Testmetode Referanse
Amikacin 32 «Broth microdilution» (122)
Gentamicin* 128 E-test (123)
Tobramycin 48-64 E-test (121)
Tilberedning av bakteriekulturer
På forhånd var AB5075, AB5075-Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917 strøket ut på LB-skåler fra frysestocks oppbevart ved -80°C. ONK ble laget fra skålene etter metode tidligere beskrevet. Det ble så målt optisk tetthet (OD) med bølgelengde 600 nm av samtlige fire bakteriekulturer, og før de ble fortynnet med MHB til OD600=0,1. Fortynningen ble gjennomført for at kulturen skulle være innenfor området av celletetthet som sikrer lineær sammenheng mellom optisk tetthet og celleantall (0,1-1), med en omtrentlig konsentrasjon på 5x105 CFU/ml som er ønsket i broth microdilution testing (120, 124).
Tilberedning av 96-brønners plate
I forsøket ble det brukt mikrotiterplater med 96 brønner. En stor plate tillater undersøkelse av flere stammer og ulike konsentrasjoner av flere antibiotika i det samme forsøket. Ved hjelp av multipipette ble det tilsatt 100 µl MHB i rad A-G og rad H5-H12, mens 200 µl MHB ble tilsatt rad H1-H4. H1-H4 var negativ kontroll, og H5-H12 var positiv kontroll (PK) tabell 3.1.1. Basert på MIC-verdier tilhørende AB5075 fra tidligere studier (121-123) ble det tilsatt et volum amikacin i brønn A1, A4, A7 og A10 som ga en konsentrasjon på 2048 µg/mL.
Volumet ble bestemt ut fra konsentrasjonen til amikacinløsningen tilberedt for forsøket.
Tilsvarende ble det pipettert et gitt volum av gentamicin til brønn A2, A5, A8 og A11, og et gitt volum av tobramycin ble pipettert i brønn A3, A6, A9 og A12. Deretter ble det tilsatt MHB til hele rad 1, slik at totalvolumet av hver enkelt brønn ble 200 µl. Oppsettet er vist i tabell 3.1.1. Det ble så utført en 2-ganger seriefortynning av hver antibiotika, slik at
konsentrasjonen av antibiotika avtok nedover i platen. Innholdet i rad A ble blandet ved hjelp
30
av multikanalpipette, før 100 µl ble overført til rad B. Her ble innholdet tilsvarende blandet før 100 µl ble overført til rad C. Dette ble gjentatt til rad G, hvor 100 µl ble tatt ut og kastet.
Ved hjelp av multikanalpipette ble 100 µl fortynnet bakteriekultur av AB5075-Δ05915 tilsatt rad A-G, kolonne 1-3 for eksponering av antibiotika, og til rad H5-H6 for positiv kontroll.
Tilsvarende ble det pipettert 100 µl fortynnet bakteriekultur av AB5075-Δ05916 i rad A-G, kolonne 4-6 og til rad H7-H8. 100 µl fortynnet bakteriekultur fra AB5075-Δ05917 ble tilsatt rad A-G, kolonne 7-9 og til rad H9-H10. 100 µl fortynnet bakteriekultur AB5075 ble tilsatt rad A-G, kolonne 10-12 og til rad H11-H12. Samtlige bakteriekulturer var fortynnet til OD600=0,1. En semipermeabel film ble lagt over hele platen. Filmen hindret fordamping uten å miste oksygentilførsel til brønnene. Platen ble så plassert i en lukket beholder og satt til inkubering i 16-20 timer ved 37°C med risting på 180 rpm.
Tabell 3.1.2 Oppsett for 96-brønners plate for MIC-testing for A. baumannii AB5075, AB5075- Δ05915, AB5075-Δ05916 og AB5075-Δ05917, med konsentrasjon av den gitte antibiotikaen i kolonnene. AMI=Amikacin, GEN=gentamicin og TOB=tobramycin. Alle konsentrasjoner oppgis i µg/ml.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AB5075-Δ05915 AB5075-Δ05916 AB5075-Δ059157 AB5075
A AMI
2048
GEN 2048
TOB 2048
AMI 2048
GEN 2048
TOB 2048
AMI 2048
GEN 2048
TOB 2048
AMI 2048
GEN 2048
TOB 2048
B AMI
1024
GEN 1024
TOB 1024
AMI 1024
GEN 1024
TOB 1024
AMI 1024
GEN 1024
TOB 1024
AMI 1024
GEN 1024
TOB 1024
C AMI
512
GEN 512
TOB 512
AMI 512
GEN 512
TOB 512
AMI 512
GEN 512
TOB 512
AMI 512
GEN 512
TOB 512
D AMI
256
GEN 256
TOB 256
AMI 256
GEN 256
TOB 256
AMI 256
GEN 256
TOB 256
AMI 256
GEN 256
TOB 256
E AMI
128
GEN 128
TOB 128
AMI 128
GEN 128
TOB 128
AMI 128
GEN 128
TOB 128
AMI 128
GEN 128
TOB 128
F AMI
64
GEN 64
TOB 64
AMI 64
GEN 64
TOB 64
AMI 64
GEN 64
TOB 64
AMI 64
GEN 64
TOB 64
G AMI
32
GEN 32
TOB 32
AMI 32
GEN 32
TOB 32
AMI 32
GEN 32
TOB 32
AMI 32
GEN 32
TOB 32
H NK NK NK NK PK
Δ05915 PK Δ05915
PK Δ05916
PK Δ05916
PK Δ05917
PK Δ05917
PK AB5075
PK AB5075
