TREBALL DE FI DE GRAU
ESTUDI DE LA IMPLICACIÓ DELS MITOCONDRIS EN TÈCNIQUES DE REPRODUCCIÓ ASSISTIDA
Joana Florit Homar
Grau de Bioquímica Facultat de Ciències
Any acadèmic 2020-21
ESTUDI DE LA IMPLICACIÓ DELS MITOCONDRIS EN TÈCNIQUES DE REPRODUCCIÓ ASSISTIDA
Joana Florit Homar
Treball de Fi de Grau Facultat de Ciències
Universitat de les Illes Balears
Any acadèmic 2020-21
Paraules clau del treball:
ADN mitocondrial, mitocondri, oòcit, heteroplàsmia, reproducció assistida, fecundació in vitro, líquid fol·licular, biomarcador
Nom del tutor / la tutora del treball: Laura Torres Juan
Nom del tutor / la tutora (si escau)
Autoritz la Universitat a incloure aquest treball en el repositori institucional per consultar-lo en accés obert i difondre’l en línia, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació
Autor/a Tutor/a Sí No Sí No
☒ ☐ ☒ ☐
3
Resum
Els mitocondris són els únics orgànuls animals amb genoma propi que codifica per 37 gens essencials per les seves funcions. Entre aquestes cal destacar la producció d'ATP, que en el context del desenvolupament embrionari es troba relacionada amb la viabilitat de l’embrió. Els mitocondris són d'herència materna, de manera que el contingut als oòcits serà clau per l'embrió. Durant els processos reproductius existeixen diferents mecanismes que permeten evitar l’heteroplàsmia en l’embrió, és a dir, la presència de més d’una variant d’ADN mitocondrial, ja que s’ha vist que pot afectar al seu metabolisme. Estudis previs han demostrat que el procés de reproducció assistida pot tenir efectes negatius sobre l'oòcit ja que durant la fase d'estimulació ovàrica es genera estrès oxidatiu, que pot afavorir l’aparició de possibles mutacions a l’ADN mitocondrial. L'estreta relació entre els mitocondris i la reproducció han conduit a proposar l'ADN mitocondrial present en líquid fol·licular com a possible biomarcador no invasiu per a la selecció dels embrions en tècniques de reproducció assistida. En el present estudi, es recullen evidències bibliogràfiques al respecte, associant-se un augment en la concentració d’ADN mitocondrial en el líquid fol·licular amb una menor viabilitat del futur embrió. Així, s’ha realitzat l’extracció i quantificació d’ADN a partir de líquid fol·licular i l’amplificació per PCR de regions específiques de l’ADN mitocondrial, comprovant la seva presència en aquest fluid. De la mateixa manera, s’ha avaluat l’efecte de la centrifugació prèvia de les mostres, demostrant que es perd una part del contingut en àcids nucleics circulants en líquid fol·licular. Aquest treball estableix les bases per a la posterior seqüenciació de l’ADN mitocondrial en sang i en líquid fol·licular de pacients abans i després de l’estimulació ovàrica, respectivament, per avaluar els canvis en l’ADN mitocondrial causats per aquest procés.
Abstract
Mitochondria are the only animal organelles with their own DNA. In this genome, 37 essential genes are encoded, being all of them necessary to maintain a correct function of the organelle. These functions include ATP production, which in the context of embryonic development is related to the viability of the embryo. Mitochondria are maternally inherited, so their content in oocytes will be key for the embryo.During reproductive processes, there are different mechanisms to avoid heteroplasmy in the embryo, that is the presence of more than one variant of mitochondrial DNA, as this has been shown to affect its metabolism.Previous studies have shown that the process of assisted reproduction can have negative effects on the oocyte, as oxidative stress is generated during the ovarian stimulation phase, which can favour the appearance of possible mutations in the mitochondrial DNA. The close relationship between mitochondria and reproduction has led to the proposal of mitochondrial DNA present in follicular fluid as a possible non-invasive biomarker for embryo selection in assisted reproduction techniques.In this study, bibliographic evidence is collected in this regard, associating an increase in the concentration of mitochondrial DNA in the follicular fluid with a lower viability of the future embryo. Thus, DNA extraction and quantification from follicular fluid and PCR amplification of specific regions of mitochondrial DNA have been carried out, proving its presence in this fluid.In the same way, the effect of pre-centrifugation of samples has been evaluated, showing that a fraction of the circulating nucleic acid content in follicular fluid is lost. This work establishes the basis for subsequent sequencing of mitochondrial DNA in blood and follicular fluid from patients before and after ovarian stimulation, respectively, to assess the changes in mitochondrial DNA caused by this process.
4
Índex
Introducció ... 5
Característiques generals dels mitocondris ... 5
Mitocondris i ADN mitocondrial en els gàmetes ... 7
Importància dels mitocondris en la reproducció humana ... 9
Heteroplàsmia i mecanismes biològics que permeten evitar-la ... 11
Tecnologies de reproducció assistida ... 14
Hipòtesis ... 14
Objectius ... 14
Materials i mètodes ... 15
Metodologia de recerca bibliogràfica ... 15
Posta a punt de la tècnica d’extracció d’ADN lliure circulant en líquid fol·licular ... 17
Extracció i quantificació d’ADN en líquid fol·licular i en sang ... 20
Resultats ... 22
Efecte del tractament de reproducció assistida sobre la funció mitocondrial ... 22
ADN mitocondrial lliure circulant en líquid fol·licular com a biomarcador ... 23
Efectivitat de l’extracció d’ADN lliure circulant en líquid fol·licular amb el kit Qiagen... 24
Discussió ... 27
Conclusions ... 31
Bibliografia... 32
5
Introducció
Característiques generals dels mitocondris
Els mitocondris són orgànuls cel·lulars semiautònoms que ocupen aproximadament un 20% del volum citoplasmàtic de la cèl·lula eucariota normal. 1,2 Evolutivament, es considera que deriven de bacteris endosimbionts aeròbics. 1,3,4 Aquest fet justifica que presentin genoma propi, sent l’únic orgànul animal amb aquesta característica. 3,4
L’origen bacterià explica també algunes característiques de la seva estructura, com la presència d’una doble membrana, externa i interna, amb propietats i funcions diferents (Figura 1). 1,5 La membrana interna es troba aplegada formant les crestes mitocondrials, on es localitzen els complexes implicats en la cadena de transport d’electrons o cadena respiratòria. Es tracta d’una membrana impermeable, a excepció del pas de protons, ions fosfat, ADP i ATP que travessen per mitjà de transportadors específics. Les crestes envolten un component intern que rep el nom de matriu mitocondrial, on es troba l’ADN mitocondrial, així com un elevat nombre d’enzims implicats en el metabolisme cel·lular. 1 L’espai limitat entre les dues membranes, interna i externa, es denomina espai intermembrana i presenta el mateix pH i composició iònica que el citoplasma, a causa de la permeabilitat característica de la membrana externa, que permet el pas de ions i molècules petites. 1
Figura 1
Representació esquemàtica de l’estructura dels mitocondris.
Nota. Il·lustració de l’estructura mitocondrial, on es destaca la membrana mitocondrial interna i externa, així com l’espai transmembrana i la matriu. S’indica la presència d’ADN mitocondrial a la matriu i es representa la cadena de transport d’electrons a les crestes. Elaborat amb BioRender.com.
Els mitocondris són orgànuls dinàmics, que generalment es troben associats als microtúbuls del citoesquelet cel·lular, podent associar-se també al reticle endoplasmàtic. 1 En la dinàmica dels mitocondris cal destacar la divisió per fissió i la fusió1, tractant-se de processos complexes que permeten garantir la integritat dels orgànuls. Aquests processos, doncs, són responsables del nombre i de l’aspecte dels mitocondris, que poden ser esfèrics o allargats.
A grans trets, en el procés de fissió actuen GTPases i dinamina, de manera que amb la hidròlisi de GTP, es genera la força necessària per seccionar les membranes mitocondrials, tant interna com externa, en una sola passa. Per altra banda, en el procés de fusió es necessita de la hidròlisi de GTP i d’un
6 gradient de protons per tal d’unir les membranes en dues passes, primerament les externes i a continuació les internes. 1
Els mitocondris estan implicats en funcions de gran importància per la cèl·lula, com la producció d’ATP per fosforilació oxidativa, la regulació de l’apoptosi, la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS), l’oxidació d’àcids grassos, la homeòstasi del calci, etc. 2,5–8
Genoma mitocondrial
Com s’ha comentat abans, els mitocondris són l’únic orgànul animal amb ADN propi, a causa del seu origen bacterià. Amb l’evolució d’aquests, molts gens que eren originalment codificats pel seu genoma s’han transposat al genoma nuclear, motiu pel que s’ha disminuït significativament la seva mida.2,4 Aquest fet també indica que l’ADN nuclear codifica per proteïnes que tenen la seva funció en els mitocondris, de manera que han de presentar una seqüència senyal que permeti el transport des del citosol a l’interior dels orgànuls en qüestió. 1
En els humans, el genoma mitocondrial és ADN de doble cadena constituït per 16,569 kb, que contenen 37 gens essencials per l’obtenció d’energia i pel metabolisme cel·lular (Figura 2). 1,2,9–11 Aquests 37 gens codifiquen per 13 ARNs missatgers (ARNm), 22 ARNs de transferència (ARNt) i 2 ARNs ribosomals (ARNr). 3–5,9,10,12 Els ARNm donen lloc a 13 proteïnes essencials pel correcte funcionament de la cadena de transport d’electrons i per la producció d’ATP. 3,4,10 Tot i així, es requereix de proteïnes codificades pel genoma nuclear per al funcionament de la cadena respiratòria i la fosforilació oxidativa. 3,12
Figura 2
Distribució dels gens sobre la molècula d’ADN mitocondrial.
Nota. S’indica la mida de l’ADN mitocondrial, de 16,569 kb, així com els 37 gens presents, que codifiquen per 13 proteïnes, 22 ARNs de transferència i 2 ARNs ribosomals. Les proteïnes són essencials per la cadena de transport d’electrons i per la producció d’ATP. Adaptat de Mitochondria as a biomarker for IVF outcome, de Kim, J. i Seli, E., 2019, Reproduction vol. 157 R235–R2423. Elaborat amb BioRender.com.
7 El genoma mitocondrial es caracteritza per ser molt compactat i no presentar introns, de manera que pràcticament no conté ADN no-codificant. 1,9 A més, es parla de què aquest genoma presenta una variant del codi genètic diferent a la nuclear, ja que alguns codons iguals es tradueixen de forma diferent. 1
Una altra diferència respecte el genoma nuclear és la susceptibilitat a sofrir mutacions, generalment de tipus puntual o delecions. L’ADN mitocondrial (ADNmt) és més susceptible, concretament 25 vegades més. La major sensibilitat és deguda a la manca de protecció per part d’histones, la falta de mecanismes de reparació i per la proximitat a la cadena de transport d’electrons i, per tant, l’exposició a espècies reactives d’oxigen (ROS). 3,4
Les mutacions de l’ADNmt són de gran importància, sobretot les de tipus deleció, degut a la relació amb nombroses patologies, com la diabetis mellitus de tipus 2 o la neurodegeneració, i amb l’envelliment. 1,4,9 Cal tenir en compte que les mutacions es van acumulant al llarg dels anys, fet que pot agreujar els efectes en teixits que no es trobin en divisió, com els músculs, el cervell o els oòcits. 12
Mitocondris i ADN mitocondrial en els gàmetes
Cèl·lules de diferents teixits presenten diferent quantitat de mitocondris i d’ADN mitocondrial d’acord amb les seves necessitats energètiques, característica que també pot variar al llarg del temps. 4–6 En relació als gàmetes, els oòcits madurs presenten unes 105 còpies d’ADN mitocondrial (un dels continguts cel·lulars més elevats en humans), mentre que en els espermatozoides es parla, aproximadament, de 102 còpies. 3,4,8,9
En els espermatozoides, els mitocondris són essencials per cobrir les necessitats energètiques, per exemple, en la hiperactivació, la capacitació, la reacció de l’acrosoma, etc. Tot i així, és d’especial importància el requeriment energètic per la mobilitat, que s’associa estretament amb la qualitat del gàmeta. S’ha estudiat àmpliament l’efecte de les mutacions sobre l’ADN mitocondrial dels espermatozoides, fet que ha conduït a concloure que l’acumulació d’aquestes té efectes sobre la seva funcionalitat i, per tant, sobre la fertilitat, associant-se a una menor probabilitat d’embaràs. 5
Per altra banda, els mitocondris presents en els gàmetes femenins presenten forma esfèrica amb petites crestes. 4,13 Aquests mitocondris, abans de la fertilització de l’oòcit, es troben en un estat de quiescència, de manera que la transcripció està silenciada i es redueix la producció d’ATP. Es creu que aquest estat apareix per tal de minimitzar les mutacions sobre l’ADN mitocondrial dels oòcits. Una vegada s’ha produït la fertilització es reactiven els mitocondris. 4
Com s’ha comentat, els mitocondris s’obtenen per fissió dels pre-existents. 9 En els humans l’herència mitocondrial és uniparental per part de la mare, de manera que és l’òvul qui aporta els mitocondris al zigot, mentre que els que provenen dels espermatozoides es degraden ràpidament. 1,8,9 Per aquest motiu, l’estat dels mitocondris als òvuls és d’especial importància en el desenvolupament de l’embrió.
8 Desenvolupament dels gàmetes femenins i implicació del líquid fol·licular
El desenvolupament dels gàmetes femenins s’inicia durant l’etapa embrionària i culmina en l’edat adulta. Parteix de les cèl·lules germinals primordials (primordial germ cells, PGCs) que proliferen de forma activa fins entrar en la meiosi. El procés meiòtic queda aturat en la profase I, fins a la pubertat, en la forma coneguda com a oòcit primari.
Una vegada s’arriba a la pubertat, a causa dels canvis hormonals, la primera divisió meiòtica acaba de forma periòdica, de manera que es perd un cos polar, i dona lloc a un oòcit secundari. En aquest moment es dona un nou bloqueig en la metafase II i, només en cas de què es doni la fecundació continuarà la meiosi, alliberant-se un altre cos polar i donant lloc a l’òvul fecundat.
Aquest procés s’acompanya de la gènesi fol·licular, és a dir, del desenvolupament del fol·licle ovàric dins el que madura l’oòcit (Figura 3). Els fol·licles tenen un paper essencial en l’obtenció de competència per part de l’oòcit, destacant la contribució de les cèl·lules del cúmulus (tipus de cèl·lula de la granulosa) i del líquid fol·licular. 14
Figura 3
Ovari femení sobre el que es representa la gènesi fol·licular.
Nota. Representació esquemàtica del desenvolupament del fol·licle, que acompanya les fases de l’oogènesi que tenen lloc durant l’edat adulta. Es destaca l’estructura del fol·licle, indicant la presència en aquest de l’oòcit, cèl·lules de la granulosa i líquid fol·licular. Elaborat amb BioRender.com.
El líquid fol·licular, per la seva part, és produït per les cèl·lules de la granulosa en les darreres fases de desenvolupament del fol·licle secundari. Aquest es troba en contacte amb les cèl·lules del cúmulus i amb l’oòcit, i està compost, principalment, per hormones esteroides, metabòlits, polisacàrids, proteïnes, espècies reactives d’oxigen i antioxidants. El seu contingut concret varia en funció del moment del desenvolupament fol·licular i de l’edat de la dona. 14
Canvis en els components del líquid fol·licular s’associen amb canvis en la qualitat de l’oòcit, el desenvolupament embrionari i l’embaràs. Concretament, els nivells hormonals i la concentració de metabòlits influeixen en la diferenciació de l’oòcit. En aquesta línia, s’han pogut observar diferències hormonals entre dones sotmeses a reproducció assistida i aquelles que no. 14
D’acord amb la interacció que s’estableix entre l’oòcit i la resta de components fol·liculars, s’ha pogut veure que en el líquid fol·licular pot trobar-se ADN mitocondrial lliure, correlacionat amb el potencial de l’oòcit. 15
9 Importància dels mitocondris en la reproducció humana
Canvis mitocondrials en les cèl·lules germinals femenines
Per entendre la importància dels mitocondris en la reproducció humana, cal comprendre abans els canvis en relació als mitocondris que es donen en les cèl·lules germinals femenines.
Com s’ha comentat prèviament, la línia germinal femenina es desenvolupa a partir de cèl·lules germinals primordials que presenten un nombre restringit de mitocondris. 5 En aquestes cèl·lules s’inicia la replicació de l’ADN mitocondrial i continua durant l’oogènesi primerenca, encara que augmenta de forma significativa durant els estadis més avançats de la gènesi fol·licular.4
S’ha pogut observar sobre aquests tipus cel·lulars una restricció i amplificació del contingut d’ADNmt.
16 Aquests canvis van conduir a què es proposés la teoria del coll de botella (bottleneck). D’acord amb aquesta teoria, proposada per Hausworth i Laipis el 1982, a partir de les cèl·lules germinals primordials un nombre determinat i reduït de mitocondris es transmet a cada oòcit. Aquest coll de botella ocorr amb la finalitat de disminuir l’heteroplàsmia en la descendència i afavorir l’homoplàsmia. 5–7
Tot i així, alguns dels mitocondris transferits als oòcits poden presentar, per exemple, ADN mitocondrial mutat. Així doncs, a cada oòcit hi haurà una diferent proporció d’ADN mutat i normal. A causa de la ràpida replicació del genoma dels mitocondris, es produirà un canvi en la freqüència al·lèlica, fet que explicaria la predominança de diferents variants d’ADN mitocondrial entre la descendència d’una mateixa mare. 5–7
A partir del reduït nombre de mitocondris presents en els oòcits una vegada obtinguts a partir de les PGCs, es produeix una amplificació, alhora que augmenta el volum citoplasmàtic. Es parla de 100 còpies d’ADNmt en les PGCs, 200 en les oogònies, 10.000 en els oòcits del fol·licle primordial i 100.000 en l’oòcit madur.5,9 Aquest augment en el nombre s’acompanya de canvis en la seva estructura, que continuen en l’estadi pre-implantacional de l’embrió. 5,13
Així doncs, els oòcits primaris presenten mitocondris amb nombroses crestes transversals, mentre que en els oòcits secundaris presenten una forma arrodonida i amb crestes en forma de columna. En l’ovulació, els mitocondris es caracteritzen per una forma esfèrica, amb poques crestes i la presència de vacúols. En aquests estadis, els mitocondris solen trobar-se al voltant del pronucli. 5,8 Fins a l’estadi de dues cèl·lules de l’embrió, els mitocondris presenten forma dumb-bell i les crestes localitzades de forma concèntrica, mentre que a partir de l’estadi de 4 cèl·lules fins a la formació de la mòrula es caracteritzen per una forma més allargada i crestes transversals. 5
Cal tenir en compte la gran importància de la regulació de la dinàmica dels mitocondris en la maduració de l’oòcit, tant del procés de fusió com de fissió. Per una banda, si, per exemple, s’expressen en una elevada proporció factors de fusió, es poden formar agregats mitocondrials que alterin la formació del fus i, per tant, la divisió cel·lular. Per altra banda, es pot alterar el procés de fissió, per exemple inhibint l’expressió de factors de fissió mitocondrial, fet que interfereix en la senyalització del calci i en la comunicació entre cèl·lules, de manera que apareixen anomalies en el desenvolupament del fol·licle i en l’ovulació. 4
10 Impacte dels mitocondris en el desenvolupament embrionari
Existeixen nombroses evidències de què els mitocondris tenen un paper essencial en el desenvolupament embrionari i en el potencial d’implantació. 8
Per una banda, els mitocondris que provenen de l’oòcit actuen com a font d’ATP en els estadis previs a la implantació, on són necessaris elevats nivells pel correcte desenvolupament.3,4,8 En aquests estadis, la glicòlisi es troba limitada i els mitocondris no es repliquen. Per tant, per poder proporcionar elevats nivells d’ATP a l’embrió, els oòcits presenten més mitocondris dels que són necessaris per la seva maduració, assegurant-se així el correcte desenvolupament embrionari. 4 Cal tenir en compte que elevats nivells d’ATP en els oòcits i en l’embrió es relacionen amb un bon resultat reproductiu. 8 A més, els mitocondris es troben relacionats també amb la senyalització del calci, essencial per l’activació del zigot, ja que s’associa amb la producció d’energia en el moment de la fecundació, i per la modulació del nivell de calci al citosol. 5
També s’ha pogut observar un augment en els nivells d’ADN mitocondrial en oòcits fertilitzats i una major proporció de fracàs de fertilització en oòcits amb baixos nivells d’ADNmt. Aquest fet indica la implicació de l’ADN mitocondrial i, conseqüentment, dels mitocondris en la capacitat de fertilització de l’oòcit. 3–5
Tot i així, algunes fonts indiquen una certa controvèrsia respecte la relació entre els nivells d’ADN mitocondrial i la competència de l’embrió, plantejant que a partir d’un cert nivell, l’ADNmt es relaciona amb aneuploïdies, alteracions en el desenvolupament i errors en la implantació. Es parla, doncs, d’un llindar d’ADN mitocondrial a partir del qual no s’aconsegueix l’embaràs. 3,4
De la mateixa manera que hem parlat del paper beneficiós dels mitocondris en la reproducció, cal posar de manifest que la disfunció mitocondrial es relaciona amb desordres en la segregació cromosòmica, defectes de desenvolupament i taxes elevades d’avortaments involuntaris.4,5,13 Aquesta disfunció mitocondrial es pot presentar, per exemple, en mares diabètiques. 4 Entre les causes de disfunció mitocondrial cal destacar el paper de les mutacions en el seu genoma. 8
Impacte de l’edat materna en els mitocondris i en l’embaràs
La fertilitat humana disminueix de forma significativa a partir dels quaranta anys.17 Així, es considera que la capacitat reproductiva de la dona minva amb l’edat, de la mateixa manera que la reserva ovàrica i els nivells de mitocondris. 3,5 A més, també s’associa l’edat avançada de la mare amb un augment de les aneuploïdies del fetus (Figura 4). 18
Estudis moleculars indiquen que les aneuploïdies, en general, són causades per defectes en la segregació cromosòmica durant la primera divisió meiòtica dels gàmetes femenins, destacant els casos en què es dona la degradació de la cohesina, essencial per la correcta recombinació cromosòmica. 18,19 S’han trobat evidències de què l’edat materna no afecta igual a tots els cromosomes, sinó que es poden establir 3 relacions diferents: que existeixi una relació lineal entre l’augment de l’edat materna i l’augment en la incidència d’aneuploïdies; que existeixi una relació exponencial entre l’augment de l’edat materna i l’augment en la incidència d’aneuploïdies, i que l’edat materna tengui un efecte molt suau en la incidència d’aneuploïdies. Els motius pels quals varien els efectes de l’edat materna en els diferents cromosomes no estan completament dilucidats. 20
11 Figura 4
Incidència de diferents tipus d’aneuploïdia d’acord amb l’edat materna.
Nota. Representació de la incidència de diferents tipus d’aneuploïdies (extremes, complexes, no-disjunció de cromosoma o no-disjunció de cromàtide) d’acord amb l’edat materna. Es poden observar canvis significatius en el cas de les aneuploïdies de cromosoma i cromàtide, que augmenten així com ho fa l’edat materna. Extret de Effect of maternal age on the frequency of cytogenetic abnormalities in human oocytes, de Pellestor, F., Anahory, T. & Hamamah, S., 2005, Cytogenetic and Genome Research vol. 111, 206–212.18
En referència als mitocondris, s’ha pogut veure que l’edat avançada s’associa amb canvis estructurals com la inflor dels mitocondris, l’aparició de vacuoles i l’alteració de les crestes, i amb canvis en l’activitat, de manera que no es pot generar la quantitat suficient d’ATP. Alguns estudis indiquen també que amb l’augment de l’edat materna i la disminució de la reserva ovàrica, augmenten els nivells d’ADN mitocondrial, fet que s’entén com un mecanisme compensatori i es relaciona amb les aneuploïdies. 3,5 S’associa també a l’envelliment l’acumulació de mutacions en la regió control de la replicació o loop D del genoma mitocondrial. Es considera que aquestes regions són més susceptibles a sofrir mutacions per ROS. 12
Així doncs, l’edat avançada de la mare pot relacionar-se amb una menor qualitat de l’oòcit, un increment d’aneuploïdies i l’aparició de mutacions en l’ADN mitocondrial, augmentant la possibilitat d’heteroplàsmia en la descendència. 4,5,8
Heteroplàsmia i mecanismes biològics que permeten evitar-la Definició, causes i impacte fisiològic
L’heteroplàsmia consisteix en la presència de dues o més variants d’ADN mitocondrial en la cèl·lula.
Pot ser deguda a la mutagènesi, a la presència d’ADN mitocondrial patern, a l’ús de tecnologies mèdiques per evitar la transmissió de patologies relacionades amb l’ADN mitocondrial, a la presència d’ADN mitocondrial de tercers en programes de reproducció assistida, etc. 10,21,22
Aquest fenomen afecta al metabolisme de l’embrió, al fitness cel·lular i a la generació de cèl·lules pluripotents (iPCS), tractant-se d’un problema biològic associat a patologies. 4,10
És important tenir en compte el tipus de mutació responsables de l’heteroplàsmia per conèixer l’abast de les seves conseqüències i com afecta a la fosforilació oxidativa. 4,21 En estudis amb ratolins s’ha pogut relacionar amb defectes cognitius i amb un fenotip similar al síndrome metabòlic. 4 Com s’ha
12 comentat abans, s’han trobat evidències de què les mares d’edat avançada solen transmetre més heteroplàsmies. 6
Tot i així, cal destacar que l’heteroplàsmia no sempre es troba associada a alteracions i malalties, sinó que, per exemple, si parlam d’heteroplàsmia per variants que es diferencien en una mutació silenciosa en el loop D, aquesta circumstància no tendrà efectes sobre la salut. 21
Mecanismes biològics per evitar l’heteroplàsmia
Durant els processos reproductius s’activen mecanismes que permeten evitar l’heteroplàsmia, entre els que destaquen els que permeten que l’herència mitocondrial sigui uniparental per part de la mare.
Cal tenir en compte que en el procés de fertilització entren a l’oòcit mitocondris de l’espermatozoide, però, encara així, nombrosos estudis indiquen que a partir de l’estadi de 4 cèl·lules ja no es poden detectar els mitocondris del pare en l’embrió.3,4,8,10 S’han plantejat nombrosos mecanismes que possiblement s’hi troben relacionats. 8
Un dels mecanismes proposats, sent el més acceptat, és el proteolític basat en el marcatge amb ubiqüitina. Durant l’espermatogènesi, els mitocondris dels espermatòcits secundaris es marquen amb ubiqüitina, un marcador de proteòlisi. Tot i així, aquest marcatge queda amagat durant la maduració a l’epidídim degut a la formació de ponts disulfur. Després de la fertilització, agents reductors presents al citoplasma de l’oòcit, principalment el glutatió i possiblement co-factors ooplasmàtics, rompen els ponts disulfur, de manera que es torna a mostrar el marcatge per a la degradació per la via proteasomal. Es tracta, doncs, d’un mecanisme de degradació activa. 2,4,8,9,22,23
També s’ha proposat el mecanisme de mitofàgia lisosomal ooplasmàtica després de la fertilització, en què les hidrolases lisosomals s’encarreguen de la degradació. 8,22 Es contempla, a més, la dilució passiva de l’ADN mitocondrial patern en la totalitat de l’ADN mitocondrial matern, a causa de la desproporció entre el nombre d’orgànuls en els gàmetes de tots dos progenitors. 2,5,9,23 Altres estudis plantegen el segrest de l’ADN mitocondrial de l’espermatozoide a regions diferents a la massa cel·lular interna, generalment a teixits extraembrionaris. 2,3,22
L’herència d’ADN mitocondrial patern s’ha observat només en patologies rares que afecten a humans.
St John et al. van presentar un estudi que indicava un lligam entre l’herència del genoma mitocondrial patern i la baixa qualitat dels oòcits. 23
Més enllà de l’impacte fisiològic de l’heteroplàsmia, és de gran importància la destrucció dels mitocondris paterns. Aquest fet és degut a què, tot i els mecanismes apoptòtics per reduir el nombre de cèl·lules germinals i el control de qualitat a l’epidídim, espermatozoides defectuosos poden trobar- se en l’ejaculació i no ser eliminats pels filtres naturals de l’aparell reproductor femení. S’ha pogut observar que, en general, els espermatozoides presenten una elevada proporció de delecions i mutacions en l’ADN mitocondrial, degut a la important exposició a radicals lliures d’oxigen durant l’espermatogènesi. 3,4,22
Altres mecanismes per fer front a l’heteroplàsmia es relacionen amb la predominança d’una variant o en la selecció dels oòcits. En aquesta àrea cal destacar la importància del coll de botella, ja que en certa manera permet reduir l’heteroplàsmia en les cèl·lules per mitjà de la segregació dels mitocondris de les cèl·lules germinals primordials als oòcits i la posterior replicació. 4,6,24
13 El coll de botella en l’ADN mitocondrial podria donar-se per mitjà de 3 possibles mecanismes: la reducció passiva, l’empaquetament de l’ADNmt en clústers homoplàsmics i la replicació focal d’ADNmt, a partir de la selecció de subpoblacions mitocondrials (Figura 5). De la mateixa manera, s’han proposat 3 possibles mecanismes de selecció mitocondrial: la mitofàgia, que consisteix en l’eliminació dels mitocondris que acumulen variants mutades per autofàgia; la selecció a nivell mitocondrial, que permet l’eliminació de mitocondris amb elevats nivells de mutació; i la selecció a nivell cel·lular, que consisteix en l’eliminació de les cèl·lules que contenen una elevada proporció d’orgànuls defectuosos (Figura 6). 6
En general, doncs, s’associa el coll de botella amb l’eliminació d’ADNmt defectiu i la proliferació d’una variant preferent. 2
Figura 5
Possibles mecanismes de coll de botella de l’ADN mitocondrial.
Nota. Es representen en verd les molècules d’ADN mitocondrial que no han sofert alteracions i en vermelles aquelles que presenten mutacions perjudicials. (A) Reducció passiva, l’ADNmt es segrega de forma estocàstica. (B) Empaquetament de l’ADNmt en clústers homoplàsmics. (C) Replicació focal, a partir de la selecció d’una subpoblació d’ADNmt. Adaptat de The mitochondrial DNA genetic bottleneck: inheritance and beyond, Zhang, H., Burr, S. P. i Chinnery, P. F., 2018. Essays in Biochemistry vol. 62, 225–2346. Elaborat amb BioRender.com.
Figura 6
Possibles mecanismes de selecció mitocondrial associats al coll de botella.
Nota. Es representen en verd els mitocondris sans i en vermell els mitocondris amb elevats nivells de mutacions perjudicials en l’ADN mitocondrial. (A) Mitofàgia dels mitocondris amb mutacions perjudicials després de la fissió. (B) Selecció a nivell mitocondrial, de manera que són eliminats per mitofàgia/autofàgia. (C) Selecció a nivell cel·lular, descartant les cèl·lules altament afectades per les mutacions mitocondrials. Adaptat de The mitochondrial DNA genetic bottleneck: inheritance and beyond,Zhang, H., Burr, S. P. i Chinnery, P. F., 2018. Essays in Biochemistry vol. 62, 225–2346. Elaborat amb BioRender.com.
14 Tecnologies de reproducció assistida
Les tecnologies de reproducció assistida (ART) s’empren com a tractament de la infertilitat, per part de qualsevol dels dos sexes. La reproducció in vitro (FIV) és la tècnica més àmpliament emprada, encara que també existeix la inseminació intrauterina (IUI) i l’ART amb intervenció de tercers. 25,26
La fecundació in vitro consisteix en la unió de l’òvul i l’espermatozoide fora del cos humà, al laboratori, per a la posterior introducció en l’úter femení. Es duu a terme en 5 passes: estimulació o superovulació, retirada de l’òvul, inseminació i fecundació, cultiu de l’embrió, i transferència de l’embrió a l’úter. 27 El procés d’estimulació ovàrica pretén aconseguir una superovulació, és a dir, la maduració de diversos fol·licles alhora, obtenint així un elevat nombre d’oòcits madurs en un mateix moment. Aquesta passa consisteix en l’administració d’hormones a la dona, en general de gonadotropines i anàlegs de l’hormona alliberadora de gonadotropines (GnRH). Primerament es duu a terme la supressió hipofisiària, a partir de l’administració d’anàlegs de la GnRH, bloquejant el flux hormonal entre la hipòfisi i els ovaris. Tot seguit s’administren gonadotropines per sincronitzar el desenvolupament de diversos fol·licles i, finalment, s’injecta un fàrmac que conté gonadotropina coriònica humana, que permet la maduració dels oòcits presents a l’interior dels fol·licles. 28
Es tracta d’un tractament, en certa manera, agressiu, que podria relacionar-se amb l’aparició de majors nivells d’heteroplàsmia. A més, cal tenir en compte que la fecundació in vitro s’empra, entre altres casos, en mares d’edat avançada o dones amb baixa fertilitat 28, circumstàncies que, així com s’ha comentat prèviament, en moltes ocasions es troben lligades a casos d’heteroplàsmia.
Hipòtesis
- La sobrestimulació hormonal pròpia de la fecundació in vitro afecta a la funció mitocondrial, fet que pot conduir a l’aparició de mutacions en l’ADN mitocondrial (heteroplàsmia).
- Es pot recórrer a l’estudi de l’ADN mitocondrial lliure en el líquid fol·licular per avaluar l’impacte de la sobrestimulació i la viabilitat de l’embrió, emprant l’ADN mitocondrial lliure com a biomarcador per a la selecció embrionària en processos de reproducció assistida.
Objectius
Aquest treball s’emmarca dins el projecte “Determinació en líquid fol·licular d’alteracions en el mitogenoma en pacients sotmeses a tractaments de reproducció assistida”, que es duu a terme a l’Hospital Universitari Son Espases i en el que participen la Unitat de Reproducció assistida i la Unitat de Diagnòstic Molecular i Genètica Clínica.
Els objectius generals del projecte són:
1. Estudiar les diferències entre l’ADN mitocondrial de la sang de pacients sense patologies associades abans de ser sotmeses al tractament de FIV i l’ADN mitocondrial present en el líquid fol·licular després del tractament hormonal.
2. Establir una relació entre les diferències trobades i la resposta al tractament de FIV.
15 Els objectius concrets d’aquest treball són:
3. Investigar les evidències de què el tractament de reproducció assistida pot tenir efectes sobre la funció mitocondrial.
4. Avaluar la possibilitat d’emprar els estudis amb ADN mitocondrial com a biomarcador per a una òptima selecció dels embrions.
5. Posar a punt la tècnica d’extracció i quantificació de l’ADN lliure circulant present en líquid fol·licular, i determinar la presència d’ADN mitocondrial.
Materials i mètodes
Metodologia de recerca bibliogràfica
Entre el març i el maig de 2021 es va dur a terme la recerca de bibliografia respecte la relació entre els mitocondris i l’ADN mitocondrial, i la reproducció assistida. El cercador escollit va ser Pubmed i es van emprar com a paraules clau principals mitochondria i mitochondrial DNA. A partir d’aquestes es va anar refinant la recerca afegint a les anteriors: assisted reproductive technologies, in vitro fertilization, oocyte. A la combinació mitochondria/ mitochondrial DNA assisted reproductive technologies s’hi va afegir també heteroplasmy. Els resultats d’aquestes cerques es van filtrar seleccionant articles de revistes o revisions que s’havien publicat entre l’any 2000 i el maig del 2021, eren d’accés obert i tractaven sobre l’espècie humana (Figura 7).
El nombre de publicacions o entrades a PubMed obtingudes a partir d’aquesta recerca es recullen a la Taula 1, indicant el nombre abans i després d’aplicar els filtres exposats. Sobre les entrades obtingudes, es va refinar la selecció a partir de l’elecció dels articles d’acord amb el títol i el resum o abstract. Finalment, es van elegir 25 articles que han estat emprats per realitzar l’estudi que ens ocupa.
Taula 1
Recull del nombre d’entrades per cada cerca de paraules clau a PubMed.
RESULTATS
PARAULES CLAU Mitochondria 226.982 31.377
Assisted reproductive technologies In vitro fertilization Oocyte
737 87 611 75 2.084 149
Heteroplasmy 30 8
Mitochondrial DNA 90.053 12.909
Assisted reproductive technologies In vitro fertilization Oocyte
512 76 397 67 1.019 106
Heteroplasmy 31 7
Nota. Es recull el nombre de resultats obtinguts a PubMed per cada cerca, abans (gris) i després (negre) de l’aplicació dels filtres en referència a la data de publicació, l’espècie, la disponibilitat del text i el tipus de document. Aquestes dades es van recollir el dia 17 de maig de 2021.
16 De forma complementària es van consultar també pàgines web mèdiques o governamentals per a la definició i aclariment de certs conceptes emprats, com és el cas de MedlinePlus i l’Institut Nacional de la Salut Infantil i el Desenvolupament Humà (NICHD).
Figura 7
Diagrama del disseny metodològic de la recerca bibliogràfica.
Nota. S’ha emprat com a cercador principal PubMed, emprat com a paraules clau mitochondria i mitochondrial DNA. A partir d’aquestes s’ha restringint la recerca amb assisted reproductive technologies, amb una cerca més limitada de heteroplasmy;
in vitro fertilization i oocyte. S’han afegit com a filtres la lliure disposició del text (free full text), la data de publicació (2000- 2021), l’espècie humana com a centre de la informació i el tipus de document (Journal Article i Review).
A partir de les dades obtingudes amb la recerca prèviament explicada, es va dur a terme un anàlisi de l’evolució temporal en l’estudi de la relació entre els mitocondris i la reproducció, centrant-nos en l’assistida per fecundació in vitro. D’acord amb els resultats de la cerca a PubMed per les combinacions de paraules clau establertes i una vegada aplicats els filtres, s’ha elaborat un gràfic temporal per cada cas (Figura 8), podent-se observar una tendència a l’alça. Cal tenir en compte que el nombre de publicacions al 2021 és baix perquè no es contempla l’any sencer. És important destacar també que, tot i que el nombre de resultats per les cerques associades als mitocondris o a l’ADN mitocondrial és elevat, al restringir la recerca a estudis que ho relacionin amb la reproducció assistida el nombre de publicacions descendeix de forma molt severa.
PubMed
Mitochondria
Assisted reproductive
technologies In vitro fertilization Oocyte
Heteroplasmy
Free full text 2000-2021 Humans Journal Article, Review
Paraules clau
Filtres
Mitochondrial DNA
17 Figura 8
Anàlisi de l’evolució temporal en el nombre de publicacions per les paraules clau seleccionades.
Nota. (A) Anàlisi de l’evolució temporal (2000-actualitat) en el nombre de publicacions que compleixin els filtres establerts per a la paraula mitochondria. (B) Anàlisi de l’evolució temporal (2000-actualitat) en el nombre de publicacions que compleixin els filtres establerts per a la paraula mitochondrial DNA. (C) Anàlisi de l’evolució temporal (2000-actualitat) en el nombre de publicacions que compleixin els filtres establerts per a les combinacions de paraules mitochondria assisted reproductive technologies, mitochondria in vitro fertilization i mitochondria oocyte. (D) Anàlisi de l’evolució temporal (2000- actualitat) en el nombre de publicacions que compleixin els filtres establerts per a les combinacions de paraules mitochondrial DNA assisted reproductive technologies, mitochondrial DNA in vitro fertilization i mitochondrial DNA oocyte.
Posta a punt de la tècnica d’extracció d’ADN lliure circulant en líquid fol·licular
Selecció de les pacients i obtenció de les mostres
Per dur a terme la posta a punt, es van seleccionar les mostres de líquid fol·licular de dues dones de menys de 36 anys, amb paràmetres hormonals i reserva ovàrica normal, sense una causa específica d’infertilitat diagnosticada. Les pacients amb codi NH-2590214 i NH-2770375 estaven inscrites al
18 programa de reproducció assistida de l’Hospital Universitari Son Espases (HUSE) i van signar un consentiment informat per participar en l’estudi que ens ocupa.
El líquid fol·licular va ser extret a la Unitat de Reproducció Assistida de l’HUSE posteriorment a l’estimulació ovàrica, aprofitant la punció fol·licular, evitant els líquids sanguinolents i/o tèrbols per evitar errors en la posterior determinació. Les mostres es van conservar a -80 ºC fins a l’aplicació del protocol d’extracció.
Ajust de les condicions òptimes per a l’extracció de l’ADN lliure circulant en líquid fol·licular
Del líquid fol·licular obtingut de les pacients amb codi NH-2590214 i NH-2770375 es van separar dues alíquotes. Una va ser processada per a l’extracció de forma directa, mentre que l’altra va ser centrifugada en les següents condicions: una primera centrifuga a 4 ºC a 3.000 x g durant 15 minuts, i una segona a partir del sobrenedant de la primera, a 4 ºC a 16.000 x g durant 10 minuts. L’objectiu del processament era dilucidar l’efecte de la centrífuga sobre la quantitat d’ADN obtingut després de l’extracció.
L’extracció d’ADN del líquid fol·licular es va dur a terme amb el kit QIAamp® Circulating Nucleic Acid (Qiagen)29, indicat per a la concentració i purificació d’ADN, ARN i àcids nucleics virals circulants en plasma humà, sèrum, orina o altres fluids corporals.
Es va partir de 4 ml de líquid fol·licular per a l’extracció d’ADN. Sobre aquest volum es va aplicar el protocol per a la purificació d’àcids nucleics que consta de quatre passes: lisat, lligació, rentat i elució.
La primera etapa permet alliberar els àcids nucleics que es troben units a proteïnes o lípids, o envoltats en vesícules. Per dur a terme aquesta passa es varen afegir a 400μl de proteïnasa K els 4 ml de líquid fol·licular i, a continuació, s’incorporaren 3,2 ml del buffer ACL, que contenia 1 μg d’ARN carrier. Es va incubar a 60 ºC durant 30 minuts, obtenint així el lisat.
Sobre el lisat es van afegir 7,2 ml de buffer ACB que permet, després de la incubació en gel, la correcta unió o lligació a la membrana de sílice quan es fa passar la mostra a través de la columna proporcionada. Pel pas de les mostres per les columnes es va emprar una bomba de buit. En alguns casos, la pressió de buit no va permetre que es donés el pas de la totalitat de la mostra lisada i es va recórrer a spins de centrifuga per la recollida de l’ADN sobre la membrana de sílice.
Una vegada retinguts els àcids nucleics a la membrana, es va fer passar per cada columna, gràcies a la pressió de buit, 600μl del buffer ACW1, 750μl d’ACW2 i 750μl d’etanol absolut. En els casos en què es va recórrer a la centrifugació per la recollida dels àcids nucleics sobre la membrana, aquestes passes també es van dur a terme per centrifugació. Per completar la passa de rentat, es va realitzar una centrifugació de 3 minuts a 14.000 rpm i es va incubar la columna a 56 ºC durant 10 minuts per assecar totalment la membrana. Per a la recollida dels àcids nucleics, es van aplicar 100 μl del buffer AVE, equilibrat a temperatura ambient, sobre la columna. El volum eluït es va recollir i s’emmagatzemà a -20 ºC.
Quantificació de l’ADN lliure circulant en líquid fol·licular
Per comprovar la correcta extracció de l’ADN lliure circulant en líquid fol·licular de les mostres amb codi NH-2590214 i NH-2770375 es va recórrer a la quantificació per mitjà del sistema QuantiFluor®
dsDNA30, que conté un compost fluorescent d’unió a l’ADN que permet la quantificació d’ADN de doble cadena.
19 Primerament es va preparar la dilució 1X de TE Buffer, constituït pel tampó Tris i per EDTA, amb aigua lliure de nucleases en base al 20X de TE Buffer proporcionat. A partir d’aquesta i de l’estàndard d’ADN Lambda, amb una concentració coneguda de 100 μg/ ml, es va preparar la recta patró amb 8 punts corresponents a concentracions d’ADN de 2 a 0 ng/ μl. A 90 μl de cada punt del patró es van afegir 90 μl de Dye, el compost marcador de fluorescència sensible a la llum que permet la quantificació. Per altra banda, sobre una placa p96 es van depositar a cada pouet 95 μl de 1X TE Buffer i 5 μl de mostra (dilució 1/20 de la mostra). D’aquesta mescla es van passar 90 μl a un altre pouet i s’hi van incorporar 90 μl de Dye.
Tant el patró com la placa amb les mostres es van mesclar amb vòrtex i amb un spin de centrifuga. A continuació, de cada punt del patró i de cada mostra es van depositar per duplicat 80 μl en la placa p96 emprada per la quantificació. Aquesta placa es va incubar durant 3 minuts en foscor i després es va procedir a la quantificació amb el fluorímetre.
Amplificació per PCR de regions de l’ADN mitocondrial
Es va dur a terme una PCR amb 2 parelles de primers específics per la regió del loop D de l’ADN mitocondrial (Taula 2) per tal de comprovar la presència d’aquest en el producte obtingut de l’extracció d’ADN a partir de les mostres de líquid fol·licular, centrifugades i sense centrifugar, de les pacients amb codi NH-2590214 i NH-2770375. Prèviament a la reacció de PCR, es va dur a terme un BLAST a GenBank per localitzar les seqüències dels primers i la seqüència que s’amplificaria en cada cas per tal de conèixer la longitud dels productes de PCR.
Taula 2
Informació dels primers emprats en la PCR per l’amplificació de regions de l’ADN mitocondrial.
Nom Primer Seqüència Referència Longitud
amplificació
D-loop F1
Forward CACCATTAGCACCCAAAGCT Alonso, A. et al. (2003)31 629 pb Reverse CCCGTGAGTGGTTAATAGGGT Parson i Bandelt (2007)32
D-loop F2
Forward CCCACACGTTCCCCTTAAAT Marques, S. L. et al. (2015)33 673 pb Reverse GGGTGATGTGAGCCCGTCTA Parson i Bandelt (2007)32
Nota. Es recullen els noms de les parelles de primers emprades per l’amplificació de dues regions de l’ADN mitocondrial que pertanyen al loop D, juntament amb la seqüència concreta de cada un (forward i reverse), així com la referència de la qual s’ha obtingut la informació en qüestió. Es representa també la longitud de la seqüència amplificada que s’hauria d’aconseguir, obtinguda per mitjà de la realització d’un BLAST a GenBank.
Per preparar la PCR es va partir dels primers a 100 ng/ μl i es van diluir 1/10, per aconseguir una concentració de 10 ng/ μl. La dilució es va realitzar en una solució de rehidratació d’ADN.
Paral·lelament es va preparar la mescla de PCR, amb 5 μl de buffer, 4 μl de clorur de magnesi (MgCl2), 1 μl de nucleòtids (dNTPs), 32,6 μl d’aigua lliure de nucleases, 1 μl de primer forward a 10 ng/ μl, 1 μl de primer reverse a la mateixa concentració i 0,4 μl de Taq polimerasa GOLD, per cada mostra i parella de primers. A aquesta mescla s’hi van afegir 5 μl de la mostra corresponent. Es va preparar també un
20 control negatiu, on els 5 μl de mostra van ser substituïts per aigua lliure de nucleases, i un control positiu, emprant un extracte d’ADN prèviament quantificat.
Una vegada preparades les 4 mostres i els controls, es va donar un spin de centrífuga a tots els tubs i es van introduir al termociclador. La reacció en cadena de la polimerasa es va dur a terme sota les següents condicions: desnaturalització inicial a 95 ºC durant 5 minuts, 39 cicles incloent 30 segons a 94 ºC (desnaturalització), 1 minut a 60 ºC (alineament) i 45 segons a 72 ºC (extensió), 10 minuts a 72 ºC per la extensió final i 5 minuts a 4 ºC. Les mostres es van conservar a 4 ºC i, després, es van córrer mitjançant electroforesi capil·lar al bioanalitzador QIAxcel Advanced System, obtenint el patró de bandes que s’analitza més endavant.
Extracció i quantificació d’ADN en líquid fol·licular i en sang
Selecció de les pacients i obtenció de les mostres
De forma prèvia a la posta a punt del mètode d’extracció d’ADN lliure circulant en líquid fol·licular es va dur a terme el reclutament de pacients per al projecte “Determinació en líquid fol·licular d’alteracions en el mitogenoma en pacients sotmeses a tractaments de reproducció assistida”. A partir d’aquestes, es van obtenir mostres de sang i líquid fol·licular.
S’han inclòs en l’estudi dones de menys de 36 anys, amb paràmetres hormonals i reserva ovàrica normal, sense una causa específica d’infertilitat diagnosticada. Fins al moment, s’han recollit mostres de 16 pacients. D’aquestes, 9 mostres han estat excloses degut a la baixa resposta a l’estimulació ovàrica, de manera que actualment es compta amb mostres de 7 pacients per al projecte. El codi de les pacients en qüestió és MT-2, MT-4, MT-5, MT-9, MT-10, MT-11 i MT-16. Totes les pacients es troben inscrites al programa de reproducció assistida de l’Hospital Universitari Son Espases (HUSE) i han signat un consentiment informat per participar en el projecte.
La sang va ser extreta a la Unitat de Reproducció Assistida de l’HUSE abans de l’inici del procés d’estimulació ovàrica. Es va processar per tal de separar la fracció leucocitària (buffy coat) del sèrum per mitjà de la centrifugació a 1.000 x g durant 15 minuts. Les fraccions separades es va emmagatzemar a -80 ºC al BioBanc de l’IdISBa.
El líquid fol·licular va ser extret també a la Unitat de Reproducció Assistida de l’HUSE de forma posterior a l’estimulació ovàrica, aprofitant la punció fol·licular, evitant els líquids sanguinolents i/o tèrbols per evitar errors en la posterior determinació. Els líquids fol·liculars van ser centrifugats de forma prèvia a l’emmagatzematge a -80 ºC al BioBanc de l’IdISBa. La centrifugació de les mostres es va dur a terme a 4 ºC, primerament a 3.000 x g durant 15 minuts i després es va repetir només amb el sobrenedant de la primera a 16.000 x g durant 10 minuts.
Extracció d’ADN a partir de sang amb el kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification
L’extracció d’ADN de la sang de les pacients es va dur a terme amb el kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega)34, indicat per l’aïllament d’ADN dels glòbuls blancs presents en la sang, entre d’altres. El protocol es basa en la lisi dels glòbuls vermells, la lisi del nucli dels glòbuls blancs, la precipitació de les proteïnes i l’obtenció de l’ADN d’interès.
Sobre 900 μl de la solució de lisi cel·lular es varen afegir 300 μl de la fracció leucocitària de les mostres MT-2, MT-4, MT-5, MT-9, MT-10, MT-11 i MT-16, i es va invertir vigorosament abans de la incubació a
21 temperatura ambient durant 10 minuts, aconseguint d’aquesta manera la lisi dels glòbuls vermells.
Passat aquest temps es va centrifugar a 14.000 x g durant 20 segons, a temperatura ambient. Una vegada centrifugat es va poder observar en les mostres la presència d’un pellet blanc, de manera que es va retirar el sobrenedant. Dins el tub eppendorf van quedar uns 10-20 μl de sobrenedant de forma residual, emprat per resuspendre el pellet de glòbuls blancs per mitjà de vòrtex.
A continuació, es van afegir a cada mostra 300 μl de la solució de lisi del nucli i es va mesclar de forma vigorosa, obtenint-se una solució viscosa. Sobre aquesta es van afegir 100 μl de la solució de precipitació de proteïnes i es va mesclar vigorosament amb vòrtex, per seguir amb una centrifuga a 14.000 x g durant 3 minuts a temperatura ambient. Una vegada centrifugat es va observar un pellet marró, corresponent a les proteïnes, de manera que es va transferir el sobrenedant a un nou tub amb 300 μl d’isopropanol.
Al mesclar el sobrenedat i l’isopropanol es va poder observar la formació d’una massa visible, anomenada de forma comú grumer. Aquest producte va ser centrifugat a 14.000 x g durant 1 minut, aconseguit un pellet d’ADN blanc. El sobrenedant es va descartar i es va procedir al rentat de l’ADN amb 300 μl d’etanol al 70%. Després de la inversió de forma repetida es va centrifugar a 14.000 x g durant 1 minut. Una vegada completada aquesta passa, es va decantar el sobrenedant i es van deixar secar la resta de l’etanol amb el tub obert sobre un paper absorbent durant 10 minuts. Finalment, es van afegir a les mostres MT-4, 9, 10, 11 i 16 100 μl de la solució de rehidratació, mentre que a les mostres MT-2 i 5 es van afegir només 50 μl de la solució, degut a què s’hi observava un pellet menor.
El volum obtingut es va emmagatzemar a -20 ºC.
Extracció d’ADN lliure circulant en líquid fol·licular amb el kit QIAmp® Circulating Nucleic Acid L’extracció per les mostres MT-2, MT-4, MT-9, MT-10, MT-11 i MT-16 es va dur a terme amb el kit QIAamp® Circulating Nucleic Acid (Qiagen)29, d’acord amb el mateix protocol aplicat en les mostres de la posta a punt del mètode, partint d’un volum de 4 ml de líquid fol·licular.
En el cas de la mostra MT-5 es va aplicar el protocol ajustat a 1 ml de líquid fol·licular de partida, degut a què no se’n va poder obtenir més durant la recollida. Així, es va afegir a 100 μl de proteïnasa K el 1 ml de líquid fol·licular i, a continuació, s’incorporaren 0,8 ml del buffer ACL, que contenia 1 μg d’ARN carrier. Es va incubar a 60 ºC durant 30 minuts, obtenint així el lisat.
Sobre el lisat es van afegir 1,8 ml de buffer ACB que permet la posterior unió a la membrana de sílice, al fer passar la mostra a través de la columna amb l’acció de la bomba de buit. Els passos posteriors es van dur a terme de la mateixa manera com s’ha comentat per les mostres amb un volum de partida de 4 ml.
Quantificació de l’extracte d’ADN obtingut a partir de les mostres de sang i de líquid fol·licular La quantificació de l’extracte d’ADN obtingut a partir de les mostres de sang i de líquid fol·licular de les pacients amb codi MT-2, MT-4, MT-5, MT-9, MT-10, MT-11 i MT-16 es va realitzar per mitjà del sistema QuantiFluor® dsDNA30, seguint el mateix protocol que s’ha exposat per les mostres de posta a punt del mètode.
22
Resultats
Efecte del tractament de reproducció assistida sobre la funció mitocondrial
Existeixen evidències de què el tractament de reproducció assistida pot tenir efectes sobre la funció mitocondrial. 4 Així, els mitocondris són essencials en la reproducció, de manera que els possibles efectes causats en aquests pel tractament de fecundació in vitro podrien tenir un pes important en el resultat.
En general, els efectes mencionats es relacionen amb la passa d’estimulació ovàrica o superovulació.
En aquesta s’indueix la maduració dels fol·licles i l’ovulació, per mitjà de la presa de medicaments, obtenint així un elevat nombre d’òvuls, fet d’interès en la reproducció assistida per aconseguir millors resultats. 8,25,35
A més, els procediments de reproducció assistida poden facilitar l’heteroplàsmia, ja sigui per la combinació de genomes mutats i normals com a conseqüència de l’aparició de mutacions o per la mescla de genomes de la donant i la receptora del citoplasma de l’oòcit en l’ART amb intervenció de tercers. 2,22,24
Es relaciona també la reproducció assistida amb l’estrès oxidatiu, degut a factors externs, com l’exposició a la llum visible, el pH, la temperatura, l’oxigen, la manipulació de l’embrió i dels gàmetes, etc. Aquests factors poden fer l’ADN mitocondrial més susceptible, de manera que es podria perdre la capacitat de generar l’ATP suficient pel manteniment dels processos. 8
Si ens centram en els efectes de l’estimulació ovàrica, cal tenir en compte que aquesta passa es pot realitzar per mitjà de protocols lleugerament diferents, evidenciant-se que les modificacions suposen impactes distints sobre els mitocondris, la producció d’energia i, per tant, la qualitat de l’oòcit.
Aquestes alteracions poden ser degudes a què l’excés d’hormones emprades en els protocols en qüestió no sigui totalment innocu pel sistema reproductor femení. 8
En aquesta línia, s’han realitzat estudis del consum d’oxigen per avaluar el mecanisme de fosforilació oxidativa, propi dels mitocondris. Aquests han permès determinar que el consum d’oxigen és menor en els embrions que queden arrestats en comparació a aquells que evolucionen cap a l’etapa de blastocist. 8 Aquest fet es pot correlacionar amb una menor producció d’ATP en els embrions arrestats, fet que s’associa a la disfunció mitocondrial.
També s’han dut a terme estudis del potencial de membrana dels mitocondris en oòcits madurats in vitro i sotmesos al procés d’hiperestimulació. Aquests han demostrat que es produeix una disminució en el valor del potencial, fet que es relaciona de forma directa amb una menor activitat. Aquesta alteració sembla ser la causa d’una menor taxa de formació de blastocists. 36
En relació a l’estrès oxidatiu, s’ha comprovat que nivells augmentats de ROS suposen una disminució de la qualitat de l’oòcit, podent arribar a induir l’apoptosi. El procés d’estimulació ovàrica pot suposar una acumulació d’aquestes ROS, causant l’apoptosi de cèl·lules de la granulosa i una reducció de la taxa d’ovulació i de la qualitat de l’oòcit. L’apoptosi de cèl·lules de la granulosa suposa una disminució en la comunicació entre aquestes i l’oòcit, donant lloc als efectes comentats pel gàmeta. A més, també s’associa l’estrès oxidatiu amb l’escurçament dels telòmers, desordres en la segregació cromosòmica, fragmentació de l’oòcit i errades en la fecundació. Aquests efectes s’accentuen amb les repeticions del tractament i, per tant, del procés d’estimulació ovàrica. 37
Chao, H. T. et al. van poder veure que en ratolins les repeticions dels cicles d’estimulació ovàrica també suposaven un increment en els danys oxidatius i que, a més, es relacionaven aquests cicles amb un
23 augment en les delecions sobre l’ADN mitocondrial. 38 Es tracta d’un aspecte que queda obert a l’estudi en el cas dels humans.
També dins les causes de l’augment en la producció de ROS i, per tant, l’aparició d’estrès oxidatiu, no s’ha d’oblidar l’estrès fisiològic al que es troben sotmeses les dones que segueixen un tractament de reproducció assistida. 37
Per altra banda, s’ha pogut veure que en dones obeses es produeixen canvis en l’expressió gènica endometrial i en la qualitat de l’oòcit i l’embrió, a més de què en generar la fecundació in vitro, l’embrió no prospera adequadament. S’han correlacionat aquests aspectes amb l’estrès metabòlic que es dona en el context de l’obesitat, fet que suposa un augment de la producció de ROS i afecta a la funció mitocondrial.8 Es tracta, doncs, d’una evidència més de l’afectació del procés de reproducció assistida sobre la funció mitocondrial, per mitjà dels ROS.
D’acord amb els motius exposats, s’han cercat marcadors per a l’estudi de la competència de l’oòcit i de l’embrió en les tècniques de reproducció assistida, agafant pes en l’actualitat l’ús de l’ADN mitocondrial com a biomarcador.
ADN mitocondrial lliure circulant en líquid fol·licular com a biomarcador
Estudis d’anàlisi del transcriptoma de l’oòcit han evidenciat que la funció mitocondrial en pacients sotmeses a fecundació in vitro es troba relacionada estretament amb una bona qualitat del blastocist.39 S’associa també la viabilitat de l’embrió amb el nombre de còpies d’ADN mitocondrial que presenta, basant-se en la interacció amb el metabolisme i la producció d’ATP. 40
A partir d’oòcits amb zona pel·lúcida obscura, s’ha pogut veure que la morfologia i la inadequada distribució dels mitocondris pot afectar també a l’activitat metabòlica de l’oòcit, així com a la taxa de fertilització i a la competència de l’embrió. 36 Per altra banda, la disfunció mitocondrial es relaciona amb anomalies en la formació del fus meiòtic, podent donar lloc a aneuploïdies; amb una producció insuficient d’ATP; amb l’alteració de l’homeòstasi del calci; amb canvis en els efectes de les hormones, etc. 41
A més, nombrosos estudis evidencien les variacions en el contingut en ADN mitocondrial dels oòcits de dones d’edat avançada, així com en dones amb una baixa reserva ovàrica40, associant-se totes dues circumstàncies amb una menor probabilitat d’embaràs.
Tots els aspectes comentats i, per tant, les evidències d’una clara relació entre la funció mitocondrial i la qualitat tant de l’oòcit com de l’embrió, porten a pensar que l’ADN mitocondrial podria ser un bon biomarcador de la viabilitat de l’oòcit i l’embrió. Per aquest motiu, s’han desenvolupament nombrosos estudis en els darrers anys per tal de poder dilucidar si, efectivament, l’ADN mitocondrial és adequat com a biomarcador. Aquests estudis han analitzat, principalment, l’ADN mitocondrial d’embrions. Tot i així, es planteja com una alternativa no invasiva l’estudi de l’ADN mitocondrial lliure circulant en líquid fol·licular.
El líquid fol·licular es troba envoltant l’oòcit i està implicat en la maduració fol·licular, el creixement de l’oòcit i l’adquisició de competència del mateix. D’aquesta manera nombrosos estudis han plantejat l’ús de components del líquid fol·licular per a l’estudi de possibles biomarcadors per a la selecció embrionària. 42
En la sang, com a conseqüència dels processos necròtics i apoptòtics, així com per la secreció activa de les cèl·lules, es pot trobar ADN lliure, tant de tipus nuclear com de tipus mitocondrial.42,43 Aquest ADN
