DNA-metylering og klinisk forløp ved Parkinsons sykdom
Prosjektoppgave ved forskningsgruppen for bevegelsesforstyrrelser ved Nevrologisk avdeling OUS
Universitetet i Oslo
Vibeke Risvold Veileder: Lasse Pihlstrøm
2018
Sammendrag:
Parkinson’s disease is a progressive neurodegenerative disease with no causal
treatment. Over the last years, many studies have shown associations between genetic risk factors and development of the disease. However, little is known about the molecular mechanisms in play. Recent research suggests that epigenetic changes of the SNCA gene, encoding alpha-synuclein, affect Parkinson’s disease risk. In patients with Parkinson’s disease studies have shown a decreased level of methylation in the promoter region of SNCA as compared to healthy controls. This may indicate that the gene is more active in Parkinson’s disease. More investigations on a molecular level are crucial for further understanding of the disease and future development of a causal treatment.
Increasing evidence indicates that genetic risk variants for Parkinson's disease also modulate phenotype and contribute to the striking clinical heterogeneity observed across individual patients. Similar studies have not been performed for risk-associated methylation. This paper investigates the possible relationship between SNCA
promoter methylation and selected clinical outcomes. The results do not show any statistical significant correlation between SNCA methylation and RBD, age at onset or progression. Given the small number of patients and possible confounding factors, it is difficult to draw a conclusion based solely on these results. More research on the SNCA gene will be highly valuable for a deeper understanding of Parkinson’s disease.
1. Innledning:
Parkinsons sykdom (PD) er en progressiv nevrodegenerativ sykdom, som rammer over 1 % av den eldre befolkningen (1). Årsaken antas å være et komplekst samspill mellom genetiske faktorer og miljøpåvirkning (2,3). Sykdommen kan gi et bredt spekter av symptomer, og det kliniske bildet viser stor variasjon fra pasient til pasient (4). Det finnes foreløpig ingen tilgjengelig behandling som bremser den
nevrodegenerative prosessen (3). Totalt skaper PD en betydelig sykdomsbyrde for samfunnet så vel som for den enkelte pasient (4), slik at økt kunnskap om sykdommen vil kunne ha stor påvirkningskraft både på individ- og samfunnsnivå. Forskning på molekylær patogenese er avgjørende for utvikling av nye behandlingsmetoder som kan forbedre funksjon og livskvalitet.
De siste årene har forskning avdekket assosiasjoner mellom ulike genetiske varianter og utvikling av PD (5,6). Genetikkens rolle i PD er imidlertid ikke ferdig kartlagt. Dersom vi kan forstå hvordan en individuell genetisk profil påvirker symptomutformingen hos den enkelte, vil vi oppnå en dypere forståelse av sykdomsprosessen. Dette kan få kliniske implikasjoner for fremtidens persontilpassede medisin, der målrettet terapi mot spesifikke molekylære
sykdomsmekanismer kan vise seg å passe bedre for noen pasienter enn for andre.
Genet SNCA står i dag helt sentralt i vår forståelse av patogenesen ved PD.
SNCA ligger på humant kromosom 4, og koder for proteinet alfa-synuklein, som er hovedbestanddelen i Lewylegemer (7). Det har blitt vist at mutasjoner i SNCA gir arvelig PD (8), og at vanlige genvarianter nær samme gen påvirker risiko for
sporadisk PD (5). Videre har man sett at pasienter med multiplikasjon av genet også får autosomal dominant PD (9), noe som indikerer at for mye alfa-synuklein alene kan være tilstrekkelig til at sykdomsprosessen settes i gang.
Genvariantene nær SNCA som påvirker risiko for sporadisk PD, ligger i ikke- kodende DNA. Selv om den eksakte virkningsmekanismen er ukjent, tror man at sykdomsrisikoen formidles gjennom endret genregulering som gir økt ekspresjon av SNCA - og dermed økt mengde av alfa-synuklein.
Genekspresjon kan hos mennesker reguleres på flere måter, og epigenetiske
forandringer som DNA-metylering spiller en sentral rolle (10,11). DNA-metylering
innebærer en overføring av metylgrupper til DNA-tråden, hovedsakelig til CpG- dinukleotider. Denne prosessen kan blant annet fungere som en genetisk bryter, der metylering av promotor-regionen til et gen som regel blokkerer transkripsjon og reduserer genuttrykket. Metyleringen er relativt langvarig og stabil (10), men også dynamisk, og under påvirkning av både genetikk og miljøfaktorer (11). DNA-
metylering spiller en sentral rolle i flere naturlige prosesser i cellen (10), og har også vist seg å være viktig i forståelsen av flere nevrologiske sykdommer som Alzheimers sykdom og MS (11).
Hos PD-pasienter er det blitt funnet redusert DNA-metylering av SNCA- promotoren i PD-pasienter sammenlignet med friske kontroller. Videre har
forskningsgruppen for bevegelsesforstyrrelser ved Nevrologisk avdeling, OUS1 vist at DNA-metylering er assosiert med en kjent genetisk risikovariant (en
enkeltnukleotid-polymorfisme (SNP) kalt rs3756063), noe som kan tyde på at metylering kan ha en rolle i den molekylære mekanismen i noen av situasjonene der ikke-kodende genvarianter påvirker sykdomsrisiko (12-14). I en annen nylig publisert studie har forskningsgruppen også funnet at samme genvariant er assosiert med søvnforstyrrelsen RBD (REM sleep Behaviour Disorder) hos PD-pasienter (15).
Basert på funn fra forskningsgruppen oppsto denne oppgavens hypotese om at DNA-metylering av promotor-regionen til SNCA kan være assosiert med RBD og andre kliniske parametere ved PD. Oppgaven går ut på å sammenstille allerede eksisterende data, selektere prøver til ytterligere eksperimenter med undersøkelse av DNA-metylering, og analysere data for å vurdere en eventuell sammenheng mellom SNCA-metylering og kliniske variabler. Vel vitende om at den statistiske styrken vil være begrenset har vi ansett prosjektet som en pilotstudie med mål om å gi
forskningsgruppen et bedre grunnlag for å prioritere ytterligere datainnsamling, eksperimenter og analyser i fremtiden. Videre forskning på SNCA er viktig for å forstå genets fulle rolle i PD. Dersom metylering av SNCA kunne blitt en biomarkør for en bestemt undergruppe av PD-pasienter, kunne dette vært av vesentlig betydning for eksempel for pasientseleksjon til utprøvende legemiddelstudier.
1 Heretter kalt ”forskningsgruppen”.
2. Metode:
Oppgaven baserer seg på innsamlede data og prøver fra Parkinson-pasienter, tilhørende forskningsgruppen. Prøvematerialet i biobanken omfatter blod/DNA fra om lag 450 pasienter med PD og 500 kontroller. Alle deltakere har gitt skriftlig informert samtykke, og studien er godkjent av Regional etisk komite (REK).
Pasientene er rekruttert ved Nevrologisk avdeling OUS i perioden 2007-2017.
Oppgaven sammenligner SNCA intron 1 metylering, med tre kliniske variabler - RBD, debutalder og progresjon, målt som Hoehn og Yahr stadium 3 (H&Y3)2. For alle disse tre kliniske variablene har forskningsgruppens studier tidligere vist assosiasjon med genetisk variasjon3.
Arbeidet med oppgaven er delt i tre deler: seleksjon av prøver til
metyleringsanalyser, undersøkelse av DNA-metylering på laboratoriet, og statistiske analyser i SPSS.
2.1 Seleksjon av prøver
For SNCA-metylering var det tilgjengelig data for 36 pasienter, og vi ønsket å øke dette antallet til 100 for å få et tilstrekkelig stort antall til å kunne vurdere eventuell(e) sammenheng(er), med større grad av statistisk styrke. For å gjøre dette, måtte vi først sammenstille det allerede innsamlede datamaterialet på tvers av ulike delstudier som forskningsgruppen har gjennomført tidligere. Slik fikk vi en oversikt over hva som var tilgjengelig av data og biomateriale for hver av pasientene, og kunne dermed selektere pasienter med flest mulig kliniske parametere knyttet til seg fra tidligere.
Antallet pasienter av de 100 utvalgte med tilleggsinformasjon om RBD, debutalder og H&Y3 ble totalt henholdsvis 65, 95 og 43.
2 Hoehn og Yahr er et skåringsverktøy fra 1-5 for symptomprogresjon i PD. Med H&Y3 menes at Hoehn og Yahr stadium 3 er nådd.
3 RBD har vært assosiert med SNCA-risikovariant, de andre med genetisk risikoscore (16, 17).
Prioritering av nye prøver til ytterligere analyser av SNCA intron 1 metylering ble diskutert og besluttet i samarbeid med veileder. Jeg hadde selv hovedansvaret for det praktiske arbeidet med å gjennomgå eksisterende data og selektere prøver for
metyleringssensitiv restriksjonsenzymbehandling og kvantitativ PCR (MSRE qPCR).
2.2 Undersøkelse av DNA-metylering i SNCA intron 1
Etter at de 64 nye pasientene var valgt ut, ble neste del av arbeidet utført på laboratoriet. Det tidligere innsamlede pasient-DNA var spredt på flere plater, og DNA-konsentrasjonen var ukjent. Før vi kunne lage nye brønner, var det dermed behov for å måle konsentrasjonen i de aktuelle prøvene. En vanlig måte å kvantifisere DNA på er å bruke et spektrofotometer, som måler gjennomsnittskonsentrasjonen og kvaliteten (renheten) til DNA. Et slikt apparat kan måle mengden UV-lys som passerer gjennom en prøve, og ut i fra hvor mye UV-lys som absorberes angi
konsentrasjonen. Mye absorbert lys vil indikere en høy konsentrasjon, og motsatt vil mindre absorbert lys indikere en lavere konsentrasjon. I vårt prosjekt brukte vi instrumentet Thermo Scientific™ NanoDrop 2000C. Dette er et spektrofotometer som blant annet brukes for å kvantifisere og vurdere renheten i DNA, RNA og protein. Det er et ”UV-Vis” spektrofotometer, noe som indikerer at den analyserer absorpsjon i den synlige delen av UV-lys.
Vi brukte så følgende formel for å ekstrahere og normalisere de 64 DNA- prøvene over i nye brønner:
200 uL/[DNA] = x uL DNA og 50 ul-x = y uL H20
Slik fikk vi et eget brett med 64 DNA-prøver klare for analyse med MSRE qPCR. Vi brukte kitet OneStep qMethyl™ fra Zymo Research. Dette kitet gjør det mulig å finne områdespesifikk DNA-metylering via selektiv amplifikasjon av metylert cytosin.
Metoden innebærer å analysere hver DNA-prøve i en testreaksjon og en
referansereaksjon. MSRE tilsettes testreaksjonen, og kutter DNA-tråden selektivt ved gitte CpG-dinukleotider bare dersom de er umetylerte. Deretter amplifiseres regionen man er interessert i fra begge prøvene ved hjelp av kvantitativ PCR. I testreaksjonen vil en del av templatet ikke amplifiseres, fordi det er kuttet av restriksjonsenzymene
ved umetylerte CpG-dinukleotider. En kan dermed sammenligne testreaksjonen og referansereaksjonen, og bestemme metyleringsnivå for hver amplifiserte region ved å bruke formelen:
prosent metylering = 100 x 2-ΔCt
der ΔCt = gjennomsnittlig Ct-verdi fra testreaksjonen minus gjennomsnittlig Ct-verdi fra referansereaksjonen. Ct = Cycle threshold, som er verdien som varierer avhengig av metyleringsnivå. En stor forskjell på Ct-verdiene er karakteristisk for ikke-metylert DNA. Etter at denne analysen var utført for de 64 utvalgte prøvene, satt vi igjen med informasjon om SNCA-metylering for 100 pasienter. Basert på visuell inspeksjon av resultatene ble en ekstrem uteligger ekskludert fra datasettet.
Jeg utførte selv analyser av DNA-konsentrasjon og -kvalitet og forberedte DNA- plater til eksperimentet med normalisert konsentrasjon. MSRE qPCR-eksperimentet ble satt opp av veileder.
2.3 Statistiske analyser av SNCA-metylering og kliniske variabler
Siste trinn i arbeidet var selve de statistiske analysene, som ble utført i SPSS v24. Alle relevante data ble samlet i ett stort datasett i Excel. Deretter ble datasettet importert inn i SPSS.
I SPSS undersøkte vi om SNCA-metylering er assosiert med RBD, debutalder, eller H&Y3 (progresjon). De statistiske analysene som ble brukt var logistisk
regresjon, lineær regresjon og cox regresjon. Kovariabler var SNCA-metylering, kjønn, alder, varighet, eksperiment-batch4 og debutalder.
Jeg gjorde primært statistiske analyser selv, som så ble gjennomgått og tolket i samarbeid med veileder.
4 Prøvene er hentet fra to ulike forsøk (i 2014 og 2017).
3. Resultater:
I dette avsnittet beskrives hvilke tre hypoteser som ble testet og deres resultater.
Statistiske tester ble undersøkt flere ganger med ulikt antall kovariabler inkludert, men dette ga i hovedsak like resultater, og kun én undersøkelse per problemstilling nevnes her.
Som tidligere nevnt har man funnet redusert DNA-metylering av en promotor i SNCA intron 1 i PD-pasienter sammenlignet med friske kontroller (12). Det er derfor interessant å se på om DNA-metylering av SNCA også korrelerer med kliniske
parametere ved PD. DNA-metylering har blitt funnet å være assosiert med rs3756063, som igjen har blitt assosiert med RBD hos PD-pasienter. Vi ønsket derfor først å undersøke om det er en assosiasjon mellom SNCA-metylering og RBD-status. Dette gjorde vi i en logistisk regresjonsmodell med RBD som avhengig variabel, og SNCA- metylering, kjønn, alder, sykdomsvarighet og eksperiment-batch som kovariabler. Vi fant ingen signifikant assosiasjon mellom SNCA-metylering og RBD i dette forsøket (p-verdi 0,620). Det er heller ingen statistisk signifikans for kjønn, alder eller
eksperiment-batch. Varighet viser seg å være signifikant, med en p-verdi på 0,01.
Betaverdien er over 0, slik at lenger varighet av sykdommen er assosiert med økt forekomst av RBD.
Figur 1: Sammenheng SNCA-metylering og RBD visualisert med box plot
Det har videre blitt vist en sammenheng mellom alvorlighetsgrad av PD og diagnosealder (18), og forskningsgruppen har som nevnt funnet en sammenheng mellom diagnosealder og kumulativ genetisk risikoscore (GRS). GRS er et mål på samlet genetisk byrde fra alle kjente risikoalleler som er identifisert gjennom helgenoms assosiasjonsstudier. Vi undersøkte om det er en assosiasjon mellom debutalder og SNCA-metylering. Dette gjorde vi i en lineær regresjonsmodell, med debutalder som avhengig variabel, og SNCA-metylering, kjønn, og eksperiment-batch som kovariabler. Vi fant ingen signifikant assosiasjon mellom SNCA-metylering og debutalder i dette forsøket (p-verdi 0,555). Det er heller ingen statistisk signifikans for kjønn. Eksperiment-batch har en signifikant assosiasjon, med en p-verdi på 0,01.
Dette kan ha å gjøre med hvordan forskningsgruppen har samlet materiale til biobanken i ulike faser av studieperioden.
Forskningsgruppen har tidligere også funnet en sammenheng mellom progresjonsdata og GRS. Til sist undersøkte vi derfor om det er en assosiasjon mellom SNCA-metylering og progresjon. Vi brukte cox regresjon med H&Y3 som outcome, og SNCA-metylering, debutalder, kjønn og eksperiment-batch som kovariabler. Vi fant ingen signifikant assosiasjon for SNCA-metylering (p-verdi 0,128). Det er heller ingen statistisk signifikans for kjønn, debutalder eller eksperiment-batch.
Tabell 1: Oppsummering av resultater
Variabler N
P-‐verdi (SNCA-‐
metylering) Beta
Standard-‐
avvik
RBD 65 0,620 14,716 5,426
Debutalder 95 0,555 0,071 21,682
Motorisk progresjon til H&Y3
43 0,128 534,236 4,123
4. Diskusjon:
I denne oppgaven har vi sett på et utvalg pasienter, og undersøkt om det finnes en statistisk signifikant sammenheng mellom SNCA-metylering og tre utvalgte kliniske parametere. Vi valgte parametere der det var relevant å lete etter en sammenheng.
Imidlertid fant vi ingen statistisk signifikant assosiasjon mellom SNCA-metylering og de utvalgte parametere. De neste avsnittene vil ta for seg om resultatene kan sies å være valide, og med hvilken grad av sikkerhet vi kan trekke en konklusjon.
4.1 Samsvar med annen forskning
Det er relevant å undersøke om det finnes lignende undersøkelser av samme fenomen, for å vurdere om funnene er konsistente og stabile eller ikke. Etter søk i Cochrane Library og McMaster Plus er det ikke funnet studier som inneholder sammenligninger av SNCA-metylering med RBD eller progresjon. Det utelukkes ikke at slike studier likevel kan finnes. For oppgavens undersøkelse av eventuelle sammenlignbare funn, er det for disse to hypotesene imidlertid ikke mulig å trekke noen konklusjon
angående dette.
En studie viser at debutalder for sporadisk PD korrelerer positivt med SNCA intron 1-metylering, hvilket betyr at høyere grad av metylering er assosiert med senere debut (19). Studien undersøkte totalt 975 personer, hvorav 490 var PD- pasienter og 485 friske kontroller. Denne oppgaven fant ingen signifikant
sammenheng mellom SNCA-metylering og debutalder, men vårt materiale var langt mindre, og med en positiv beta-verdi går tendensen i samme retning i vår studie.
4.2 Seleksjon av data og biologisk materiale
Oppgaven baserer seg på metyleringsdata som er hentet fra to ulike forsøk (gjort i 2014 og 2017). Dette kan gi opphav til en batch-effekt, dersom for eksempel betingelsene rundt eksperimentet er tilstrekkelig forskjellige til at resultatet blir påvirket. Dette er tatt hensyn til ved å inkludere eksperiment-batch som variabel i
analysene. Kriteriene for utvelgelse av pasienter til SNCA-metylering er for øvrig tilfredsstillende tilfeldig.
En annen form for bias relevant for denne oppgaven, er seleksjon av biologisk materiale. DNA-metylering er vevsspesifikt, og det hersker noe usikkerhet omkring hvorvidt DNA-metyleringsmønstre i PD korrelerer tilstrekkelig mellom hjernevev og blod til at blod er et gunstig analyseobjekt i denne sammenhengen. En studie har imidlertid vist SNCA promoter hypometylering i både post mortem cortex og perifere blodprøver (12). Det er likevel klart at for denne oppgavens formål hadde
undersøkelse av hjernevev vært det optimale.
4.3 Studiestørrelse
Et svært viktig moment for denne oppgaven er utvalgsstørrelsen. Antallet pasienter med informasjon om SNCA-metylering er 100. Antallet pasienter som ble aktuelle til hver undersøkelse ble til dels betydelig lavere, fordi tilleggsinformasjon om de ulike kliniske parametere ikke var tilgjengelig for alle de 100 pasientene. Dette innebærer at materialet vi jobber med for de ulike problemstillingene muligens blir for lite til at en kan stole på at resultatet er representativt og generaliserbart.
4.4 Konfunderende faktorer
Muligens finnes det faktorer som påvirker resultatet som oppgaven ikke har tatt høyde for, og som dermed kan være årsaken til et usant resultat. Det har for eksempel blitt vist at L-dopa øker SNCA intron 1-metyleringsnivåer og senker SNCA-ekspresjon in vitro (19) og at behandling av PD-pasienter med L-dopa doseavhengig motvirker den aldersavhengige hypometyleringen (19). Vi vet at mange av pasientene inkludert i denne studien har brukt L-dopa, og dette kan dermed ha påvirket SNCA-metyleringen som er målt, og vært en potensiell kilde til statistisk støy.
4.5 Konklusjon og veien videre
Oppgaven har ikke funnet noen statistisk signifikant sammenheng mellom SNCA- metylering og de utvalgte kliniske parametere. Med grunnlag i overnevnte diskusjon, med særlig vekt på utvalgsstørrelsen, vurderes ikke denne pilotstudiens statistiske styrke til å være tilfredsstillende god. Andre elementer, som mulige forskjeller i blod og hjernevev, samt effekt av L-dopa, bidrar også til at man ikke kan trekke noen bastant konklusjon. En naturlig forlengelse av denne oppgaven vil være å samle inn mer data og utvide populasjonen som undersøkes. Effekten av tilfeldige feil vil reduseres mot null dersom man øker utvalgsstørrelsen, og validiteten vil øke. Det vil være optimalt dersom man kan samle inn egne data, eventuelt bruke data med god kontroll over seleksjonsbias, gjerne fra samme forsøk.
For forskningsgruppen har denne oppgaven, som nevnt, status som en
pilotundersøkelse før større prosjekter settes i gang. Dette gjelder både undersøkelser av SNCA-metylering og longitunell innsamling av kliniske data fra et større antall pasienter med Parkinsons sykdom. Med tanke på sykdommens utbredelse og totale sykdomsbyrde, de senere års lovende forskning på SNCA, og muligheten for at SNCA kan spille en stor rolle i framtidens behandling, er det fortsatt essensielt med videre forskning på SNCA og Parkinsons sykdom.
Litteraturhenvisninger:
1. Pihlstrøm L, Toft M. Genetic variability in SNCA and Parkinson’s disease.
Neurogenetics [elektronisk artikkel]. 2011 Nov [hentet 2018-01-11];12(4):283-293.
Tilgjengelig fra: https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10048-011-0292-7
2. Bekris LM, Mata IF, Zabetian CP. The Genetics of Parkinson Disease. J Geriatr Psychiatry Neurol. 2010;23(4):228-242.
3. Kalia LV, Lang AE. Parkinson's disease. Lancet. 2015 Aug 29;386(9996):896-912.
4. Legehandboka. Parkinsons sykdom. [Internett]. Trondheim; 2017 Nov 7 [hentet 2018-01-26]. Tilgjengelig fra:
nevro.legehandboka.no/handboken/sykdommer/bevegelsesforstyrrelser/sykdommer- og-symptomer/parkinsons-sykdom/
5. Nalls MA, Pankratz N, Lill CM, Do CB, Hernandez DG, Saad M et al. Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk loci for
Parkinson's disease. Nat Genet. 2014 Jul 27;46:989-993.
6. Pihlstrøm L, Axelsson G, Bjørnarå KA, Dizdar N, Fardell C,
Forsgren L et al. Supportive evidence for 11 loci from genome-wide association studies in Parkinson’s disease. Neurobiol Aging [elektronisk artikkel]. 2013 Jun [hentet 2018-01-29];34(6):1708.e7-1708.e13. Tilgjengelig fra:
http://www.neurobiologyofaging.org/article/S0197-4580(12)00530-1/fulltext
7. Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM, Trojanowski JQ, Jakes R, Goedert M.
Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 1997 Aug 28;388:839–840.
8. Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A et al.
Mutation in the α-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.
Science. 1997;276:2045–2047.
9. Singleton AB, Farrer M, Johnson J, Singleton A, Hague S, Kachergus J et al.
Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 2003 Okt 31;
302(5646)(30):841.
10. Phillips, T. The role of methylation in gene expression. Nature Education. 2008;
1(1):116.
11. Zulet MI, Iriarte MM. Epigenetic Changes in DNA Methylation and Environment in Multiple Sclerosis. Nutrition and Lifestyle in Neurological Autoimmune Diseases.
2017. s. 3-‐8.
12. Pihlstrøm L, Berge V, Rengmark A, Toft M. Parkinson’s Disease Correlates With Promoter Methylation in the a-Synuclein Gene. Mov Disord. 2015 April;30(4):577- 580.
13. Jowaed A, Schmitt I, Kaut O, Wullner U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 2010;
30:6355-6359.
14. Matsumoto L, Takuma H, Tamaoka A, Kurisaki H, Date H, Tsuji S et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease. PLoS One. 2010 Nov;5(11):e15522.
15. Bjørnarå K, Pihlstrøm L, Dietrichs E, Toft M. Risk variants of the α-synuclein locus and REM sleep behavior disorder in Parkinson’s disease: a genetic association study. BMC Neurol. 2018;18:20.
16. Pihlstrøm L, Toft M. Cumulative Genetic Risk and Age at Onset in Parkinson’s Disease. Mov Disord. 2015 Okt;30(12):1712-1713.
17. Pihlstrøm L, Morset KR, Grimstad E, Vitelli V, Mathias Toft M. A Cumulative Genetic Risk Score Predicts Progression in Parkinson’s Disease. Mov Disord. 2016 Apr;31(4):487-90.
18. Pagano G, Ferrara N, Brooks DJ, Pavese N. Age at onset and Parkinson disease phenotype. Neurology. 2016 Apr 12;86(15):1400–1407.
19. Schmitt I, Kaut O, Khazneh H, deBoni L, Ahmad A, Berg D et al. L-Dopa
Increases a-Synuclein DNA Methylation in Parkinson’s Disease Patients In Vivo and In Vitro. Mov Disord. 2015 Nov;30(13):1794-1801.
