Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin

(1)

I

Parallel artificial liquid membrane extraction

av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin

Patryk Oskar Grafinski

Masteroppgave ved avdeling for farmasøytisk kjemi Faggruppen for legemiddelanalyse

45 studiepoeng

Farmasøytisk institutt

Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO

Mai/2017

(2)

II

(3)

III

Parallel artificial liquid membrane extractionav et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin

Veiledere:

Stig Pedersen-Bjergaard

Professor ved seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt

Universitetet i Oslo

Astrid Gjelstad

Førsteamanuensis ved seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt

Kristine Skoglund Ask

Stipendiat ved seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt

(4)

IV

Parallel artificial liquid membrane extractionav et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin

Patryk Oskar Grafinski http://www.duo.uio.no

Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo

(5)

V

Sammendrag

For første gang ble det vist at parallel artificial liquid membrane extraction (PALME) var i stand til å ekstrahere et basisk legemiddel og tilhørende metabolitter med store forskjeller i polaritet (-1.2 < log P < 2.5) fra urin i ett prøveopparbeidelsestrinn. Modellsubstansene i dette prosjektet var legemidlet venlafaksin med tilhørende metabolitter, hvorav to av disse var glukuronider med zwitterioniske egenskaper.

PALME ble utført fra kommersielle 96-brønnsplater. Modellsubstansene ble ekstrahert fra alkalisk urinprøve (donorfase), gjennom en supported liquid membrane (SLM) av organisk løsningsmiddel immobilisert i en porøs membran av polyvinylidenfluorid (PVDF), og inn i sur vandig akseptorfase. Etter ekstraksjon ble akseptorfasen analysert direkte med ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS).

Optimalisering av ekstraksjonsbetingelser fokuserte i stor grad på den kjemiske sammensetningen av fasene i PALME. Donorfasen besto av 125 µl urinprøve som ble justert med 115 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH 10.5 og 10 µl intern standard (venlafaksin-D6 hydroklorid). SLM hadde et volum på 4 µl. Den var sammensatt av et helt nytt organisk løsemiddel i PALME sammenheng, tripentylfosfat, som ble blandet sammen med 25%

av en bæremolekylløsning, Aliquat 336. Aliquat 336 er en teknisk blanding av alkylerte ammoniumklorider med trioktylammoniumklorid som hovedkomponent. Akseptorfasen var 50 µl av en 20 mM maursyreløsning. Ekstraksjoner foregikk i 45 min og ble fremmet av et orbitalt ristemønster med en hastighet på 900 rpm.

Metoden gjennomgikk en evaluering basert på retningslinjer fra de europeiske legemiddelmyndighetene (EMA) der både intra- og interdaganalyse ble gjennomført.

Korrelasjonskoeffisienter (r²) for linearitet hadde verdier mellom 0.98 og 0.99. Over 90% av resultatene fra evalueringen oppfylte krav med hensyn på presisjon og nøyaktighet. Det ble ikke observert overdrag i systemet.

Resultatene bekreftet potensialet av PALME og åpnet veien for ytterligere applikasjoner med polare analytter eller analytter innenfor et betydelig polaritetsvindu.

(6)

VI

Forord

Hei Kristine, Astrid og Stig.

Valideringsresultater vises i tabellen under.

Veiledningsvalidering

Oppfølging (r²) 1

Presisjon og nøyaktighet av tilbakemeldinger

Alle QC godt innenfor krav Tilgjengelighet over tid Stabilt på svært høyt nivå

Tilbakemeldingstid Svært kort

Overdrag av negative følelser eller andre uønskede effekter

Aldri observert

Konklusjon: Valideringsresultater bekrefter ypperlig kvalitet av data. Det er derfor høyst nødvendig å takke for den hyggelige og spennende tiden jeg hadde pålegemiddelanalyse siden det er vel fortjent. Tusen takk skal dere ha!

Dere som alltid er «alle andre på avdelingen», Cecilie, Trine, Øystein, Leon, Chuixiu, Elisabeth, Inger, Marthe, Linda, Magnus og Maren takk for den trivelige tiden vi hadde sammen.

Clarissa og Ida, det var gøy og vet dere hva deres navn slutter på a -what a coincidence.

Elin Vyvy det ville vært altfor kjedelig og altfor stille uten deg.

Gladys 我的朋友，你是个非常独特人，非常荣幸认识你。

Så er det deg Bassem. Du gjorde de fem siste årene helt topp. Jeg kunne ha skrevet veldig mye om deg og det ville ha vært kun positive ting. Jeg tror at å kalle deg for en bror fra en annen mor oppsummerer alt.

Mamma, pappa TAKK!

Det er fint å bli ferdig men det var mange kule mennesker, mye lek på laben og med skrivingen så det er også trist. Vel, jeg har i hvert fall kjennskap til venlafaksin… 😉

Oslo, mai 2017 Patryk

(7)

VII

Innholdsfortegnelse

Forkortelser ... 1

1. Innledning ... 4

1.1. Bakgrunn ... 4

1.2. Hensikt ... 6

2. Teori ... 7

2.1. Analytter og matriks ... 7

2.1.1. Venlafaksin og dens metabolitter ... 7

2.1.2. Urin som biologisk matriks ... 8

2.2. Prøveopparbeidelse ... 9

2.2.1. Væske-væske ekstraksjon ... 9

2.2.2. Væske-fase mikroekstraksjon ... 11

2.2.3. Parallel artificial liquid membrane extraction ... 12

2.3. UHPLC ... 14

2.4. MS ... 17

2.4.1. Elektrospray-ionisering ... 18

2.4.2. To-dimensjonal ionefelle ... 18

3. Materialer og metoder ... 20

3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter ... 20

3.2. Utstyr ... 20

3.3. Kjemikalier ... 23

3.4. Løsninger og buffere ... 26

3.4.1. Tillaging av buffere ... 26

3.4.2. Løsninger ... 28

3.4.3. Stamløsninger ... 30

3.4.4. Arbeidsløsninger ... 30

3.4.5. Standarder ... 30

3.4.6. Internstandard ... 30

3.4.7. Biologisk matriks ... 31

3.4.8. Mobilfaser ... 31

3.5. Instrumentelle betingelser ... 31

3.5.1. UHPLC ... 31

3.5.2. MS/MS ... 32

3.6. Utførelse av PALME ... 33

3.6.1. Vandige prøveløsninger ... 33

(8)

VIII

3.6.2. Biologiske prøveløsninger ... 35

3.7. Utvelgelse av SLM ... 36

3.8. Optimalisering av ekstraksjonen ... 37

3.8.1. Optimalisering av organisk fase ... 37

3.8.2. Optimalisering av mengden til ionisk bærer ... 38

3.8.3. Optimalisering av buffer pH i donorfasen ... 38

3.8.4. Optimalisering av styrken i akseptorfasen ... 39

3.8.5. Optimalisering av ekstraksjonstid ... 39

3.8.6. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen ... 39

3.9. Evaluering av metoden ... 39

3.9.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense ... 39

3.9.2. Linearitet ... 40

3.9.3. Overdrag ... 40

3.9.4. Presisjon og nøyaktighet ... 40

3.9.5. Matrikseffekter ... 40

3.9.6. Ekstraksjonsutbytte ... 41

3.10. Beregninger ... 41

4. Resultater og diskusjon ... 42

4.1. Innledende forsøk ... 42

4.1.1. Utvelgelse av SLM – del 1 ... 42

4.1.4. Testing av pH-betingelser i donorfasen... 48

4.1.7. Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede pH-betingelser i donorfasen – del 6 ... 53

4.1.8. Utvelgelse av ionisk bærer ... 55

4.1.9. Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen ... 57

4.2. Optimaliseringsforsøk ... 59

4.2.1. Optimalisering av SLM ... 59

4.2.2. Optimalisering av buffer pH i donorfasen ... 61

4.2.3. Optimalisering av styrken i akseptorfasen ... 63

4.2.4. Optimalisering av ekstraksjonstid ... 65

4.2.5. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen ... 67

(9)

IX

4.2.6. Testing av motioner ... 69

4.3. Evaluering ... 70

4.3.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense ... 70

4.3.2. Linearitet ... 70

4.3.3. Overdrag ... 73

4.3.4. Presisjon og nøyaktighet ... 73

4.3.5. Matrikseffekter ... 75

4.3.6. Ekstraksjonsutbytte ... 75

5. Konklusjon ... 77

6. Referanseliste ... 79

7. Appendix ... 83

(10)

1

Forkortelser

A336 Aliquat 336

Arb Arbitrary units

C18 Oktadecyl

Cl Klor

CYP450 Cytokrom P450

DBPi Dibenzylfosfitt

DCMA Dodecyltrimetylammoniumbromid

DMSO Dimetylsulfoksid

EMA European Medicines Agency

EME Electromembrane extraction (Elektromembranekstraksjon)

ESI Elektrospray-ionisering

HCl Hydrogenklorid

HCOOH Maursyre

HEPT Høydeekvivalenten til en teoretisk plate HF-LPME Hollow-fiber liquid phase microextraction

HPLC High-pressure liquid chromatography

K Kalium

LC Liquid chromatography (Væskekromatografi)

LIT Linear ion trap (Lineær ionefelle)

LLE Liquid-liquid extraction (Væske-væske ekstraksjon)

LOD Laveste deteksjonsgrense

LOQ Laveste kvantifiseringsgrense

LPME Liquid-phase microextraction (Væske-fase mikroekstraksjon)

(11)

2

m/z Masse over ladning

MS Mass spectrometry (Massespektrometri)

MS² Tandem massespektrometri

Na Natrium

NaCl Natriumklorid

NaOH Natriumhydroksid

NDV N-desmetyl venlafaksin

NNDODV N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin

NNDODVGLU N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid

NODV N,O-didesmetyl venlafaksin

NODVGLU N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid

NPOE 2-nitrofenyloktyleter

ODV O-desmetyl venlafaksin

PALME Parallel artificial liquid membrane extraction

PVDF Polyvinylidenfluorid

QC-prøve Kvalitetskontrollprøve

r² Korrelasjonskoeffisient

RF Radiofrekvens

rpm Omdreininger per minutt

RSD Relativt standardavvik

SDME Single drop microextraction

SLE Supported liquid extraction

SLM Supported liquid membrane

SNRI Serotonin-noradrenalin reopptakshemmer

(12)

3

SPE Solid phase extraction (Fast-fase ekstraksjon)

SRM Selected reaction monitoring

TBAP Tetrabutylammoniumfosfat

TBP Tributylfosfat

TDA Tetradecylammoniumbromid

TEAB Tetraetylammoniumbromid

TEHP Tris(2-etylheksyl)fosfat

TEHPi Tris(2-etylheksyl)fosfitt

TFA Trifluoreddiksyre

TIOPi Triisodecylfosfitt

TOA Trioktylamin

TPP Tripentylfosfat

UDPGT UDP-glukuronosyltransferase

UHPLC Ultra-high-pressure liquid chromatography

V Volt

VEN Venlafaksin

Å Ångstrøm

(13)

4

1. Innledning 1.1. Bakgrunn

Det er et stort behov for å måle legemidler, dopingmidler, narkotiske stoffer eller deres metabolitter i biologiske væsker som blod, urin eller spytt. Nytten av slike målinger er spesielt synlig i terapeutisk legemiddelmonitorering, dopingkontroll eller rettstoksikologi. Slike målinger kan også ha høy relevans i legemiddelutvikling (drug discovery). Formålet med dem er å identifisere og bestemme konsentrasjonen av de nevnte stoffgruppene (1).

Utfordringen er ofte en altfor kompleks sammensetning av matriks som forhindrer direkte injeksjon av prøven i det analytiske instrumentet. Faren for forurensing av instrumentet eller oppnåelse av unøyaktige resultater skaper behovet for et foregående trinn. Det er kjent som prøveopparbeidelsestrinnet. Dets hovedformål er å gjøre prøven kompatibel med etterfølgende separasjon og deteksjon (1, 2).

De veletablerte teknikkene som væske-væske ekstraksjon (liquid-liquid extraction: LLE) og fast-fase ekstraksjon (solid phase extraction: SPE) er fortsatt mye brukt.

Ekstraksjonsmekanismene er godt kjent og begge har mange anvendelsesområder (1, 3).

Automatiseringspotensial, mindre prøvevolumer samt løsemiddel forbruk og forbedret tidseffektivitet var faktorer som initierte interessen for å miniatyrisere teknikkene. LLE ble videreutviklet til væske-fase mikroekstraksjon (liquid-phase microextraction: LPME) (4, 5).

Hollow-fibre liquid phase microextraction (HF-LPME) er en form av LPME som ble introdusert på slutten av 1990-tallet (6). Den teknikken kan opereres i et tre-fase system som gir muligheten for en selektiv ekstraksjon av analytter fra den vandige donorfasen via supported liquid membrane (SLM) med organisk fase til den vandige akseptorfasen. Donorfasen inneholder prøven mens akseptorfasen er løsningen som kan injiseres direkte i LC-MS (7).

Utfordringer knyttet til automatisering av den sistnevnte teknikken førte til utvikling av parallel artificial liquid membrane extraction (PALME) som i stor grad ligner på HF-LPME (8).

PALME er konstruert av to 96-brønnsplater som klemmes sammen under ekstraksjon. Den ene kalles for donor- mens den andre for akseptorplaten og inneholder henholdsvis donor- og akseptorfasen. De separeres fra hverandre med en flat SLM som forsegler bunnen av akseptorplaten (8). Ekstraksjonsprinsippet baseres på diffusjonen av analytter fra donorfasen via SLM til akseptorfasen. Prosessen fremmes blant annet av riktig pH-justering som påvirker distribusjonskoeffisienter og risting av platene. Det organiske løsemiddelforbruket i PALME overskrider vanligvis ikke 500 µl for 96 prøver. Analytter, som for eksempel legemiddelstoffer,

(14)

5

i biologiske prøver med et volum på opptil 250 µl kan ekstraheres ved bruk av PALME (8). En av de store fordelene med PALME er akseptorfasen som er kompatibel med LC-MS.

Fordampning av løsemiddel og gjenoppløsning i mobilfase før LC er således ikke nødvendig (8).

Publikasjonen hvor PALME ble introdusert bekreftet at denne teknikken var egnet for ekstraksjoner av hydrofobe basiske legemidler som petidin, nortriptylin, metadon og haloperidol (8). De etterfølgende studier utvidet applikasjonsområdet med sure legemidler og viste at PALME hadde potensialet for å rense plasmaprøven opp fra fosfolipider (9, 10). I nylig publiserte artikler ble PALME benyttet for ekstraksjoner av analyttblandingen som besto av nye psykoaktive substanser og polare legemiddelstoffer (11, 12). I den sistnevnte studiens hadde de basiske legemidlene log P-verdier mellom 1.3 til -0.29. Deres ekstraksjonsutbytter var mellom 50 og 89% (12). Disse studiene benyttet plasma eller fullblod som matriks og de benyttede analyttene var stort sett upolare forbindelser med log P>2 (8, 9, 11, 12). I denne masteroppgaven ble det benyttet en analyttblanding som hadde et bredere spekter av fysikalsk- kjemiske egenskaper i forhold til tidligere forskningsprosjekter. Analyttene omfattet således legemidlet venlafaksin (log P = 2.5), som var modersubstansen, og en rekke polare metabolitter.

Disse inkluderte glukuronidene (log P = -1.2) som var de mest polare analyttene med amfotære egenskaper. Plasma og fullblod som matriks ble erstattet med urin.

Polare metabolitter og særlig glukuronider er vanskelige å ekstrahere via SLM. Grunnen til dette er deres begrensede fordeling over i SLM (12). I et tidligere studie med HF-LPME ble det benyttet bæremolekyler i SLM for å fremme ekstraksjonen av polare legemidler der atenolol med log P på 0.01 var det mest hydrofile stoffet (13). Akseptorfasen besto av 50 mM HCl som ikke var det optimale løsemidlet for LC-MS på grunn av lav pH. En annen publikasjon relaterte til HF-LPME som studerte ekstraksjon av tre tetrasykliner som hadde log P-verdier mellom - 1.3 og -3.6 (14). Disse legemidlene hadde i likhet med glukuronider zwitterioniske egenskaper.

Ekstraksjon ble oppnådd med bruk av NaCl i akseptorfasen som ble etterfulgt av HPLC-UV deteksjon, men i kombinasjon med LC-MS er dette systemet lite attraktivt. I tillegg tyder tendenser på at ultra-high-pressure liquid chromatography (UHPLC) koblet med et massespektrometer (MS) får enda større betydning i de kommende årene (15). Grunnen til det er at UHPLC er en kostands- og tidseffektiv separasjonsmetode mens MS klarer å operere med lavere konsentrasjonsnivåer og høyere selektivitet i forhold til andre deteksjonsteknikker (1).

Få HF-LPME studier har beskrevet ekstraksjoner av analyttblanding som ligner på den fra denne studien ved samtidig bruk av LC-MS/MS. I en av dem ble østron, østradiol og

(15)

6

etinyløstradiol ekstrahert med tre tilhørende glukuronider. Denne analyttblandingen hadde log P-verdier mellom 1.1 og 4.2 (16). De var dermed to enheter høyere i forhold til dette prosjektet.

Akseptorfasen besto i tillegg av høykonsentrert saltløsning. Det skapte dermed kompatibilitet utfordringer med MS (16).

1.2. Hensikt

Som nevnt ovenfor, fokuserte de tidligere PALME forskningsprosjektene i stor grad på blandinger av forholdsvis upolare legemidler eller narkotiske substanser. Det er også få HF- LPME publikasjoner i dette tema. Hensikten med dette prosjektet var å utvide applikasjonsområdet til PALME. Det var ønskelig å undersøke om denne teknikken kunne ekstrahere enda mer polare analytter som i tillegg hadde amfotære egenskaper. Fokuset ble lagt på ekstraksjoner av modersubstansen og de tilhørende metabolittene fra biologisk matriks for å etterligne en reel situasjon. Ekstraktene skulle videre analyseres ved hjelp av UHPLC-MS/MS.

Dette konseptuelle arbeidet ble avsluttet med evaluering. Den hadde som formål å bekrefte kvaliteten av data.

Hensikten med dette prosjektet oppsummeres i den punktvise oversikten:

• Utvikle en UHPLC-MS/MS-metode for identifikasjon og kvantifisering av analyttene

• Undersøke om PALME er egnet for ett-trinnsekstraksjon av et basisk legemiddel og dets metabolitter med et bredt spekter av fysikalsk-kjemiske egenskaper

• Forbedre ekstraksjonen ved testing av ulike organiske løsemidler i SLM

• Optimalisere ekstraksjonsbetingelser for PALME fra urin

• Utføre evaluering av metoden

(16)

7

2. Teori

2.1. Analytter og matriks

2.1.1. Venlafaksin og dens metabolitter

Venlafaksin er en serotonin-noradrenalin reopptakshemmer (SNRI). Virkningen påvirker hovedsakelig nevrotransmitterne serotonin og noradrenalin som blir værende i den synaptiske spalten for lengre tidsperioder slik at signaloverføringen mellom nervene blir forbedret.

Venlafaksin er et legemiddel som brukes ofte ved behandling av depresjoner og angst (17, 18).

De terapeutiske dosene i plasma varierer mellom 100 og 400 ng/ml. De blir optimalisert individuelt med hensyn til indikasjon og type pasient (19).

Venlafaksin er et basisk legemiddel på grunn av tertiært amin i sin struktur, som metaboliseres i kroppen. Strukturen av venlafaksin og dens metabolitter er vist i figur 1. Cytokrom P450 (CYP450) systemet er en gruppe enzymer som er involvert i stor grad i de første trinnene av denne prosessen. Disse enzymene finnes i stort omfang i hepatocytter (20). Enzymet CYP2D6 spiller en avgjørende rolle i metabolismen av venlafaksin selv om 3A4 og 2C19 også er involvert. Individuelle genetiske variasjoner kan bidra til forandringer i metabolismeaktiviteten.

CYP450 demetylerer venlafaksin og gjør den dermed mer polar (17, 20). Metabolitter fra fase I viser mindre potent farmakologisk effektivitet, der den mest virksomme er O- desmetylvenlafaksin (18). De metaboliseres videre ved hjelp av UDPGT enzymer i fase II metabolisme til glukuronider. Disse er enda mer polare forbindelser som i tillegg får amfotære egenskaper (17). Over 90% av venlafaksin og dens metabolitter skilles ut med urinen (18).

(17)

8 Figur 1 Metabolismen av venlafaksin (17, 21)

2.1.2. Urin som biologisk matriks

Urin er et eksempel på en biologisk matriks. Den er enklere å samle opp enn blod, og sammensetningen er mindre utfordrende. Det er ingen fosfolipider, og forekomsten av proteiner er vanligvis svært liten. Det skyldes filtreringen i nyrene. I tillegg er den tilgjengelig i større volumer (22). Til tross for enklere sammensetning av urin, som i hovedsak består av vann, urea, kreatinin, ioner og en rekke organiske forbindelser, er den fortsatt uegnet for direkte injeksjon i de fleste analytiske instrumentene som eksempelvis LC-MS (22, 23).

Venlafaksin

↙ ↘

NDV ODV

↘ ↙

→

NODV NNDODV

↙ ↓

NODVGLU NNDODVGLU

(18)

9

Urin kan forårsake matrikseffekter som enten øker eller undertrykker signalet i LC-MS fra analytten når retensjonstiden er tilnærmet lik (2). Forandret desorpsjon av ioner i ionekilden, eller konkurranse om ladninger er mulige forklaringer for slike effekter i massespektrometre (1). Fortynningsgraden av urinen kan ha en viss effekt i denne prosessen. Kreatinin, som ofte blir brukt i målinger av fortynningsgrad, gir ikke alltid pålitelige resultater (2). Stor variasjon i betingelser mellom de ulike urinprøvene er også en utfordring ved måling av analytter.

Ionestyrken og pH er faktorer som raskt kan påvirkes av forandret kosthold eller væskeinntak (1). Den store variabiliteten kan ha negative konsekvenser for nøyaktigheten av kvantitative målinger.

2.2. Prøveopparbeidelse

Som nevnt ovenfor kan noen biologiske væsker ha en altfor kompleks sammensetning som umuliggjør direkte injeksjon i det analytiske instrumentet. Det er derfor viktig å ha et trinn som isolerer ønskede analytter og klargjør dem for analysen (1, 4). Prøveopparbeidelsestrinnet kan enten fjerne de uønskede komponentene eller isolere analytter. Det er et viktig trinn i analyseprosessen som bidrar til å minimere matrikseffekter på en mest mulig effektiv måte og å hindre kontaminering av instrumentet. Opprensning av prøven er spesielt viktig hvis analytter finnes i lave konsentrasjoner, typisk på nanogram per milliliter nivå (1, 3). Valg av riktig prøveopparbeidelsesteknikk vil være avhengig av flere faktorer. De kjemiske egenskapene og konsentrasjonsområde til analyttene, sammensetning av matriks eller type analyseinstrument er noen eksempler (1).

2.2.1. Væske-væske ekstraksjon

LLE er en veletablert prøveopparbeidelsesteknikk og samtidig utgangspunktet for utviklingen av den miniatyriserte versjonen som kalles for PALME (3, 8). Hovedprinsippet i LLE er å ekstrahere ønskede analytter fra den vandige biologiske prøven til den organiske fasen.

Forutsetningen er at de to fasene ikke er blandbare med hverandre slik at det dannes to separate lag (1). Ekstraksjonen er mest effektiv for ikke ladede analytter siden de har bedre løselighet i den organiske fasen. For å gjøre dem mest mulig hydrofobe er det viktig å eliminere eventuelle ladninger på funksjonelle grupper. Avhengig av de kjemiske egenskapene til analyttene kan dette oppnås ved å holde prøven to pH-enheter under eller over i forhold til pKa-verdien for henholdsvis syrer og baser (3).

(19)

10

Fordelingskoeffisienten (KD) beskriver distribusjonen av analytten basert på dens konsentrasjon i den organiske og vandige fasen. Ligning 1 som representerer det forholdet, viser at høy konsentrasjon i den organiske fasen krever en høy fordelingskoeffisient (1).

𝐾_𝐷 =^[𝐴^{𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘}^]

[𝐴𝑣𝑎𝑛𝑑𝑖𝑔] (Ligning 1)

I tillegg til pH blir fordelingen avhengig av egenskaper til det organiske løsemidlet og dets interaksjonsevner med analyttene. Blant de potensielle interaksjoner spiller hydrofobe van der Waals krefter, dipol- og hydrogenbindingsinteraksjoner en sentral rolle (1). Valg av det beste løsemidlet kan bli basert på Kamlet og Taft-parametere. De beskriver hydrogenakseptor, hydrogendonor og polaritet egenskaper til en rekke løsemidler (24). Temperatur er enda en faktor som kan påvirke fordelingen av analytten mellom to faser (25).

Ekstraksjonsutbytte i LLE er bestemt av fordelingskoeffisienten og volumet av begge faser som vist i ligning 2. Flere etterfølgende ekstraksjoner med mindre volumer istedenfor en med større volum gir bedre utbytter (1).

𝑅 = ^𝐾^𝐷^∗𝑉^{𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘}

𝐾_𝐷∗𝑉_{𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘}+𝑉_{𝑣𝑎𝑛𝑑𝑖𝑔} (Ligning 2) R = ekstraksjonsutbytte

Vorganisk = volum av organisk fase

Vvandig = volum av vandig fase KD = fordelingskoeffisienten

For å forbedre selektiviteten kan det innføres et ekstra trinn som kalles for tilbake-ekstraksjon.

Analyttene ekstraheres først fra den vandige fasen til den organiske fasen. I det påfølgende trinnet ekstraheres de tilbake til den andre vandige fasen som vanligvis er justert til en pH som fremmer ionisering. Alle de nøytrale forbindelser blir værende igjen i den organiske fasen mens de ioniserte vil diffundere ut. Tilbake-ekstraksjonen kan fjerne behovet for fordampning og gjenoppløsning siden den vandige fasen med analyttene er kompatibel LC-MS (1).

De store fordelene med LLE er fleksibilitet og svært mange anvendelsesområder. Evnen til å gi rene ekstrakter som fjerner de fleste forurensinger, muligheten for å oppnå konsentrerte prøver og relativt god kostnadseffektivitet er andre eksempler på de positive sidene ved denne teknikken. LLE er allikevel ikke fri for ulemper. Høyt forbruk av ofte toksiske løsemidler samt problemer som emulsjonsdannelse er utfordringer som må overvinnes. Det er også fortsatt få eksempler på automatisering av denne teknikken til tross for en del forsøk. Det gjør at teknikken er arbeidskrevende (25). Et eksempel på automatisert LLE er supported liquid extraction (SLE).

(20)

11

Prøven overføres til brønner og adsorberes av kiselgur. Påfølgende tilsetting av organisk løsemiddel tillater ekstraksjonen av analyttene. SLE kan utføres i 96-brønnsformat (1).

2.2.2. Væske-fase mikroekstraksjon

Disse ulempene var en av grunnene til utvikling av nye prøveopparbeidelsesteknikker i miniatyrisert skala. LPME er en miniatyrisering av LLE og ble introdusert i midten av 1990- tallet (5). Til tross for det var LLE og SPE fortsatt mye brukt i 2006 (4). Fra det tidspunktet ble det publisert signifikant flere artikler som beskrev LPME for ekstraksjoner av legemidler fra biologiske væsker (3). LPME kan utføres som single drop microextraction (SDME) og HF- LPME. Den sistnevnte teknikken var et mellomtrinn i utviklingen av PALME (3, 8). Begrenset forbruk av løsemidler, raskere opparbeidelse, automatiseringspotensiale og etter hvert grønn kjemi var drivkraften bak utviklingen av disse nye teknikkene (3, 4).

HF-LPME er en teknikk som ble innført av Pedersen-Bjergaard og Rasmussen (6, 7). Den er presentert i figur 2. I dette systemet omringer prøven, som kalles for donorfasen, et rør som er laget av en porøs polymer. Polypropylen er et eksempel på materiale som brukes for slike formål. Innsiden av røret er fylt med akseptorfasen som er fysisk adskilt fra donorfasen. En egnet organisk løsning fanges i membranporene og danner en SLM (7). En organisk løsning som akseptorfase brukes i to-fase-systemer mens en vandig løsning brukes i tre-fase-systemer.

Fordelingen av analytten i et tre-fase-system er representert i ligning 3 der kn er ekstraksjonskonstanter (26).

𝐴_{𝑑𝑜𝑛𝑜𝑟} 𝑘₁

→← 𝑘₂

𝐴_𝑆𝐿𝑀 𝑘₃

→← 𝑘₄

𝐴_{𝑎𝑘𝑠𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟} (Ligning 3)

Figur 2 Illustrasjon av tre-fase HF-LPME

(21)

12

Justering av pH i donor- og akseptorfasen er påkrevet hvis en selektiv ekstraksjon av sure eller basiske analytter er ønskelig. Løseligheten av analytten i donorfasen bør bli minst mulig for å fremme distribusjonen til SLM. Analytten bør derimot bli godt løselig i akseptorfasen for å fremme diffusjonen fra SLM. Riktig pH-justering hindrer også tilbake-ekstraksjon (7).

Konsentrasjon i akseptorfasen kan bli beskrevet av en kinetisk modell under forutsetning av at massetransporten gjennom SLM er det hastighetsbegrensende trinnet som sikres av tilstrekkelig omrøring av donorfasen. Det er representert i ligning 4. Det er en funksjon av tid som viser at i tillegg til fordelingskoeffisienten og konsentrasjonen i donorfasen vil volumer i systemet spille en avgjørende rolle på den endelige konsentrasjonen i akseptorfasen (27).

𝐶_𝐴_𝑖(𝑡) =^𝑉^𝐷^𝐶^𝐷𝑖

0−𝐶_𝐷𝑖(𝑡)(𝑉_𝐷+𝐾_𝑑𝑖∗𝑉_𝑚)

𝑉_𝐴 𝑡 ≥ 𝑡_𝑙𝑎𝑔 (Ligning 4) CA = konsentrasjon i akseptorfasen

VD = volum av donorfasen CD = konsentrasjon i donorfasen Vm = volum av SLM

VA = volum av akseptorfasen

Kd = distribusjonskoeffisient

C⁰D = opprinnelig konsentrasjon i donorfasen

t = tid

tlag = tidsforsinkelse

HF-LPME tillater flere modifikasjoner slik at denne teknikken åpner for mange anvendelsesområder. Blant mange studier som beviste fleksibiliteten, fantes forsøk som benyttet bæremolekyler for ekstraksjoner av polare stoffer eller belegg på membranen (kalt for moleculary imprinted polymer coated hollow fibers) (13, 28, 29). Bæremolekyler komplekserer med analyttene og danner et mer hydrofobt kompleks som er bedre løselig i den organiske fasen.

De dissosierer fra hverandre på grenseoverflaten mellom organisk- og akseptorfase slik at analytten frigjøres mens bærer forblir i SLM (30).

HF-LPME krever små volumer av organisk løsemiddel, er relativt enkelt og billig i bruk og ekstrakter egner seg for direkte injeksjon i kromatografiske instrumenter som eksempelvis LC- MS. På tross av stor vitenskapelig interesse for HF-LPME har det vært utfordringer knyttet til automatisering (31).

2.2.3. Parallel artificial liquid membrane extraction

PALME har mye felles med HF-LPME siden prinsipper bak transporten av analytten til akseptorfasen er svært like. Den store forskjellen er geometrien til membranen som er tynnere i forhold til HF-LPME og er flat. I tillegg er formatet av oppsettet basert på en plate med 96 brønner. De store fordelene med PALME er at teknikken er enklere å automatisere enn HF- LPME og at mange prøver kan ekstraheres parallelt (8, 31).

(22)

13

PALME består av en donor- og en akseptorplate. Begge platene er i 96-brønnsformat.

Akseptorplaten er tildekket med et lokk for å hindre fordampning av akseptorfasen.

Illustrasjonen av utstyret er presentert i figur 3. Donorplaten er laget av polypropylen, og hver brønn har et volum på 0,5 ml. Det optimale prøvevolumet ble funnet til å være 250 µl (8).

Akseptorplaten som finnes i samme format, har en porøs polyvinylidenfluorid (PVDF) membran som forsegler bunnen av hver brønn. På denne måten blir begge fasene separert fra hverandre når platene klemmes sammen (8). PVDF er ikke det optimale materialet, spesielt for analytter i svært lave konsentrasjoner, siden utbytte og påliteligheten av resultater kan bli forverret (8). Grunnen til det er ikke-spesifikke bindinger mellom analyttene og membranen.

For å dempe bidraget fra dem ble trioktylamin (TOA) tilsatt i noen av de tidligere prosjektene.

Det hadde som formål å hindre slike interaksjoner (8, 11). Andelen av TOA var ofte lav, for eksempel 1% av den organiske fasen som immobiliseres i membranporene (11). Det vanlige volumet av organisk løsemiddel som danner SLM, varierte i de fleste tilfeller mellom 3 og 5 µl (32). Dets løselighet i de vandige fasene og flyktighet bør bli lavest mulig for å sikre høy stabilitet av systemet. Det er relevant spesielt ved ekstraksjoner som kan ta opptil to timer (9, 32). Donorfasen er en blanding av en biologisk væske, en buffer som justerer til riktig pH og demper ioniseringen av analyttene, og eventuelt en intern standard. Analyttene blir da ekstrahert via SLM til akseptorfasen (32). Volum på 50 µl er vanlig siden det sikrer god oppkonsentrering og er praktisk i bruk. Mindre volumer av akseptorfase er vanskeligere å håndtere ved pipettering og øker faren for punktering av SLM med pipettespisser (8). Avhengig av egenskapene til analyttene skal akseptorfasen bli riktig tilpasset for å sikre ionisering og diffusjon ut fra SLM.

For basiske analytter er det vanlig å bruke en sur akseptorfase der maursyre er en mulig kandidat for slike formål. I tillegg til surgjøring har den god flyktighet og er dermed kompatibel med LC-MS (32).

(23)

14

Figur 3 Illustrasjon av PALME til venstre og en enkel brønn til høyre

For å sikre kontakten mellom donorfasen og den organiske fasen blir de sammenklemte platene ristet. Agitasjonen gjelder også akseptorfasen og sikrer tilstrekkelig masseoverføring i systemet (8).

PALME er et nytt konsept innenfor prøveopparbeidelse som allerede har klart å bevise et bredt spekter av anvendelsesområder. Denne teknikken klarte å ekstrahere både basiske og sure legemidler (8, 9). Det ble også dokumentert at PALME var effektiv for opprensing av prøven fra matrikskomponenter som eksempelvis fosfolipider (10). I likhet med HF-LPME er det en utfordring å transportere polare analytter med log P under 1-2 enheter gjennom SLM. Nylig ble det gjennomført forsøk med bæremolekyler som muliggjorde den transporten (12).

Elektromembranekstraksjon (Electromembrane extraction: EME) er en modifisert utvidelse av PALME der den passive diffusjonen av analytter blir stimulert av elektrisk spenning som tillater kortere ekstraksjonstider av analytter (33).

2.3. UHPLC

UHPLC er en type væskekromatografi som blir benyttet i stadig større grad (34). Den erstatter gradvis sin forgjenger, high-pressure liquid chromatography (HPLC), som har den samme oppbygningen. Mobilfasen fra reservoaret pumpes via injektor mot kolonnen der separasjonen av analyttene finner sted. De separerte analyttene blir senere målt i en detektor som befinner seg bak kolonnen (35). Den generelle oppbygningen av UHPLC instrumentet er vist i figur 4.

(24)

15 Figur 4 Generell oppbygning av UHPLC

Hovedfordelen med UHPLC ovenfor HPLC er mer robuste pumper som kan tåle trykk på inntil 1400 bar (1, 34). Muligheten for å pumpe med høyere trykk tillater bruk av stasjonærfasepartikler i sub-2-µm størrelsesområde. Partiklene er således vesentlig mindre enn i vanlig HPLC. Det er gunstig for oppnåelse av bedre effektivitet i systemet, som beskrives ved hjelp av høydeekvivalenten til en teoretisk plate (HEPT) (36). Van Deemter plot i figur 5 viser at mindre partikler selv ved høy hastighet av mobilfasen klarer å opprettholde relativt lave HEPT-verdier.

Figur 5 van Deemter plot representerer endring av HEPT som en funksjon av økende mobilfasehastighet for ulike partikkelstørrelser der 5 og 3.5 µm anvendes i HPLC, mens 1.5 µm i UHPLC (1)

(25)

16

De bør bli lave for å sikre høy effektivitet med mindre innflytelse av uønskede faktorer som bidrar til båndspredning. Diffusjonen i mobilfasen (A), eddy diffusjon (B) og massetransporten mellom stasjonær- og mobilfase (C), som er beskrevet nærmere i van Deemters ligning (ligning 5), er hovedfaktorer ved siden av mobilfasehastigheten (u) som kan påvirke HEPT (35).

𝐻𝐸𝑃𝑇 =^𝐴

𝑢+ 𝐵 + 𝐶𝑢 (Ligning 5)

I UHPLC brukes ofte kolonner som er kortere, har mindre indre diameter og er pakket med mindre partikler i forhold til kolonner i HPLC-instrumenter (34). Den radiale fortynningen blir dermed mindre (ligning 6) i UHPLC slik at analytter blir eluert i mer konsentrerte bånd. Det vil gi bedre signal på konsentrasjonsfølsomme detektorer (36, 37).

𝐷 = ^𝑐⁰

𝑐_𝑚𝑎𝑥 = 𝜀𝜋𝑟²(1 + 𝑘)√2𝜋𝐿𝐻/𝑣_𝑖𝑛𝑗 (Ligning 6) D = fortynning

c0 = konsentrasjonen i prøven cmax = konsentrasjonen i detektoren Ɛ = porøsitet

r = radius av kolonnen

L = lengden av kolonnen H = platehøyden

Vinj = prøvevolumet som injiseres k = konstant

I tillegg til forbedret sensitivitet oppnås lavere løsemiddelforbruk og kortere retensjonstider slik at tiden som kreves for analyse, reduseres. Disse fordeler gjør at UHPLC separasjoner kan utføres på kort tid, og at antall prøver som kan analyseres per time blir vesentlig høyere enn for HPLC (38).

Begge instrumenter har utover det mange felles egenskaper. En av dem er stasjonærfasen. Det finnes mange ulike materialer som kan gi forskjellige retensjonsmekanismer. Omvendt-fase- kromatografi er et av de viktigste prinsippene. Den kan baseres på sfæriske partikler som er laget av silika. De har ulike sidekjeder på overflaten. Oktadecyl, som også kalles for C18, er en vanlig sidekjede. Det er en svært hydrofob stasjonærfase som har mange anvendelsesområder (1, 36). Det er allikevel ikke mulig å feste C18-grupper på alle silanolgrupper på overflaten av silikapartikler. Grunnen til det er sterisk hindring. Det resulterer i dannelsen av såkalte restsilanolgrupper som kan føre til uønskede sekundære interaksjoner med basiske substanser.

Endcapping, det vil si derivatisering av disse gruppene, gjør at muligheten for slike reaksjoner blir betydelig redusert (35). En annen viktig utfordring som er knyttet til silikabaserte materialer

(26)

17

er deres stabilitet i basisk eller svært surt miljø. Slike stasjonærfaser vil løses opp i pH under 2 og over pH 8. Det er dermed viktig å bruke mobilfaser som er justert til pH mellom 2 og 8 (35).

Mobilfasen inneholder dermed en buffer i lav konsentrasjon som gjør at miljøet blir surt og stabiliteten til stasjonærfasen bevares. I tillegg spiller den en viktig rolle for retensjonen av analytter med funksjonelle grupper som lar seg ionisere. De andre bestanddeler av mobilfasen er vann og en organisk modifikator. Valg av organisk modifikator kan variere avhengig av ønsket anvendelse og type detektor. Metanol er ofte brukt for slike formål på grunn av lave kostnader og relativt lav toksisitet (1). Hvis stasjonærfasen baseres på C18-kjeder, bør det alltid være minst 5% av organisk modifikator for å opprettholde tilstrekkelig påsetingskapasitet. På denne måten sikres aktivisering av stasjonærfasen (36). Sammensetningen av mobilfasen kan endres i løpet av analysen slik at elueringsstyrken blir påvirket. Det kalles for gradienteluering og krever minst 2 reservoarer med mobilfasen og et egnet utstyr som kan blande dem sammen i riktige proporsjoner. Den type eluering er egnet for analytter med lang retensjonstid. Ulempen med gradienteluering er blant annet behov for reekvilibrering, det vil si at mobilfasesammensetningen må tilbakeføres til den opprinnelige tilstanden for å sikre like elueringsbetingelser for alle prøver (1).

Prøveløsninger injiseres i mobilfasen og separeres på kolonnen. Retensjonen og dermed separasjonen er avhengig av fysikalsk-kjemiske egenskaper til analyttene. Retensjonen på omvendt-fase-kromatografi blir i stor grad avhengig av svake men frekvente van der Waals- krefter. De mest hydrofobe analyttene blir retardert kraftigere enn de mer hydrofile og vil dermed ha lengre retensjonstider. Mengden av organisk modifikator kan økes for å bryte de hydrofobe kreftene mellom analyttene og stasjonærfasen raskere slik at fordelingslikevekten blir skyvet mot mobilfasen. Det vil bidra til kortere retensjonstider. På slutten av kolonnen bør analyttene bli separert fra hverandre i smale bånd som overføres til detektor (1).

2.4. MS

UHPLC som er koblet sammen med MS er stadig mer brukt for bioanalyse deriblant applikasjoner som er knyttet til legemiddelmetabolisme (15). De kromatografiske toppene som dannes ved hjelp av UHPLC instrumenter, kan bli smale, og det er allment akseptert at en topp bør bestå av minst 10 målepunkter for å gi grunnlag for pålitelige kvantifiseringsdata (34, 39).

Dette øker kravet til detektoren som må ha høyere dataoppsamlingsfrekvens (34).

(27)

18

Ionekilden, masseanalysator og detektor er tre hovedelementer i MS som muliggjør deteksjonen av analytter (1). Hovedfokus i kommende avsnitt blir lagt på elektrospray-ionisering (ESI) som ionekilden, lineær ionefelle (LIT) som masseanalysator og relevante deteksjonsmodus.

2.4.1. Elektrospray-ionisering

ESI er en vanlig ionekilde som benyttes for analytter som uttrykker polare egenskaper, og som er mulige å ionisere. Den prosessen er vanligvis fremmet av riktig pH i mobilfasen som i tillegg må bestå av flyktige komponenter for å kunne bli brukt i MS detektoren (1). Skjematisk fremstilling av ESI er presentert i figur 6. Mobilfasen strømmer gjennom et kapillærrør som er koblet til en spenningskilde. Vanligvis er det +5 eller -5 kV som gjør at aerosoldråpene som dannes ved hjelp av nitrogengass, får ladning. Tilstrekkelig lav mobilfasehastighet må til for å danne aerosol som vil bidra til optimal ionisering og sensitivitet. Disse dråpene vil gradvis fordampe på sin vei mot masseanalysatoren. Det minkende overflatearealet vil ha samme antall ladninger som den opprinnelige større dråpen. Prosessen vil fortsette helt frem til dråpen oppnår Rayleigh-grensen. Det er det maksimale antall ladninger på en dråpe. Overskridelsen av denne grensen fører til ustabilitet av dråpen og Coulomb-fisjon. I den prosessen dannes mindre dråper.

Til slutt er det kun ioner som er igjen når hele væsken fordamper. ESI blir brukt i positiv modus for å detektere ioner som har positiv ladning (1, 40).

Figur 6 Skjematisk fremstilling av ESI

2.4.2. To-dimensjonal ionefelle

Ionefelle er en av flere tilgjengelige masseanalysatorer. De kan deles i to undergrupper som består av 3D og 2D ionefeller. LIT er et eksempel på en 2D ionefelle (1). Den har høyere kapasitet og klarer å fange ionene i betydelig større omfang i forhold til 3D. Den er sammensatt av fire staver som ligner på en kvadrupol med den forskjellen at de er separert fra hverandre i tre deler. Det er vist i figur 7. Ioner som strømmer inn fra ionekilden, blir fanget i den sentrale

(28)

19

delen av LIT. Det er mulig ved hjelp av riktig spenning som anvendes på begge ender av ionefellen (41). Radiofrekvent (RF) spenning er ansvarlig for å felle ioner radialt, mens likestrøm virker i den aksiale retningen. Helium, som er en kollisjonsgass, bremser ionene og hjelper til å fange dem i den sentrale delen (1, 41). Resonansen brukes for å skyte ut alle uønskede ioner fra LIT. Ioner som blir igjen i ionefellen, aktiveres, og ved hjelp av resonanseksitasjonen skjer det en fragmentering (41). Økende spenning skyter ut ionene fra ionefellen mot detektor der ioner med lavest m/z forlater fellen først. De treffer en elektronmultiplikator som er en detektor. Betydelig forsterket signal blir til slutt omdannet til et massespektrum av en egnet programvare (1).

Figur 7 Lineær ionefelle med radial utskyting av ioner

Beskrevet virkning av LIT relaterer til tandem MS. I dette systemet utføres to m/z-analyser som følger etter hverandre. Det ønskede molekylionet blir først isolert fra de andre ved hjelp av endring i radiofrekvensen og likestrøm. Etter fragmentering blir de spesifikke produktioner analysert på MS². LIT er en tandem-i-tid MS slik at alle operasjoner mellom ionisering og deteksjon av ionet foregår på samme sted. Instrumentet kan virke i ulike modus, men størst fokus blir lagt på det som kalles på engelsk for selected reaction monitoring (SRM). I SRM dannes et nytt massespektrum med helt unike fragmenter fra et bestemt ion slik at metoden sikrer høy spesifisitet og mye strukturelle informasjoner. I tillegg oppnås et mer gunstig forhold mellom signal og støy slik at bakgrunnsstøyen blir lavere (42).

(29)

20

3. Materialer og metoder

3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter

Tabell 1 presenterer fysikalsk-kjemiske egenskaper av alle analytter som ble benyttet i dette prosjektet. Molekylstrukturer er tilgjengelige i figur 1.

Tabell 1 Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter

Analytt Molekylvekt

(g/mol)

Molekylformel pKa log P Venlafaksin 277.40 C17H27NO2 9.26±0.28 2.48±0.27 O-desmetyl venlafaksin 263.38 C16H25NO2 9.33±0.28 1.74±0.26 N-desmetyl venlafaksin 263.38 C16H25NO2 10.44±0.20 2.55±0.26 N,O-didesmetyl

venlafaksin

249.35 C15H23NO2 10.59±0.20 1.81±0.26 N,N-didesmetyl O-

desmetyl venlafaksin

235.32 C14H21NO2 10.38±0.10 1.31±0.25 N,O-didesmetyl

venlafaksin glukuronid

425.47 C21H31NO8 COOH 2.78±0.70 NH

10.24±0.20

-0.69±0.47

N,N-didesmetyl O- desmetyl venlafaksin glukuronid

411.45 C20H29NO8 COOH 2.78±0.70 NH2

9.85±0.10

-1.19±0.46

Opplysninger er hentet fra www.scifinder.cas.org [12.03.2017] (43)

3.2. Utstyr

Tabell 2 viser alle komponenter av PALME. Det omfatter begge platene og aluminiumsfolie som tildekket akseptorplaten.

Tabell 2 Utstyr for PALME

Komponent Beskrivelse Produsent By/Land

Akseptorplate med lokk

MultiScreen®-IP 96-brønnsfilterplate MAIPN4550, klar styren, ikke steril, med Immobilon®-P PVDF membran, porestørrelse 0.45 µm

Millipore Darmstadt,

Tyskland

(30)

21 Aluminiumsfolie Platemax®

Pierceable

Aluminum Sealing Film

Axygen Inc. Union City, CA, USA

Donorplate 96-brønnsplate med 0.5 ml brønner, polypropylen

Agilent Santa Clara, CA, USA

Engangsutstyr som ble benyttet i løpet av prøveopparbeidelsen samt senere trinn av analyseprosessen er vist i tabell 3.

Tabell 3 Forbruksmateriell og engangsutstyr

Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land

Autosampler glassvialer

Vial Screw Neck N10-1.5, c, 11.6x32, flat

Nerliens Meszansky AS

Oslo, Norge

Dramglass Vials, glass, rolled rim, with plastic snap-cap, 10 ml

VWR International

Radnor, PA, USA Eppendorfrør Microcentrifuge tubes 1.5 ml

med lokk, polypropylen

BRAND GMBH + CO KG

Wertheim, Tyskland Filtreringsvialer Syringeless Filter Device Mini-

UniPrep™, PTFE filter media with polypropylene housing, porestørrelse 0.2 µm

GE Healthcare Buckinghamshire, England

Glassvialer for organisk fase

Clear 2ml Screw Top Vial 12 x 32

Supelco Bellefonte, PA, USA

Innsats til vialer Mikroinnsats, klart glass, 15 mm topp, 0.1 ml, 31 x 6 mm

VWR International

Radnor, PA, USA Kork til vialer 9mm PPShrtThrdCp, trans,

PTFEvirginal, 53°D, 0.2mm

Nerliens Meszansky AS

Oslo, Norge

Kork til vialer med organisk fase

8mm Open Top Screw Cap, 8- 425 thread, 5mm hole,

polypropylene, septum hvit silikon/rød PTFE

Thermo Scientific

San Jose, CA, USA

Løsemiddel reservoar

VWR Reagent Reservoir, 25 ml, PS, ikke steril

VWR International

Radnor, PA, USA pH-papir Universalindikator pH 0-14 Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland Urinbeger Steril, 100 ml, polypropylen VWR

International

Radnor, PA, USA

(31)

22

Pipetter og tilhørende utstyr som ble benyttet i dette prosjektet er vist i tabell 4.

Tabell 4 Pipetter

Mekanisk multikanal pipette med justerbart volum og 8 kanaler

mLINE 5-100 µl, 30-300 µl Sartorius Göttingen, Tyskland Mekanisk pipette med

justerbart volum

Sartorius mLINE 0.5-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100- 1000 µl, 500-5000 µl

Sartorius Göttingen, Tyskland Pipettespisser Optifit Refill Tips 0.1-10 µl, 0.5-

200 µl, 5-350 µl, 10-1000 µl, 100-5000 µl, ikke steril

Sartorius Göttingen, Tyskland Stepper Eppendorf Multipette® Plus Eppendorf AG Hamburg,

Tyskland

Tabell 5 presenterer analyseinstrumenter inkludert kolonnen, gass og programvaren som var uforandrete variabler.

Tabell 5 Analyseutstyr

Gass Helium 6.0 Ultra Plus Yara Praxair Oslo, Norge

Kolonne Acquity UPLC® HSS T3 kolonne, 100 mm x 2.1 mm ID, partikkelstørrelse 1.8 μm og porestørrelse 100 Å

Waters Wexford, Irland LC Dionex UltiMate 3000 RS Pump, Column

Compartment og Autosampler

Thermo Scientific

San Jose, CA, USA MS Thermo Scientific LTQ XL Linear Ion Trap

Mass Spectrometer

Thermo Scientific

San Jose, CA, USA Programvaren Xcalibur version 2.2. SP1.48 Thermo

Scientific

San Jose, CA, USA

Elektroniske instrumenter som ble benyttet i ulike trinn av dette prosjektet er vist i tabell 6.

Tabell 6 Diverse utstyr

Analysevekt Mettler AE200 Mettler-Toledo International Inc.

Columbus, OH, USA

Analysevekt 2 Mettler Toledo XS205 Dual Range

Mettler-Toledo International Inc.

Columbus, OH, USA

(32)

23

Ovn Series FD Binder Tuttlingen, Tyskland

pH-meter 744 pH meter Metrohm Herisau, Sveits

Ristemaskin Heidolph Vibramax 100

Heidolph

Instruments GmbH

& Co.KG

Schwabach, Tyskland Vortexmaskin IKA® MS 3 digital IKA®-Werke GmbH

& Co. KG

Staufen, Tyskland

3.3. Kjemikalier

Tabell 7 presenterer identifikasjons- og kvalitetsdata av alle analyttene og intern standard.

Tabell 7 Referansestoffer Analytt Chemical

Abstracts Service (CAS) nummer

Renhet Produsent By/Land

Venlafaksin hydroklorid

99300-78-4 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

O-desmetyl venlafaksin

93413-62-8 ≥98.5%

(HPLC)

Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

N-desmetyl venlafaksin

149289-30-5 97% Toronto

Research Chemicals

Toronto, ON, Canada N,O-didesmetyl

venlafaksin

135308-74-6 98% Toronto

Research Chemicals

Toronto, ON, Canada N,N-didesmetyl

O-desmetyl venlafaksin hydroklorid

135308-76-8 98% Toronto

Research Chemicals

Toronto, ON, Canada

N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid hydroklorid

1021933-99-2 80% Toronto

Research Chemicals

Toronto, ON, Canada

N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid

1799830-07-1 95% Toronto

Research Chemicals

Toronto, ON, Canada

Venlafaksin-D6

hydroklorid

1062606-12-5 Certified reference material

(33)

24

Alle organiske løsemidler og ioniske væsker som ble testet i dette prosjektet er vist i tabell 8.

Tabell 8 Organiske løsemidler og ioniske væsker

Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land 1-Butyl-1-metylpyrrolidinium

bis(trifluorometylsulfonyl) imid

223437-11-4 High purity

Merck KGaA

Darmstadt, Tyskland 1-Heksyl-3-

metylimidazolium heksafluorofosfat

304680-35-1 99% Merck KGaA

Darmstadt, Tyskland 1-Heksyl-3-

metylimidazolium tris(pentafluoroetyl) trifluorofosfat

713512-19-7 High pure

Merck KGaA

Darmstadt, Tyskland

1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat

304680-36-2 99% Merck KGaA

Darmstadt, Tyskland 1-Metyl-3-oktylimidazolium

tetrafluoroborat

244193-52-0 99% Merck KGaA

Darmstadt, Tyskland 2-nitrofenyloktyleter

(NPOE)

37682-29-4 99% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Bis(2-etylheksyl)fosfitt 3658-48-8 96% Sigma- Aldrich

St. Louis, MO, USA

Dekanol 112-30-1 min

98%

Sigma- Aldrich

St. Louis, MO, USA

Dibenzylfosfitt 17176-77-1 NA Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Diheksyleter 112-58-3 97% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Dodecylacetat 112-66-3 ≥98% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Pentylbenzen 538-68-1 99% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Tributylfosfat 126-73-8 ≥99% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Triisodecylfosfitt 25448-25-3 NA Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

Trioktylamin 1116-76-3 NA Cognis

Corporation

Cincinnati, OH, USA

Tripentylfosfat 2528-38-3 min

97%

STREM Chemicals

Newburyport, MA, USA Tris(2-etylheksyl)fosfat 78-42-2 ≥98% Sigma-

Aldrich

St. Louis, MO, USA

(34)

25

Tris(2-etylheksyl)fosfitt 301-13-3 NA Sigma- Aldrich

St. Louis, MO, USA

NA = verdien er ikke tilgjengelig

Tabell 9 presenterer alle ioniske bærere som ble benyttet i dette prosjektet.

Tabell 9 Ioniske bærere

Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land

Aliquat 336 68603-15-6 NA Cognis

Corporation

Cincinnati, OH, USA Dodecyltrimetyl

ammoniumbromid

1119-94-4 approx. 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

Tetrabutyl ammoniumfosfat

5574-97-0 >97% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

Tetradecyl

ammoniumbromid

14937-42-9 >99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

Tetraetyl

ammoniumbromid

71-91-0 min 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

Tabell 10 presenterer kjemikalier som ble benyttet ved tillaging av mobilfaser, buffere og modifiserte akseptorfaser.

Tabell 10 Diverse stoffer

Kjemikalie CAS

nummer

Renhet Produsent By/Land Dimetylsulfoksid 67-68-5 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Kaliumjodid 7681-11-0 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland Kaliumklorid 7447-40-7 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland Magnesiumnitrat

heksahydrat

13446-18-9 min 99% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland

Maursyre 64-18-6 For mass

spectrometry, 98%

Metanol 67-56-1 Hypergrade

for LC-MS

Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Natriumbikarbonat 144-55-8 Pro analysi

min 99.5%

Merck KGaA Darmstadt, Tyskland

(35)

26 Natriumdihydrogenfosfat

monohydrat

10049-21-5 99-102%

ACS Reag Ph.

Eur

Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Natriumhydrogenfosfat

dihydrat

10028-24-7 99-102%

ISO Reag Ph.

Eur

Merck KGaA Darmstadt, Tyskland

Natriumhydroksid 1310-73-2 99.3% VWR

International

Radnor, PA, USA

Natriumjodid 7681-82-5 NA Sigma Aldrich St. Louis,

MO, USA Natriumkarbonat 497-19-8 Pro analysi

min 99.9%

Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Natriumklorid 7647-14-5 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland Trifluoreddiksyre 76-05-1 ReagentPlus®

99%

Urea 57-13-6 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,

Tyskland

Renset vann MilliQ water

purification system Ultrapure water (type 1)

Millipore Molsheim, Frankrike

3.4. Løsninger og buffere

3.4.1. Tillaging av buffere

Det ble brukt fosfat og bikarbonat-karbonatbuffere i forsøk. De hadde som formål å tilpasse pH til ønsket verdi i donorfasen. Buffere som er beskrevet i dette avsnittet ble tilberedt på bakgrunn av tabeller som finnes i vitenskapelig litteratur (44).

Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte pH-verdier 500 ml 0.1 M natriumkarbonat løsning

5.2992 g av natriumkarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann.

500 ml 0.1 M natriumbikarbonat løsning

4.2009 g av natriumbikarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann

Disse løsninger ble deretter blandet med hverandre i oppgitte forhold. Styrken på alle buffere i Tabell 11 er 0.1 M.

(36)

27 Tabell 11 Bikarbonat-karbonatbuffer – pH

pH Natriumbikarbonat Natriumkarbonat

Buffer 1 9.4 80 ml 20 ml

Buffer 2 9.5 70 ml 30 ml

Buffer 3 9.8 60 ml 40 ml

Buffer 4 9.9 50 ml 50 ml

Buffer 5 10.1 40 ml 60 ml

Buffer 6 10.3 30 ml 70 ml

Buffer 7 10.5 20 ml 80 ml

Tillaging av fosfatbuffer

100 ml 0.2 M natriumdihydrogenfosfat

2.7802 g av natriumdihydrogenfosfat monohydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann 100 ml 0.2 M natriumhydrogenfosfat

3.5629 g av natriumhydrogenfosfat dihydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann 19 ml av natriumdihydrogenfosfat ble blandet med 81 ml av natriumhydrogenfosfat. Den blandingen ble deretter fortynnet med 100 ml renset vann. Den endelige fosfatbufferen hadde styrke på 0.1 M, 200 ml volum og 7.4 pH-enheter.

Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte styrke

Det ble veid bestemte mengder av natriumbikarbonat og natriumkarbonat som vist i tabell 12. De ble senere overført til målekolber som ble fylt til 100 ml med renset vann.

Buffer med styrke på 0.1 M ble ikke tatt med i betraktning siden den var tilgjengelig fra før. Alle buffere representerer forhold 20:80 mellom henholdsvis natriumbikarbonat og natriumkarbonat. De hadde dermed lik pH på 10.5 enheter.

Tabell 12 Bikarbonat-karbonatbuffer – styrke

Buffer styrke (M) Natriumbikarbonat (g) Natriumkarbonat (g)

0.25 0.4200 2.1175

0.5 0.8401 4.2354

0.75 1.2607 6.3555

1 1.6810 8.4779

(37)

28 3.4.2. Løsninger

Maursyreløsninger

I tabell 13 presenteres fremgangsmåten som ble brukt for tilbereding av alle maursyreløsninger.

Tabell 13 Maursyreløsninger med ulike styrker fra 1 mM til 200 mM Styrke (mM) Tilberedelsesmetode

1 20 ml av 5 mM maursyreløsning ble blandet med 80 ml av renset vann 5 50 ml av 10 mM maursyreløsning ble blandet med 50 ml av renset vann 10 37.7 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 20 75.5 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 50 189 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 75 283 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 100 377 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 150 566 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 200 755 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann

1 M NaOH-løsning

3.2555 g NaOH ble oppløst i 81.4 ml renset vann Organiske løsninger

På grunn av et stort antall organiske løsemidler oppgis kun en generell beskrivelse av fremgangsmåten som ble anvendt i alle tilfellene. Det gjelder både for blandinger av organiske løsemidler samt blandinger med ioniske bærere. Alle blandinger baseres på (w/w) forholdet der komponenten med lavest vekt ble veid først. Analysevekten (Mettler AE200) ble benyttet i alle tilfeller.

Trifluoreddiksyreløsninger (TFA)

Tabell 14 presenterer fremgangsmåten for trifluoreddiksyreløsninger med tre ulike styrker.

Tabell 14 Trifluoreddiksyreløsninger med ulike styrker fra 50 mM til 150 mM Styrke (mM) Tilberedelsesmetode

50 383 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann 100 765 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann 150 1148 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann

(38)

29 Maursyreløsninger med DMSO

I tabell 15 presenteres forhold mellom maursyreløsninger og dimetylsulfoksid i en 10 ml målekolbe.

Tabell 15 Løsninger av maursyre med DMSO i ulike forhold DMSO (%) Tilberedelsesmetode

25 20 mM maursyreløsning tilsatt 25% DMSO (v/v) 50 20 mM maursyreløsning tilsatt 50% DMSO (v/v) 75 20 mM maursyreløsning tilsatt 75% DMSO (v/v)

«Kunstig urin»

«Kunstig urin» er en blanding av natrium- og kaliumklorid med eller uten urea. Det er forbindelser som forekommer i størst mengde. Data i tabell 16 viser innveide mengder av forbindelser som ble oppløst i 100 ml vann der mengden av Na⁺, Cl^-, K⁺ og urea varierer.

Mengden av Na⁺, Cl^- og K⁺ holdes konstant i løsninger med og uten urea. Mengder ble basert på rapporten som ble utarbeidet av Putnam (23).

Tabell 16 Mengden av Na⁺, Cl^-, K⁺ og urea i «kunstig urin»

Uten urea Med urea Høy andel Na⁺, Cl^- og K⁺ NaCl 0.9729 g 0.9695 g

KCl 0.4638 g 0.4647 g

Urea - 2.328 g

Middels andel Na⁺, Cl^- og K⁺ NaCl 0.6444 g 0.6447 g

KCl 0.3150 g 0.3159 g

Urea - 1.630 g

Lav andel Na⁺, Cl^- og K⁺ NaCl 0.2987 g 0.3006 g

KCl 0.1551 g 0.1562 g

Urea - 0.9286 g

Motioner i maursyreløsning

I tabell 17 presenteres fire motioner hvorav tre har ulike styrker. Løsninger ble forberedt ved å oppløse den veide mengden av motioner med 20 mM maursyreløsning i en 10 ml målekolbe.

Hver konsentrasjon av hvert motion ble laget som en separat løsning.

(39)

30

Tabell 17 Mengden av motioner med ulik styrke i 20 mM maursyreløsning

Styrke (M) KI Mg(NO3)2*6H20 NaI NaCl

0.1 0.166 g 0.256 g 0.150 g -

0.5 0.830 g 1.28 g 0.750 g -

1 1.66 g 2.56 g 1.50 g 0.585g

3.4.3. Stamløsninger

Analytter ble veid ved hjelp av Mettler Toledo XS2015 Dual Range, og en bestemt mengde av metanol ble brukt for å oppløse dem til en konsentrasjon på 1 mg/ml. N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid er et unntak som ble oppløst til konsentrasjon på 0.8 mg/ml.

Disse løsninger ble oppbevart ved -24^oC.

3.4.4. Arbeidsløsninger

Arbeidsløsninger ble laget direkte fra stamløsninger. 100 µl av hver analytt og 125 µl av N,O- didesmetyl venlafaksin glukuronid ble pipettert til en målekolbe som ble deretter fylt opp til 10 ml med renset vann. Blandingen av analytter ble deretter fordelt i eppendorfrør. Hvert rør inneholdt 500 µl av arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml.

Arbeidsløsninger ble benyttet for tillaging av analyttblandinger for både vandige og biologiske prøveløsninger.

Arbeidsløsninger ble oppbevart ved -24^oC.

3.4.5. Standarder

Standarder ble laget fra arbeidsløsninger. Et bestemt volum av arbeidsløsningen ble pipettert over til målekolben med et volum på 5 eller 10 ml. Kolben ble deretter fylt med renset vann opptil målestreken. Etter at løsningen ble ristet godt, ble den pipettert til innsats som ble plassert inn i vialer til UHPLC.

Standarder ble oppbevart ved -24^oC.

3.4.6. Internstandard

Venlafaksin-D6 hydroklorid representert i figur 8 var en ferdiglaget kommersielt tilgjengelig intern standard som ble benyttet i dette prosjektet. Det var en løsning i metanol med en konsentrasjon på 100 µg/ml.

(40)

31 Intern standard ble oppbevart ved -24^oC.

Figur 8 Molekylstruktur til venlafaksin-D6 hydroklorid

3.4.7. Biologisk matriks

Urin ble samlet fra forskjellige donorer på Farmasøytisk Institutt. Urinen ble enten umiddelbart brukt eller oppbevart i kjøleskapet mellom 2^oC og 8^oC.

3.4.8. Mobilfaser Mobilfase A

716 µl konsentrert maursyre blandes med 950 ml renset vann. 950 ml 20 mM av maursyreløsning blandes deretter med 50 ml metanol.

Mobilfase B

38 µl konsentrert maursyre blandes med 50 ml renset vann. 50 ml 20 mM av maursyreløsning blandes deretter med 950 ml metanol.

Mobilfase C/D

500 ml renset vann blandet sammen med 500 ml metanol.

Seal wash

450 ml renset vann blandet sammen med 50 ml metanol.

3.5. Instrumentelle betingelser

3.5.1. UHPLC

UHPLC, kolonnen og programvaren som ble benyttet i dette prosjektet, er beskrevet i tabell 5.

Metoden benyttet gradienteluering av mobilfase A og B. Den er beskrevet i tabell 18.

Temperaturen var innstilt til 40^oC i løpet av hele sekvensen. Injeksjonsmetoden var partial loop og injeksjonsvolumet var 2 µL.