Proteolyse på papir
Undersøkelse av kovalent bundet trypsin for smartere prøveopparbeidelse
Minh Thao Nguyen
Masteroppgave i legemiddelanalyse 45 studiepoeng
Seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt
Det matematisk-vitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
Mai 2021
!
Proteolyse på papir
Undersøkelse av kovalent bundet trypsin for smartere prøveopparbeidelse
Minh Thao Nguyen
Seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt
Det matematisk-vitenskapelige fakultet
UNIVERSITETET I OSLO
Mai 2021
Veiledere:
Professor Léon Reubsaet, Farmasøytisk institutt, Universitet i Oslo Professor Trine Grønhaug Halvorsen, Farmasøytisk institutt, Universitet i Oslo
© Minh Thao Nguyen 2021
Proteolyse på papir
Undersøkelse av kovalent bundet trypsin for smartere prøveopparbeidelse Minh Thao Nguyen
http://www.duo.uio.no
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo !
Sammendrag
Dried Blood Spots (DBS) er en prøvetakingsteknikk hvor en bloddråpe påføres direkte på filterpapir i et prøvekort som tørkes i romtemperatur før den lagres eller transporteres videre til et laboratorium.
Proteinanalyse ved hjelp av væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) fra DBS er en tidskrevende prosess, slik at det kan være hensiktsmessig å inkorporere deler av
prøveopparbeidelsen i papiret. Dermed kan store deler av forarbeidet være unnagjort til prøven ankommer laboratoriet, og det kun er nødvendig med en enkel, kort ekstraksjon før målrettet analyse. I denne oppgaven er det ønskelig å undersøke om trypsin, immobilisert på papir, kan brukes til å kløyve proteiner til peptider som i fremtiden kan brukes som en del av prøve- opparbeidelsen. Målet er å evaluere tryptisk proteolyse på papir sammenlignet med i løsning.
Innledende forsøk ble utført ved å sammenligne proteinbinding til KIO4-behandlet og ubehandlet papir. Dette ble gjort ved å farge bovint serumalbumin (BSA) bundet til papiret og vurdere farge- intensiteten. Til å bestemme trypsinaktiviteten ble to metoder benyttet, BAEE-assay og LC-MS/MS.
For å optimalisere LC-MS/MS metoden ble Tris HCl (pH~9) benyttet som vaskeløsning til å fjerne overflødig og adsorbert trypsin på papir. I tillegg ble reduksjon og alkylering av BSA i løsning og på KIO4-behandlet papir evaluert, og peptidproduksjon av BSA og cytokrom c på papir over tid ble sammenlignet med peptidproduksjon i løsning. Til slutt ble stabiliteten av trypsin immobilisert på KIO4-behandlet papir testet.
Gjennom farging av proteiner ble det vist at BSA binder sterkere til KIO4-behandlet enn ubehandlet papir, og at reduksjon av KIO4-behandlet ikke ga mer binding av BSA på papiret. Resultatene fra trypsinaktivitetsforsøkene viste at trypsinaktiviteten var høyere i løsning sammenlignet med på papir, samt at en større andel trypsin var bundet til KIO4-behandlet i forhold til ubehandlet papir.
Ved bruk av LC-MS/MS metode var det i tillegg mulig å observere metningspunktet til papiret hvor større mengder trypsin ikke ville binde mer til papiret. Det så ut til at 0,5 % (w/v) trypsin var den optimale konsentrasjonen å bruke til immobilisering. Ved reduksjon og alkylering av BSA i løsning og på KIO4-behandlet papir ble det observert ingen signalintensitet, verken ved å redusere og alkylere før eller etter tryptisk proteolyse. Peptidproduksjonen var stort sett høyere i løsning enn på KIO4-behandlet papir og tryptiske peptider økte med tiden. Det ble observert høyere
signalintensiteter av autolyseproduktene i løsning enn på KIO4-behandlet papir, hvor autolysen var minst 80 ganger større. Trypsin-immobiliserte papirdisker oppbevart i kjøleskap var mer stabil over tid sammenlignet med i romtemperatur, hvor diskene oppbevart i romtemperatur ble påvirket etter 60 dager og absorberte proteinløsning dårligere.
Totalt sett kan det konkluderes med at trypsin bundet til KIO4-behandlet papir har mange fordeler sammenlignet med binding til ubehandlet papir og proteolyse i løsning. I tillegg er stabiliteten av papirdiskene gode, og det ser ut til at det er mulig å oppbevare diskene i kjøleskap opptil fire måneder etter immobilisering og vask. Trypsin immobilisert på KIO4-behandlet papir kan i fremtiden brukes som en del av prøveopparbeidelsen, og erstatte papiret i DBS-prøvekortet.
Forord
Jeg vil først og fremst rette en stor takk til mine dyktige og hjelpsomme veiledere Léon Reubsaet og Trine Grønhaug Halvorsen for god oppfølging og veiledning under arbeidet med masteroppgaven.
Dere har til enhver tid vært lett tilgjengelig, tatt dere tid til å svare på store og små spørsmål, og jeg har lært mye av dere.
Takk til alle ved avdeling for legemiddelanalyse for et hyggelig og lærerikt arbeidsmiljø, og for hjelpen jeg har fått underveis. Videre vil jeg takke Malin og Rebecca for fem fine år med mye latter og moro, og faglige og ikke-faglige stunder. Studietiden hadde ikke vært det samme uten dere.
Til slutt vil jeg takke min kjære familie for all oppmuntring og støtte gjennom studiet og ellers i livet. Uten dere hadde jeg ikke vært der jeg er i dag.
Oslo, mai 2021
Thao Minh Nguyen
!
Innholdsfortegnelse
Sammendrag ... V Forord ... VII Innholdsfortegnelse ... VIII
0. Forkortelser ... 1
1. Innledning ... 4
1.1 Bakgrunn ... 4
1.2 Hensikt ... 6
2. Teori ... 7
2.1 Proteiner ... 7
2.1.1 BSA ... 8
2.1.2 Cytokrom c ... 9
2.2 Bearbeiding av filterpapir ... 9
2.2.1 Funksjonalisering ved bruk av KIO4 ... 12
2.2.2 Funksjonalisering ved bruk av KIO4, etterfulgt av reduksjon ... 12
2.3 Immobilisering av proteiner ... 13
2.3.1 Immobilisering av trypsin på papir ved adsorpsjon ... 15
2.3.2 Kovalent immobilisering av trypsin på papir ... 15
2.4 Proteinanalyse ved bruk av LC-MS/MS ... 16
2.4.1 Prøveopparbeidelse ... 16
2.4.2 Enzymatisk proteolyse ... 17
2.4.3 Deteksjon av peptider ved bruk av LC-MS/MS ... 18
3. Materialer ... 23
3.1 Kjemikalier, proteiner og utstyr ... 23
3.2 Tillaging av løsninger ... 27
3.2.1 Protein-, substrat- og trypsinløsninger ... 27
3.2.2 Bufferløsninger ... 28
3.2.3 Løsninger for tillaging eller redusering av KIO4-behandlet papir ... 29
3.2.4 Løsninger til karakterisering av BSA på papir ... 29
3.2.5 Løsninger til redusering og alkylering av BSA ... 29
3.2.6 pH-regulerende løsninger ... 30
3.2.7 Løsninger knyttet til kromatografi ... 30
4. Metoder ... 31
4.1 Adsorpsjon og kovalent binding av BSA samt CBB-farging ... 31
4.1.1 Tillaging av ubehandlet disker ... 31
4.1.2 KIO4 funksjonalisering av ubehandlet disker ... 31
4.1.3 Immobilisering av BSA på KIO4-behandlet og ubehandlet disk ... 31
4.1.4 Farging av proteiner ... 31
4.2 Adsorpsjon og kovalent binding av trypsin samt BAEE-assay ... 32
4.2.1 Immobilisering av trypsin ... 32
4.2.2 Klargjøring av trypsinløsning til aktivitetsmåling ... 32
4.2.3 Aktivitetsmåling i UV-spektrofotometer ... 33
4.3 Vaskeprosedyre til KIO4-behandlet og ubehandlet disk ... 33
4.4 Tryptisk proteolyse i løsning og på disk ... 34
4.4.1 Tryptisk proteolyse i løsning ... 34
4.4.2 Tryptisk proteolyse på KIO4-behandlet og ubehandlet disk ... 34
4.4.3 LC-MS/MS analyse ... 34
4.5 Reduksjon og alkylering av BSA i løsning og på disk ... 35
4.5.1 Klargjøring av KIO4-behandlet disk ... 35
4.5.2 Evaluering av DTT og TCEP som reduksjonsmiddel ... 35
4.5.3 Tryptisk proteolyse før reduksjon og alkylering av BSA ... 36
4.5.4 Tryptisk proteolyse etter reduksjon og alkylering av BSA ... 36
4.5.5 LC-MS/MS analyse ... 36
4.6 Tryptisk proteolyse i løsning og på KIO4-behandlet disk over tid ... 37
4.6.1 Klargjøring av KIO4-behandlet disk til proteolyse ... 37
4.6.2 Proteolyse av BSA og CytoC i løsning og på KIO4-behandlet disk ... 37
4.6.3 Reduksjon og alkylering av BSA og CytoC ... 37
4.6.4 LC-MS/MS analyse ... 37
4.7 Stabilitet av trypsin-immobiliserte disker ... 38
4.7.1 Klargjøring av disker til proteolyse ... 38
4.7.2 Tryptisk proteolyse av CytoC og LC-MS/MS analyse ... 38
4.8 Instrumentelle betingelser ... 39
4.8.1 HPLC-parametere ... 39
4.8.2 MS/MS-parametere ... 41
5. Resultater og diskusjon ... 44
5.1 Proteinbinding på filterpapir ... 44
5.2 BAEE-assay ... 46
5.3 Tryptisk proteolyse i løsning og på papir ... 50
5.3.1 Vaskeprosedyre til KIO4-behandlet og ubehandlet disk ... 50
5.3.2 Effekt av trypsinkonsentrasjon ... 51
5.3.3 Evaluering av DTT og TCEP som reduksjonsmiddel ... 54
5.3.4 Reduksjon og alkylering før og etter proteolyse av BSA på papir ... 55
5.3.5 Tryptisk proteolyse av BSA og CytoC over tid ... 56
5.3.6 Stabilitet av trypsin-immobiliserte disker ... 60
6. Konklusjon ... 63
Litteraturliste ... 64
Vedlegg ... 68
!
0. Forkortelser
∆A253 Endring ved absorbans 253 nm
ABC Ammonium bikarbonat
ACN Acetonitril
B KIO4-behandlet (disk)
BAEE Nα-Benzoyl-L-arginin etyl ester, trypsinsubstrat
BR Redusert-behandlet (disk)
BSA Bovint serumalbumin
CBB Coomassie Brilliant Blue, fargestoff CID Kollisjonsindusert dissosiasjon CytoC Cytokrom c, protein
DBS Dried Blood Spots
DTT 1,4-dithiothreitol ESI Elektrosprayionisering
GC-MS Gasskromatografi koblet til massespektrometri
HSA Humant serumalbumin
i.d. Indre diameter
in-sol In solution, i løsning
IS Intern standard
IAA 2-jodeddiksyre
Kjøl Kjøleskap
LC Væskekromatografi
LC-MS Væskekromatografi koblet til massespektrometri
LC-MS/MS Væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri
m/z Masse-ladning forhold
MeOH Metanol
MS Massespektrometri
MS/MS Masseanalysator
o/n Over natt
PBS Phosphate-buffered saline, fosfatbuffret saltvann
Q1 Første masseanalysator
Q2 Andre masseanalysator
Q3 Tredje masseanalysator
Red/alkyl Reduksjon og alkylering
rpm Revolutions per minute, omdreininger per minutt
RT Romtemperatur
SRM Selektiv reaksjonsmonitorering TCEP Tris-(2-karboksyetyl)-fosfin
TQMS Trippelkvadrupol massespektrometri TSH Thyreoideastimulerende hormon
UB Ubehandlet (disk)
«1-bokstav forkortelse» av aminosyrer
A Alanin
C Cystein
D Asparaginsyre
E Glutaminsyre
F Fenylalanin
G Glycin
H Histidin
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Metionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Treonin
V Valin
W Tryptofan
Y Tyrosin
!
1. Innledning
1.1 Bakgrunn
Dried Blood Spots (DBS) er en prøvetakingsteknikk (microsampling) som har blitt benyttet i flere tiår. Med et stikk på finger eller hæl, påføres bloddråpen direkte på filterpapir i et prøvekort som tørkes i romtemperatur før den enten lagres eller transporteres med vanlig post (uten behov for kjølig oppbevaring underveis) til et laboratorium for enkel prøveopparbeidelse før analyse [1]. På den måten er det mulig for pasienter å ta blodprøven hjemmefra eller andre steder, i tillegg til blodprøvetakingssted [2].
Den første anerkjente, praktiske bruken av DBS var på tidlig 1900-tallet, hvor Ivar Christian Bang påførte et par bloddråper på forhåndsvasket og tørket filterpapir, etterfulgt av prøveopparbeidelse for å anslå glukoseinnholdet i blodet [2, 3]. Bangs arbeid har bidratt til at DBS har påvirket flere analytiske områder som farmasøytisk bioanalyse, screening hos nyfødte (f.eks. sjekk for medfødt metabolsk sykdom), immunologi, infeksjonssykdommer, etterforskning, toksikologi m.fl. [2, 4].
Ved bruk av prøvetakingsteknikken er det i dag mulig å analysere flere diagnostiske biomarkører og små molekylære legemidler i fullblod enn tidligere [5].
Hos nyfødte er det en utfordring at det tapes store mengder blod ved venepunksjon (0,5 mL) og at prosessen er vanskelig med tanke på barnets størrelse og mengde blod som trengs. Med DBS er det ikke nødvendig med store prøvevolum (DBS trenger mindre enn 100 μL) og prøvetakingen anses som lite invasiv, da det kan tas fra hæl eller finger [1, 5]. I tillegg er standardiserte prøvetakings- prosedyrer med på å luke vekk unøyaktighet og variabilitet i prøvevolum som for eksempel voksprintet sirkler på papir som skal kontrollere mengden blodprøve, samt at prøven ikke beveger på seg utenfor kortet ved påvirkning av miljøet [2].
DBS er en enkel og økonomisk teknikk å bruke, hvor det er mulighet for massetesting med minimal risiko for bakteriell infeksjon og/eller hemolyse. Prøven kan enkelt transporteres og lagres i lange perioder med nesten ingen eller lite nedgradering [1]. Fra erfaring forutsetter det at prøven ikke pakkes i vann- eller lufttett beholder som plast- eller foliepose. Årsaken til det er at beholderen vil hindre luftutveksling, slik at det oppstår varme og fuktansamling som kan nedgradere prøven og påvirke stabiliteten av de fleste analytter [2].
En annen utfordring er at et lite volum av blod innebærer også en lav mengde av analytter. Ettersom forekomsten av analytter i blod kan variere i stor grad, alt fra mg/mL til pg/mL, er det nødvendig med deteksjonsmetode som har høy sensitivitet og selektivitet [6].
Gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) har blitt brukt i over 40 år i forbindelse med DBS- analyse for separasjon og deteksjon av små, flyktige og varmeresistente molekyler/fragmenter.
Teknikken er selektiv, sensitiv og robust for mange DBS-analytter, men på grunn av behov for derivatisering er metoden mindre egnet for større og ikke-flyktige molekyler [5, 7]. Det var ikke før på 1990-tallet at væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) ble kommersielt tilgjengelig og brukt i forbindelse med DBS-analyse av varmefølsomme analytter, uten
begrensinger i molekylstørrelse. Teknikken er å fortrekke fremfor GC-MS grunnet forbedret sensitivitet, selektivitet og nøyaktighet, i tillegg til betydelig raskere og vanligvis mer kostnads- effektiv prosess [7].
LC-MS/MS med elektrosprayionisering (ESI) har også gjort det lettere å bestemme proteiner fra papir. Bestemmelse av proteiner fra papir utføres etter enzymatisk spalting av proteinene og vask/
ekstraksjon av prøven, før spesifikke peptider av det ønskede proteinet blir analysert i LC/MS-MS for identifisering [8]. Utfordringer i forbindelse med proteolyse er at deler av proteinet ikke blir spaltet til peptider eller at det blir produsert for lite peptider under prøveopparbeidelsen, slik at det ikke er mulig å si med sikkerhet at det undersøkende proteinet er tilstede [9].
I fremtiden er målet å inkorporere deler av prøveopparbeidelsen i filterpapiret (i DBS-prøvekortet), slik at store deler av forarbeidet er unnagjort når den ankommer laboratoriet og det kun er
nødvendig med en enkel, kort ekstraksjon før målrettet proteinanalyse. På denne måten sparer de som utfører diagnosetesting, prekliniske studier eller andre proteinanalyser tid, ettersom deler av arbeidet blir utført under prøvetaking og posttransport [5, 7]. Med det er det ønskelig å undersøke om trypsin, immobilisert på papir, kan brukes til å kløyve proteiner til peptider som i fremtiden kan brukes om f.eks. biologiske legemidler i serum, som en del av prøveopparbeidelsen [10].
1.2 Hensikt
Hovedmålet med oppgaven er å evaluere tryptisk proteolyse på papir ved å sammenligne med proteolyse i løsning. Det ble utført ved å immobilisere trypsin på papir, etterfulgt av kløyving av BSA og cytokrom c til peptider før LC-MS/MS analyse. For å oppnå dette ble følgende delmål satt:
- Sammenligne proteinbinding hos ubehandlet og KIO4-behandlet papir
- Bestemme trypsinaktiviteten i løsning og på papir ved bruk av BAEE-assay, og samtidig sammenligne andel trypsin bundet til papir versus i løsning
- Bestemme optimal trypsinkonsentrasjon til proteolyse på papir
- Vurdere effekten av reduksjon og alkylering før og etter proteolyse av BSA på papir - Undersøke tryptisk proteolyse i løsning og på papir over tid
- Evaluere stabiliteten av trypsin immobilisert på KIO4-behandlet papir
! !
2. Teori
2.1 Proteiner
Proteiner er store, komplekse molekyler bestående av et eller flere polypeptidkjeder, der hver av kjedene er bygd opp av aminosyrer bundet sammen via kovalent binding. Det er sammensetningen og antall aminosyrer som bestemmer proteinets struktur, størrelse og funksjon [11, 12]. Endring i temperatur og pH eller eksponering av kjemikalier kan føre til permanent endring i tertiær
strukturen som videre kan gi tap av funksjon eller denaturering av proteinet. Ved reversibel
denaturering kan proteinet få gjendannet sekundær- og tertiærstruktur og proteinet kan beholde sin funksjon. Det er ikke før denatureringen er irreversibel at proteinet mister sin funksjon på grunn av strukturen ikke kan gjendannes [12].
I kroppen har proteiner flere funksjoner og spiller en viktig rolle i mange av kroppens biologiske prosesser som å bygge og vedlikeholde celler og vev. Hemoglobin og albumin er eksempler på transportproteiner som frakter stoffer via blod og lymfe gjennom kroppen. Aktin og keratin danner strukturer i cellene, mens immunglobuliner forsvarer kroppen mot farlige stoffer/patogener.
Hormoner og enzymer er noen av andre proteintyper [12]. På bakgrunn av dette har det ført til bruk av proteiner som biomarkør til bestemmelse av diagnose, progresjon av sykdomsforløp, effekt av legemiddelbehandling eller doping [13]. Det kan være måling av thyreoideastimulerende hormon (TSH) og fritt-T4 for å identifisere om en pasient har primær hypotyreose eller ikke [14, 15].
Antistoffer som immunglobulin kan også benyttes som biomarkør. For eksempel brukes anti-
hepatitt A-virus immunglobulin M (anti-HAV IgM) til påvisning av hepatitt A i akuttfasen og minst 6 måneder etter infeksjon [16]. Andre områder proteinanalyse benyttes er innen matindustrien, der proteininnholdet bestemmes i matvarer eller med tanke på matsikkerhet [17]. I denne oppgaven benyttes bovint serumalbumin (BSA) og cytokrom c (CytoC) som modellproteiner i undersøkelse av tryptisk proteolyse på papir og i løsning.
2.1.1 BSA
Serumalbumin er et av proteintypene det finnes mest i av i humant serum med funksjoner som å transportere proteiner gjennom kroppen, beskytte mot frie radikaler og regulere osmotisk trykk [18].
Bovint serumalbumin (BSA), isolert fra storfe, substitueres ofte humant serumalbumin i protein- analyse som proteinstandard under laboratorieforsøk samt innen immunologi, biokjemi og bioteknologi [19]. BSA er å foretrekke som standard i proteinanalyse grunnet dens evne til å øke signal i analyser, tilgjengelighet og rimelighet, i tillegg til dens stabilitet, sensitivitet og
kompatibilitet med vanlige substanser i prøver (interferer ikke i biologiske reaksjoner) [20].
BSA er svært lik humant serumalbumin (HSA) i struktur, vist på Figur 2-1. Forløperne av BSA og HSA består av litt over 600 aminosyre-enheter, hvor det er 17 disulfidbroer innad proteinene og molekylvekten ligger på rundt 69 kDa [19, 21, 22]. I analyse blir forløperne omdannet til moden form der de 24 første aminosyrene kløyves vekk og molekylvekten reduseres til ~ 66,5 kDa [23].
Figur 2-1: Aminosyresekvensene av BSA og HSA, hvor merket aminosyre (cystein) danner disulfidbinding innad proteinet (cystein-cystein-binding). Sekvensene er hentet fra [19, 22].
1 MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD
81 ESHAGCEKSL HTLFGDELCK VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF KADEKKFWGK ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK
161 YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV
241 RLSQKFPKAE FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEND
321 IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL EMPADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE
401 KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV
481 NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT ALVELLKHKP LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRP CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ TALVELVKHK
561 KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV STQTALA
PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV AASQAALGL
← BSA
← HSA
2.1.2 Cytokrom c
Cytokrom c (CytoC) er et hemprotein som er å finne i cellens mitokondrie, hvor den spiller en viktig rolle i respirasjonskjeden via ATP-produksjon. Proteinet har også en annen viktig funksjon ved at den kan utløse programmert celledød (apoptose) gjennom frigjøring fra mitokondrienes ytre membran til cytosol etter mottakelse av stimuli [24-26].
CytoC er et velstudert protein som benyttes som proteinmodell og kontrollprotein innen analyse.
Det kommer av dens enkle og lille størrelse, i tillegg til at den har peptidsekvenser som gjør det mulig å gjenkjenne dens struktur ved proteolyse [27, 28]. Strukturen til cytokrom c fra hest (equine) er svært lik humant cytokrom c, som vist på Figur 2-2. De består av litt over 100 aminosyre-enheter der ti av aminosyrene er ulikt og molekylvektene er rundt 12 kDa [28].
Figur 2-2: Aminosyresekvensene av cytokrom c isolert fra equine og menneske, hvor merkede områder er aminosyrene som er ulikt hos mennesker og hest. Sekvensene er hentet fra [28].
2.2 Bearbeiding av filterpapir
Filterpapir brukes mye i laboratorieforsøk innen mange forskjellige fagområder, alt fra biologi til kjemi, og er å finne i mange ulike størrelser, materialer, typer og kvaliteter («grades»). Det kan være laget av materialene cellulose, glass-, bomull- eller kvartsfiber, til typene vist i Tabell 2-1 [29]. For eksempel er kromatografipapir laget av bomull og anvendes blant annet i rutineanalyse av protein i serum og analytisk separasjon [30].
1 MGDVEKGKKI FVQKCAQCHT VEKGGKHKTG PNLHGLFGRK TGQAPGFTYT DANKNKGITW KEETLMEYLE NPKKYIPGTK MGDVEKGKKI FIMKCSQCHT VEKGGKHKTG PNLHGLFGRK TGQAPGYSYT AANKNKGIIW GEDTLMEYLE NPKKYIPGTK
81 MIFAGIKKKT EREDLIAYLK KATNE MIFVGIKKKE ERADLIAYLK KATNE
← Equine
← Human
Tabell 2-1: Utvalgte papirtyper og deres anvendelses områder før/etter modifisering [29-32].
Papirtype Materiale Anvendelsesområder
Fusion 5 Glass fiber Nukleinsyre ekstraksjon
Kromatografipapir Cellulose
Analyse av protein i serum, analytisk separasjon (kromatografi), lagring og samling av prøver
«Ekstraksjonspropp»
(Extraction Thimbles)
Cellulose/glassfiber/
kvartsfiber
Soxhlet ekstraksjon til bestemmelse av fett, lipider, tilsetningsstoffer eller annet innen matindustrien, analyse av varme og sure gasser, luftprøvetaking
Whatman® cellulose
kvalitativ filterpapir Cellulose
Passer til stort utvalg av generelle analyser (det meste). Bestemmelse og identifisering av materialer.
Whatman® kvartsfiber
filterpapir Kvartsfiber
Analyse av varme og sure gasser,
overvåkning av utslipp ved høye temperatur (luftforurensning), analytisk og
gravimetrisk analyse
Kvaliteten av papiret er basert på varierende egenskaper som partikkelretensjon/filtreringshastighet, porestørrelse, tykkelse og vekten av papiret [33]. I noen tilfeller kan det være en fordel med store porer for flere muligheter til bindingssteder ved adsorpsjon på grunn av større overflateareal, mens ved filtrasjon kan det være ønskelig for å hindre større molekyler fra å passere. I andre tilfeller kan det være en fordel med mindre porer hvor det ikke er ønskelig at flertallet av bindingene skal være via adsorpsjon, men kovalent. Da blir overflategrupper funksjonalisert slik at de kan kovalent binde til et enzym, antistoff eller annet biomolekyl [29, 34]. Til prøvetaking er det mer ideelt å ikke velge et altfor tykk papir med tanke på tørketiden, men samtidig må prøvesettingskapasiteten tas med i betraktning. Andre områder filterpapir også benyttes er innen matindustrien og ved forurensnings- analyser [29].
For å kunne tilpasse papiret til ulike formål, finnes det en rekke metoder som blant annet endrer papirets overflategrupper og dermed papirets egenskaper og funksjonaliteter. De fleste papirtypene som benyttes til å samle biologiske væsker som blod ved prøvetaking er cellulosebaserte med hydroksylgrupper på overflaten som gir papiret hydrofile egenskaper [29, 35]. Cellulose og celluloselignende materialer er ideelle materialer på grunn av deres lave kostnader, ikke-toksiske egenskaper, fornybarhet, biodegraderbarhet og biokompatibilitet [36]. Avhengig av formålet med
prøvetakingen kan papirets egenskaper modifiseres for å for eksempel oppnå selektivitet eller stabilitet. Det kan være i form av å binde antistoffer til papirets overflate som har høy affinitet til en spesifikk målsubstans, eller det kan være påsetting av funksjonelle grupper på papirets overflate som kan bidra til sterk og stabil kompleks mellom enzym og papiret [37, 38]. Figur 2-3 viser noen metoder for å modifisere overflategrupper på ubehandlet cellulosebasert filterpapir. Den samme papirtypen blir benyttet videre i oppgaven.
Figur 2-3: Modifisering av overflategrupper på ubehandlet cellulosepapir. Figur hentet og modifisert fra [38-40].
1,4-fenylendiisotiocyanat (PDITC) aktivering av celluloseoverflate blir brukt til å detektere
nukleinsyre basert på DNA hybridiseringsreaksjon (paring mellom to komplementære enkelttrådede DNA-sekvenser). PDITC binder seg til hydroksylgruppen på papiret og gjør papiroverflaten mer mottakelig for immobilisering av aminert enkelttrådet DNA-sekvens før hybridisering [40].
For proteindeteksjon kan HEMA-VDM-polymerisering av papiroverflaten benyttes for å gjøre det mulig å binde antistoff kovalent til papiret. Det ubehandlede papiret forbehandles med NaOH, etterfulgt av silanisering for å danne siloksaner som polymeriseres med HEMA og VDM, og til slutt danner «bindepunkt» mellom antistoff og papiret. På denne måten vil det bli tilført funksjonelle grupper som kan danne kovalente interaksjoner [38].
En siste modifikasjonsmetode av overflategrupper på ubehandlet cellulosepapir er aldehyd-
funksjonalisering. Denne metoden benyttes i oppgaven sammen med ubehandlet cellulosepapir ved sammenligning av tryptisk proteolyse på papir og i løsning, og ses nærmere på i neste avsnitt.
2.2.1 Funksjonalisering ved bruk av KIO4
Aldehydfunksjonalisert filterpapir er bearbeidet fra ubehandlet cellulosepapir ved bruk av kaliumperiodat (KIO4). Periodat er en sterk oksidasjonsreagens som brukes til å kløyve to alkoholgrupper som ligge ved siden av hverandre (dioler) til aldehyd. For å endre papirets
overflategrupper benyttes en vandig løsning av KIO4 til å selektiv oksidere hydroksylgruppene på C2-C3 i glukoseenhetene for å gi dialdehyd produkt, som vist på Figur 2-4 [39, 41].
Figur 2-4: Kjemisk reaksjon av ubehandlet cellulosepapir til aldehydfunksjonalisert. Figur hentet og modifisert fra [39].
Videre vil aminogrupper på et enzym, antistoff eller annet biomolekyl kunne danne Schiff-base kobling med aldehydgruppene og immobilisere på overflaten av papiret [39]. Koblingen er et produkt av primær amin og aldehyd som oppstår lett i vanlig løsning, spesielt ved forhøyet pH.
Denne type binding er reversibel og ikke helt stabil, da den lett kan spaltes i vanlig løsning ved hydrolyse. Alkalisk pH kan forbedre stabiliteten, men i noen tilfeller er det nødvendig å redusere den funksjonelle gruppen imine (–C=N–) i Schiff-basen til sekundær eller tertiær amin for å oppnå stabilitet [42].
2.2.2 Funksjonalisering ved bruk av KIO4, etterfulgt av reduksjon
Schiff-base koblingen kan stabiliseres ved kjemisk reaksjon. Natriumborhydrid (NaBH4) eller natriumcyanohydrid (NaCNBH3) benyttes som reduksjonsmiddel til å redusere bindingen i Schiff- basen til sekundær- eller tertiær aminbinding for å oppnå stabilitet. På Figur 2-5 har aldehyd- gruppen på cellulosepapiret interagert med aminogruppen på et protein og dannet en Schiff-base, før den blir redusert med NaCNBH3.
Figur 2-5: Kjemisk reduksjon av Schiff-base på aldehydfunksjonalisert filterpapir. Figur hentet og modifisert fra [39].
Reduksjonsmiddelet NaCNBH3 benyttes til å redusere Schiff-basen til en sekundær aminbinding [39, 42]. NaCNBH3 er å foretrekke som reduksjonsmiddel fremfor NaBH4, ettersom sistnevnte vil kunne redusere reaktive aldehyder til hydroksyl samtidig som den reduserer Schiff-baser.
NaCNBH3 er en mildere og reduserer kun Schiff-baser og ikke aldehyder [42].
2.3 Immobilisering av proteiner
Immobilisering blir definert i Merriam-Webster (2021) som en prosess for å stanse noe eller noen fra å bevege seg fritt eller normalt. Bruken av immobilisering innen analytisk kjemi innebærer å binde proteiner som enzymer og antistoffer til et substrat, matriks, polymer eller annet overflate for å hindre de fra å bevege seg fritt. Det kan være i form av glass, aluminium, papir, silika gel eller alginatkuler [43]. Teknikken ble på tidlig 1900-tallet hovedsakelig brukt til å isolere proteiner via adsorpsjon på organiske flater som glass, mens i dag anvendes teknikken mer bredt og blant annet til diagnostikk og behandling av ulike sykdommer. For eksempel brukes det ved noen former for medfødt metabolsk sykdom, hvor enzymer innkapsles og brukes til å erstatte/korrigere enzym- mangel [43, 44]. Et annet bruksområde er immunoekstraksjon til påvisning av målsubstans. Da immobiliseres antistoffer (spesifikke for målsubstansen) kovalent til cellulosebasert filterpapir, etterfulgt av vask og ekstraksjon før analyse [38].
En av grunnene til at immobilisering benyttes er at det er sett at immobiliserte proteiner som
enzymer er mer stabile enn mobile/frie enzymer i løsninger, siden de har begrenset bevegelse på for eksempel papir. Dette er aktuelt for enzymet trypsin som har tendens til å spalte seg selv (autolyse) og bli mindre effektiv i tryptisk proteolyse. Kovalent immobilisering vil kunne redusere
forekomsten av sistnevnte. Videre er immobilisering en teknikk for å kunne hindre
proteindenaturering ved høye temperaturer hos noen proteintyper [45-47]. Stort sett kan alle proteiner immobiliseres, men det er vanligst å utføre teknikken på visse enzymer og antistoffer.
Når det kommer til metode gjennomføres det enten fysisk eller kjemisk. Adsorpsjon, innkapsling og inneslutning er fysiske immobiliseringsmetoder, mens kovalent- og kryssbinding er kjemiske [43].
Figur 2-6 viser oversikt over de ulike immobiliseringsmetodene ved bruk av enzym som immobiliserende protein [43, 48].
Figur 2-6: Oversikt over ulike immobiliseringsmetoder med enzym som immobiliserende protein.
Innkapsling (encapsulation) er en metode der immobiliserte proteiner blir omringet av sfærisk, semi-permeabel polymer membran. Proteinene er fysisk begrenset av membranen, og avhengig av porestørrelsen, kan substrater og produkter fritt diffundere gjennom membranen. Dermed er membranen bare en fysisk barriere for proteiner [43]. Inneslutningsmetoden (entrapment) er basert på å immobilisere/fange proteiner med biomaterialer i en polymerisert gel, film, partikkel eller nettverk ved kovalent eller ikke-kovalent binding. I likhet med innkapsling, holdes proteiner tilbake i metoden mens substrater og andre små produkter kan passere. Samtidig påvirkes ikke aktiviteten av proteinene i negativ retning i metodene og det er ikke nødvendig med kjemiske modifikasjoner av materialoverflatene [43, 48, 49].
På den andre siden har vi kryssbinding (cross-linking), en kjemisk immobiliseringsmetode som knytter flere proteiner sammen ved kovalent binding. Med denne metoden benyttes en ekstra komponent kalt «cross-linker» som binder flere proteiner sammen, og dermed virker som en polymeriseringsagent. Glutaraldehyd er en slik komponent som er populær å bruke fordi den er løselig i vandige løsemidler og kan danne stabile inter- og intra-kovalente bindinger, uten å påvirke proteinaktiviteten [43, 49].
Det ses nærmere på immobiliseringsmetodene adsorpsjon og kovalent binding som benyttes i oppgaven til å sammenligne proteinbinding hos KIO4-behandlet og ubehandlet papir.
2.3.1 Immobilisering av trypsin på papir ved adsorpsjon
Adsorpsjon er den enkleste metoden for immobilisering av trypsin og andre proteiner på papir, uten behov for kjemisk modifisering av papirmaterialet [50, 51]. Da legges papiret i en enzymløsning eller en liten mengde av løsningen kan dryppes på papiret og immobiliseres i en periode, alt fra minutter til timer (over natt), for å gi trypsin tid til å fysisk adsorbere på overflaten. Trypsin vil benytte de svake, ikke-kovalente interaksjonene ionebinding, hydrogenbindinger og van der Waals krefter til å adsorbere til overflaten [43, 45, 47]. Grunnet svake binder mellom enzymet og papiret, vil det kunne resultere i en reversibel prosess hvor adsorbert trypsin ikke lenger vil være bundet til papiret i like stor grad etter for eksempel, fysiske påkjenninger som vaskeprosedyre eller endringer i temperatur og pH [47, 50]. Dette kan være fordelaktig i tilfeller hvor det er ønskelig å vaske bort adsorbert trypsin fra KIO4-behandlet papir for å sammenligne andel bundet og ubundet med i løsning. Ettersom papiret ikke krever noen forbehandling ved immobilisering medfører det som regel ingen endring i enzymaktiviteten, med unntak av naturlige forekommende tilfeller som orientering av enzymet. Det er ikke mulig å ha kontroll på hvordan enzymet orienterer seg på papir ved adsorpsjon. Dette kan føre til at enzymet blir mindre tilgjengelig for enzymatisk proteolyse, samt at enzymene ligger orientert på en slik måte at de kan spalte seg selv eller nærliggende enzym, og dermed redusere enzym funksjonaliteten [43, 47].
2.3.2 Kovalent immobilisering av trypsin på papir
I motsetning til adsorpsjon, hvor enzymene kan orientere seg fritt, er det mulig å få til et mer kontrollert immobilisering. Det kan oppnås ved kovalent binding mellom funksjonelle grupper på enzymet og overflategrupper på papir, der amino (-NH2), karboksyl (COOH) og tiol (-SH) er de gruppene på enzymet som oftest er involvert [47, 50]. På cellulosebaserte papir er det hydroksyl som inngår i reaksjonen, men de er dårlige utgående grupper og må aktiveres før de kan kovalent bindes til enzymer via aminogruppen. Aktiveringsmiddelet er typisk cyanogenbromid, men er ekstremt toksisk og kan lett bli utsatt for hydrolytisk spalting. Det kan føre til at enzymer «løsner»
fra papiret med tiden, og gjør binding ustabil selv etter aktivering av hydroksylgrupper [52].
For en tryggere og mer stabil metode er det derfor i de fleste tilfeller nødvendig med kjemisk modifisering av overflategruppene på papiret for å få til kovalent immobilisering [52]. Det kan skje ved silanisering, karboksylmetylering, polymerisering, oksidasjon, reduksjon eller aminering, enten alene eller i kombinasjon. Etter en eller flere av reaksjonene vil det kunne dannes aldehyd,
karboksylsyre, HEMA-VDM, epoksid, ester eller amin på overflaten av papiret [38, 52, 53].
Mer om noen av modifiseringsmetodene står i underkapittelet 2.2 «Bearbeiding av filterpapir».
På den måten er det mulig å danne binding som er sterk og stabil ved at de fleste av proteinene/
enzymene har kontrollert orientering, og dermed er mer resistent mot autolyse og høyere spesifikk aktivitet [52, 54].
2.4 Proteinanalyse ved bruk av LC-MS/MS
Etter blodtaking, enten det har blitt utført ved tradisjonell blodprøvetaking eller nyere teknikk som DBS, lagres eller transporteres prøven til laboratoriet før analyse [1]. Økt kunnskap og interesse om ulike proteiners rolle ved sykdom har ført til behov for nøyaktige og effektive proteinbaserte
analysemetoder. På bakgrunn av proteiners store og kompliserte strukturer, i kombinasjon med ulike komponenter i prøven, er det nødvendig med tilpasset prøveopparbeidelse for å fjerne
interfererende substanser, samtidig som analytten oppkonsentreres [55]. Videre utføres enzymatisk spalting, etterfulgt av vask/ekstraksjon av prøven før spesifikke peptider av det undersøkende proteinet blir detektert i LC/MS-MS og kan bestemmes [8].
2.4.1 Prøveopparbeidelse
Biologiske matrikser som blod, plasma og urin har komplekse sammensetninger enn andre matriser som spytt, negler og hår, og kan bestå av flere hundre komponenter der analytten foreligger i lave konsentrasjoner. Dette vil gjøre det vanskelig å detektere analytten ved direkte analyse i apparatet.
Videre kan komplekse matriser inneholde stoffer som kan ødelegge analysesystemet, i tillegg til at det kan være ett eller flere stoffer i prøven som gir samme respons som analytten grunnet like kjemiske egenskaper. Uten prøveopparbeidelse vil interfererende stoffer i prøven kunne føre til kontaminasjon, signalundertrykkelse og/eller falsk-positive resultater [55, 56]. Derfor er det nødvendig å foreta prøveopparbeidelse før prøven kan introduseres i analyseapparatene. Det kan gjøres i form av å fjerne forurensninger fra prøven som kan ødelegge apparaturen, er uinteressant eller interferer med bestemmelsen, eller så kan den aktuelle analytten isoleres selektiv fra prøven.
Hvis analytten foreligger i lav konsentrasjon, må opparbeidelsen også fokusere på å oppkonsentrere slik at analyseapparatet kan detektere det. Vanlige prøveopparbeidelsesmetoder som benyttes er fast-fase ekstraksjon (SPE), væske-væske ekstraksjon (LLE) og proteinfelling [55].
Videre i proteinanalysen anvendes et av to strategier, top-down eller bottom-up. Top-down går ut på å introdusere intakte proteiner i massespektrometer, der både intakte og fragmenterte ionemasser analyseres. Med denne metoden er det mulig å dekke alle proteinsekvenser og karakterisere de ulike proteoformer (sekvensvariasjoner, spleisingsformer og post-translasjonelle modifikasjoner). Mens bottom-up-strategi innebærer kjemisk eller enzymatisk spalting av proteinet til peptider før
introdusering i analyseinstrumentet, der spesifikke peptider for det undersøkende proteinet
analyseres [57, 58]. I denne oppgaven benyttes bottom-up strategi, da formålet med oppgaven ikke er å identifisere og karakterisere proteiner, men å undersøke trypsinaktivitet i løsning og på papir.
2.4.2 Enzymatisk proteolyse
Enzymatisk proteolyse er en metode som involverer spalting av proteiner og peptider til mindre peptider og/eller separate aminosyrer ved bruk av protease. Enzymet som benyttes hydrolyserer peptidbindinger under bestemte betingelser og kan være spesifikk og ikke-spesifikk. Spesifikke enzymer bryter ned visse peptidbindinger som resulterer i at store peptider blir til mindre, mens ikke-spesifikke bryter tilfeldige peptidbindinger til mindre peptider og/eller aminosyrer. Eksempler på spesifikke proteaser er trypsin, chymotrypsin og glutaminase – de kløyver kun ved bestemte aminosyrer/peptidbindinger [59, 60]. Ved å bryte proteinet til peptider er det enklere å fragmentere og ionisere peptider før de føres inn i massespektrometer, men ulempen med enzymatisk proteolyse er at proteinet ikke spaltes fullstendig. Det kan være på grunn av komplekse prøver med mange komponenter som hindrer enzymer fra å nå frem til peptidbindinger, eller det kan være bindinger innad proteinet som hindrer enzymene [57, 58]. For å redusere ufullstendig spalting er det
nødvendig for visse proteiner med denaturering, reduksjon og alkylering før proteolyse. Det gjelder blant annet BSA som har disulfidbinding innad proteinet. Ved bruk av varme vil proteinet
fullstendig eller delvis miste sin spesifikke form og dermed bli mindre sammenfoldet. Dette vil være med på ødelegge proteinets tertiærstruktur og gjøre peptidbindingene mer tilgjengelig for nedbrytning. Videre benyttes reduksjons- (DTT eller TCEP) og alkyleringsagens (IAA) til å hindre henholdsvis reduksjon og gjendannelse av disulfidbro mellom cystein-residualer på polypeptidene, og dermed tertiærstrukturen [12, 61]. TCEP er å foretrekke grunnet dens stabilitet i større pH- området (spesielt ved lav pH), reaktivitet, selektivitet og resistent mot luftoksidasjon [61, 62].
Trypsin er det mest brukte enzymet til enzymatisk proteolyse og er en spesifikk protease som hydrolyserer proteiner etter aminosyrene lysin og arginin, vist på Figur 2-7, så lenge prolin ikke er direkte bundet til disse aminosyrene på C-terminalen. På denne måten danner trypsin unike
aminosyresekvenser, også kalt signaturpeptider, som ved bruk av flere kan benyttes til identifisering av proteiner med LC-MS/MS [63].
Figur 2-7: Tryptisk proteolyse av aminokjede, hvor det blir dannet fem tryptiske peptider. Aminosyrene i aminokjeden er forkortet etter «1-bokstav forkortelse».
2.4.3 Deteksjon av peptider ved bruk av LC-MS/MS
Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) er en velkjent analyseteknikk som kombinerer kromatografisk separasjon og massespektrometrisk deteksjon. Teknikken benyttes i analyse av proteiner og peptider i stor grad grunnet dens sensitivitet, selektivitet og nøyaktighet.
Peptidene som dannes under tryptisk proteolyse blir separert i væskekromatografi, etterfulgt av ionisering ved elektrospray (ESI) som gjør det mulig å skille de fra hverandre basert på masse- ladnings forhold (m/z-verdi) i MS/MS. Til slutt detekteres peptidionene i detektor [7, 10, 64].
Væskekromatografi
Væskekromatografi (LC) er den mest bruke seperasjonsmetoden til å bestemme stoffer i
farmasøytiske preparater og i biologiske matrikser som blod, plasma og urin. Metoden baserer seg på at prøven injiseres via en injektor inn i mobilfasestrømmen som pumpes gjennom
separasjonskolonne, før mobilfasen eluerer analyttene ut og inn i detektor hvor de detekteres.
Hvilke materiale kolonnen er pakket med (som skal retardere stoffene) og hvilke separasjons- prinsipp som benyttes, avhenger av analyttene som skal separeres og deres kjemiske egenskaper.
For separasjon av proteiner og peptider fra biologiske matrikser benyttes omvendt-fase prinsippet.
Da består stasjonærfasen av porøse partikler med upolare grupper på overflaten som retarderer analyttene med hydrofobe interaksjoner, der retensjonen er sterkere med økende hydrofobisitet.
Det vil føre til at stoffene transporteres med forskjellig hastighet gjennom kolonnen. Stoffene som blir mest retardert transporteres saktere gjennom kolonnen enn det mobilfasen gjør, mens de som ikke blir retardert av stasjonærfasen vil transporteres i samme hastighet som mobilfasen. For å redusere retensjonstiden hos de mest hydrofobe analyttene endres mobilfasesammensetningen under analysen (gradient eluering), mens i andre tilfeller går det fint at mobilfasen er konstant (isokratisk eluering). Retensjon avtar med økt innhold av organisk modifikator i mobilfasen [55, 56].
Elektrosprayionisering
Elektrosprayionisering (ESI) er en ioniseringsteknikk som foregår under ikke-vakuum og benyttes ofte som standard ioniseringsmetode med LC-MS og LC-MS/MS til å bestemme masse av
proteiner, peptider og andre biomolekyler [65]. ESI går ut på at mobilfasen med analytten forstøves til aerosol med elektrisk ladning og som føres videre til masseanalysatoren ved hjelp av elektrisk spenning, illustrert i Figur 2-8. Underveis i kammeret vil mobilfasedråpene som inneholder
ladninger fordampe med økende elektrisk felt og ladningen vil bevege seg til overflaten til analytten er fri. Det er disse partiklene (analytt med ladning) som vil kunne passere inn i masseanalysatoren og detekteres. Ved inngangen til detektoren er det tørkegass som vil transportere fordampet væske vekk slik at de ikke kommer med videre. Det er viktig at stoffene er ionisert i væskestrømmen for å få bra signal i massespektrometer. Det betyr i praksis at pH i mobilfasen må være justert slik at stoffene er ladet. For basiske forbindelser oppnås det under surt miljø (lav pH) i mobilfasen, og motsatt for sure forbindelser [55, 65, 66].
Figur 2-8: Prinsippet med elektrosprayionisering (ESI) i «positiv mode». Mobilfase med ladet analytt forstøves til aerosol og føres videre til masseanalysator ved hjelp av elektrisk spenning. Underveis vil mobilfasen fordampes og analytten med ladning vil bli fri, passere inn i masseanalysatoren og detekteres.
Figur modifisert fra [55, 66].
ESI kan danne positive og negative ioner, hvor positive ioner [M+H]+ dannes ved protonering under sure betingelser og negative ioner [M-H]- dannes fra frigjøring av proton under basiske betingelser.
I negativ modus observeres kun sure forbindelser som karboksylsyrer og fenoler som har frigjort et proton. Mens i positiv modus ioniseres hovedsakelig aminer, men molekyler med funksjonelle grupper som alkoholer, karbonyl, amider og karboksylsyrer ioniseres også. ESI er en «myk»
teknikk som vil si at molekylioner som dannes ikke vil fragmenterer videre. Dermed vil massespektre ved bruk av ESI i hovedsak kun inneholde molekylioner [55, 65].
Massespektrometri
Massespektrometri (MS) er en veldig sensitiv analyseteknikk som kan detektere forbindelser ned til piko- eller femtogram. Dette er viktig med tanke på at i analyse av biologiske prøver som blod og urin, så er analyttene tilstede i svært lave konsentrasjoner og hvor mengden er begrenset. MS foregår under vakuum med veldig lavt trykk på innsiden av instrumentet. Det er for å unngå at undersøkende ioner kolliderer med luftmolekyler, og sørger for at ionene når detektoren.
I kombinasjon med væskekromatografi (LC-MS) vil atomer, molekyler eller molekylfragmenter bli ionisert i ionekilden og brutt ned til fragmenter, etterfulgt av separasjon etter deres m/z-verdi i masseanalysator, før de blir detektert i detektoren. Ved ionisering får molekylionene enten positiv eller negativ ladning, hvor begge ladningene ikke blir målt samtidig i samme spektrum [55, 65].
Det er tre forskjellige moduser LC-MS systemer hovedsakelig opererer i: full scan, selektiv
ionemonitorering (SIM) og selektiv reaksjonsmonitorering (SRM). Full scan benyttes dersom det er ønskelig med mye strukturinformasjon om stoffene i prøven. Da tas det opptak av spektre under hele separasjonen i et gitt m/z-området.
SIM brukes ved kvantitativ bestemmelse eller når det er ønskelig å analysere stoffer i svært lave konsentrasjoner. Da måles kun en bestemt masse eller noen få masser gjennom hele tidsperioden separasjonen foregår, og massekromatogrammet vil vise intensiteten av den valgte massen som funksjon av retensjonstiden. Andre forbindelser i prøven som ikke danner det aktuelle ionet med den bestemte massen, vil ikke vises.
For en mer følsom eller selektiv modus, benyttes SRM. SRM-analyser utføres med trippel-
kvadrupol, hvor molekylioner og produktioner blir separert i henholdsvis første og siste kvadrupol før deteksjon. Skjematisk oversikt over trippelkvadrupol MS (TQMS) som benyttes i oppgaven, er vist på Figur 2-9.
Figur 2-9: Prinsippet med trippelkvadrupol masseanalysator (TQMS). Etter ionisering i ionekilden blir molekylioner separert i første (Q1), fragmentert i andre (Q2) og separert igjen i siste (Q3) kvadrupol før produktionene detekteres i detektoren.
Etter ionisering i ionekilden føres ionene gjennom tre masseanalysatorer koblet i serie (trippel- kvadrupol), og til slutt detektor. Første masseanalysator (Q1) som molekylionene kommer inn i er satt til bestemt(e) m/z-verdi(er) som er karakteristisk for analytten som skal undersøkes. Alle andre verdier kan ikke passere Q1, og det er på bakgrunn av dette som gjør at SRM har høy selektivitet.
Videre vil ionene passere inn til neste masseanalysator (Q2) der de vil kollidere med N2 eller Ar.
Her vil ionene fragmentere/brytes ned til produktioner, hvor utvalgte av disse måles i den tredje og siste kvadrupolen (Q3). Ettersom produktioner vanligvis er veldig spesifikk for et gitt stoff vil påvisning av produktioner ved gitte masser identifisere stoffet med sikkerhet. I tillegg har metoden høy følsomhet, da ionebakgrunnen fra andre stoffer i stor grad blir eliminert [55, 65].
Andre masseanalysator som brukes er blant annet ionefelle/orbitrap og time-of-flight (TOF).
Uavhengig av analysator, har de som formål å separere molekylioner etter ionisering og er ulike ved at noen bruker elektrisk, magnetisk eller ingen av feltene til å fange/separere ionene [55, 65].
I denne oppgaven utføres peptidanalyser av BSA og CytoC ved kromatografisk separasjon i en C8-kolonne, etterfulgt av deteksjon i trippelkvadrupol massespektrometer. Intern standard (IS) benyttes for å korrigere for variasjonen i signalintensitet på grunn av ionundertrykkelse, feil under prøveopparbeidelsen og/eller instrumentelle variasjoner. Ioneundertrykkelse er et kjent problem ved analyse med LC-MS/MS, forårsaket av komponenter i prøven som kan påvirke effektiviteten av ionisering av peptider. Ved elektrospray av flere analytter samtidig, enten det er peptider eller forurensinger, vil ioniseringen resultere i at de mest hydrofobe molekylene blir ionisert. Dette er spesielt problematisk ved lave konsentrasjoner av peptider [59, 67]. IS kan bedre presisjonen når hovedkilden til feil er relatert til feil under prøveopparbeidelsen eller instrumentelle variasjoner. Det er fordi feilen vil påvirke både intensiteten av IS og analytten i samme grad, mens forholdet mellom intensitetene (Aprøve/AIS) vil være upåvirket.
Ideell intern standard i LC-MS er en stabil-isotop merket analog av analytten, hvor den ligner på analytten og kan nøyaktig bestemmes ved en annen masse. Dermed benyttes det i denne oppgaven en stabil-isotop merket peptid, TGPNLHGLFGR*, som intern standard i noen av forsøkene for å korrigere for eventuelle variasjoner. Andre årsaker til at IS benyttes er for å kompensere for analytiske feil grunnet tap av prøver (for eksempel ved overføring) eller variabel injeksjonsvolum [55, 65].
3. Materialer
3.1 Kjemikalier, proteiner og utstyr
Tabell 3-1 og 3-2 viser oversikt over kjemikalier/reagenser og proteiner/peptider, mens Tabell 3-3 til 3-5 viser oversikt over utstyr (ikke-forbruksmateriell, forbruksmateriell og utstyr til laging av disker) som ble brukt i oppgaven. Tabell 3-6 viser instrumentelt oppsett av LC-MS/MS (trippel- kvadrupol) ved bestemmelse av peptider etter tryptisk proteolyse.
Tabell 3-1: Kjemikalier og reagenser
Kjemikalier/reagenser Kvalitet Leverandør
1,4-dithiothreitol (DTT) ≥ 99,5 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA
Acetonitril (ACN) Hypergrade for LC-MS Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Ammonium bikarbonat (ABC) ≥ 99,5 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA Coomassie Brilliant Blue
(CBB) (Brilliant Blue R) - Sigma-Aldrich
Darmstadt, Tyskland Dinatriumhydrogenfosfat
(Na2HPO4) 99,0 - 102 % Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Iseddik (CH3COOH) 100 % Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Jodeddiksyre (IAA) ≥ 98,0 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA Kaliumdihydrogenfosfat
(KH2PO4) ≥ 99,5 % Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Kaliumklorid (KCl) 99,9 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA
Kaliumperiodat (KIO4) 99,8 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA
Maursyre (HCOOH) ≥ 99 % for LC-MS VWR Chemicals
Leuven, Belgia
Metanol (MeOH) 100 % for HPLC VWR Chemicals
Fontenay-sous-Bois, Frankrike
Metanol (MeOH) ≥ 99,9 %
Hypergrade for LC-MS
Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland Natrium cyanoborohydrid
(NaCNBH3) 95 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA Natriumfosfat monobasisk
monohydrat (NaH2PO4 · H2O) 99,0 - 102,0 % Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Natriumhydroksid (NaOH) 99,3 % VWR Chemicals
Leuven, Belgia
Natriumklorid (NaCl) ≥ 99,5 % Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Saltsyre (HCl) 37 % Merck KGaA
Darmstadt, Tyskland
Tris hydroklorid (Tris HCl) ≥ 99,0 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA Tris-(2-karboksyetyl)-fosfin
hydroklorid (TCEP) ≥ 98,0 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA
Tween 20© - Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA
Tabell 3-2: Proteiner, substrat og trypsin
Peptider/reagenser Kvalitet Leverandør
Albumin fra bovine serum
(BSA) ≥ 96,0 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA Bovine cytochrome c
intern standard (CytoC IS) - Innovagen
Lund, Sverige Cytochrome c fra equine heart
(CytoC) ≥ 95,0 % Sigma-Aldrich
St. Louis, MO, USA Nα-Benzoyl-L-arginin etyl
ester hydroklorid (BAEE) ≥ 97 % (HPLC) Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Trypsin fra bovine pancreas ≥10 000 BAEE
enheter/mg protein
Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA
Tabell 3-3: Utstyr, ikke-forbruksmateriell
Utstyr Type/modell Leverandør
96-brønnsplate m/toppmatte 96-brønnsplate med tilhørende closing mat av silikon, 0,5 mL
Agilent
Santa Clara, USA Automatpipetter m10, m20, m100, m200,
m1000, m5000
Sartorius Biohit Helsinki, Finland Eppendorf-mikser Thermomixer comfort
1,5 mL
Eppendorf
Hamburg, Tyskland
HulaMixer HulaMixer® Sample Mixer Invitrogen
Carlsbad, USA
Kyvette Kvarts kyvette, 1 cm Starna
Hainault, Storbritannia
Mikrospin Mikro-spin FV-2400 Biosan
Riga, Latvia
pH måler 744 pH meter Metrohm
Herisau, Sveits
Ristemaskin Vibramax 100 Heidolph
Schwabach, Tyskland
Ultralydbad Ultrasonic cleaner VWR
Leuven, Belgia
UV-måler Beckman DU 530 UV
vis spektrofotometer
Dan Meszansky AS Oslo, Norge
Vannrensningsanlegg Milli-Q, Integral 3 Millipore
Molsheim, Frankrike
Varmeskap Binder ED115 Binder
Tuttlingen, Tyskland
Vekter
Mettler Toledo AE200, Analytical Balance
Mettler Toledo MS205DU, MS Semi-Micro Balance
Mettler Toledo Oslo, Norge
Vortex mikser SA8 Stuart
Staffordshire, UK
Tabell 3-4: Utstyr, forbruksmateriell
Utstyr Type/modell Leverandør
Beskyttelse for arbeidsoverflate
Bench surface protector, 460 mm x 570 mm
VWR
Radnor, PA, USA Eppendorfrør Protein LoBind Tube,
0,5 mL - 1,5 mL - 2,0 mL
Eppendorf
Hamburg, Tyskland
Glasspasteurpipetter 230 mm VWR
Radnor, PA, USA
Mikro-inserts 0,1 mL,
31 x 6 mm
VWR
Darmstadt, Tyskland Pipettespisser Optifit pipette refill tips,
10 μL - 200 μL - 1000 μL - 5 mL
Sartorius Biohit Helsinki, Finland
Sentrifugerør SuperClear, 15 mL VWR
Radnor, PA, USA
Vialer Clean Pack, 1,5 mL
32 mm x 11,6 mm
Nerliens Meszansky Oslo, Norge
Vialkorker Hvite, plast Nerliens Meszansky
Oslo, Norge
Tabell 3-5: Utstyr for tillaging av disker (sirkelformede)
Utstyr Modell Leverandør
Puncher Harris Uni-Core,
6,0 mm (indre diameter)
GE Healthcare Life Sciences Buckinghamshire, Storbritannia Punching-matte Harris cutting Mat,
6 x 8 inch
GE Healthcare Life Sciences Buckinghamshire, Storbritannia Whatman® filterpapir
(papir av cellulose)
Grade 1 Qualitative, 460 mm x 570 mm
GE Healthcare Life Sciences Buckinghamshire, Storbritannia
Tabell 3-6: Instrumentelt oppsett for LC-MS/MS (trippelkvadrupol)
Utstyr Modell Leverandør
Autosampler / injektor
Dionex Ultimate 3000 RS Autosampler, WPS-3000 TRS
Thermo Scientific Germering, Tyskland Pumpe (mikropumpe) Ultimate 3000 Pump,
LPG-3400M
Thermo Scientific Germering, Tyskland
Kolonne
BioBasic-8 (C8), Dimensjon: 50 x 1 mm Partikkelstørrelse: 5 μm
Thermo Scientific Rockford, IL, USA
Programvarer
Chromeleon (Xpress) Thermo Xcalibur Thermo TSQ EZ Tune
Thermo Scientific USA
Massespektrometer TSQ Quantum Access Thermo Scientific San Jose, CA, USA
3.2 Tillaging av løsninger
3.2.1 Protein-, substrat- og trypsinløsninger
Alle protein-, substrat- og trypsinløsning oppgitt i % er av % (w/v).
BAEE
1,26 mg/mL: 12,6 mg BAEE ble veid inn og løst i 10 mL NaH2PO4-buffer.
BSA
BSA-løsning ble fortynnet til ønsket konsentrasjon i 50 mM ABC-buffer og sluttvolumet var 100 μL eller 1 mL, avhengig av forsøket som ble utført. Løsningen ble laget like før bruk.
Cytokrom c, CytoC
CytoC-løsning ble fortynnet til ønsket konsentrasjon i 50 mM ABC-buffer og sluttvolumet var 100 μL eller 1 mL, avhengig av forsøket som ble utført. Løsningen ble laget like før bruk.
Cytokrom c intern standard, CytoC IS
1 μg/mL: 10 μL av 1 mg/mL CytoC IS ble tilsatt i 9,99 mL 0,1 % maursyre.
Blandingen ble fordelt i mindre porsjoner som ble tint før bruk.
BSA+CytoC blanding
Like store mengder av stamløsningene 2 mg/mL CytoC og 10 mg/mL BSA ble blandet (1:1), slik at sluttkonsentrasjonen ble 1 mg/mL CytoC og 5 mg/mL BSA i blandingen. Stamløsningene ble fortynnet til ønsket konsentrasjon i 50 mM ABC-buffer og laget like før bruk.
Trypsin
Trypsin-løsningene ble fortynnet til ønsket konsentrasjon i 1 mM HCl og sluttvolumet var ofte på 100 μL, avhengig av forsøket som ble utført. Løsningen ble laget like før bruk.
3.2.2 Bufferløsninger
Ammoniumbikarbonat-buffer (ABC-buffer)
50 mM: 39,53 mg ABC-tørrstoff ble veid inn og løst i 10 mL ionebyttet vann.
Løsningen ble alltid laget dagsfersk og oppbevart kjølig.
Natriumfosfat buffer (NaH2PO4-buffer), pH = 7,6
67 mM: 462,3 mg NaH2PO4 · H2O ble veid inn og løst i 50 mL ionebyttet vann.
pH ble justert ved å bruke 1 M NaOH.
Tris HCl buffer, pH ~9
50 mM: 783,5 mg Tris HCl ble veid inn og løst i 100 mL ionebyttet vann.
pH ble justert ved å bruke 1 M NaOH.
PBS-buffer, pH ~7,4
10*: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,27 mg KH2PO4 ble veid inn og løst i ionebyttet vann til 100 mL.
1*: 10 mL av 10*PBS-buffer ble tilsatt ionebyttet vann til 100 mL.
Løsningene ble oppbevart mørkt og kjølig.
1* PBS-buffer med 0,05 % Tween 20©
10 mL 10*PBS-buffer og 50 μL Tween 20© ble tilsatt ionebyttet vann til 100 mL. Løsningen ble oppbevart mørkt og kjølig.
3.2.3 Løsninger for tillaging eller redusering av KIO4-behandlet papir Kaliumperiodat-løsning (KIO4-løsning)
0,03 M: 690 mg KIO4 ble veid inn og løst i 100 mL ionebyttet, og varmet opp til ~65 ºC.
Natrium cyancorohydrid, NaCNBH3
1,6 mg/mL: 1,6 mg NaCNBH3 ble veid inn og løst i 1 mL ionebyttet vann.
3.2.4 Løsninger til karakterisering av BSA på papir Coomassie Brilliant Blue (CBB)
0,1 % (w/v): 10 mg CBB ble veid inn og løst i 10 mL vaskeløsning.
Vaskeløsning
Vaskeløsningen består av metanol, vann og iseddik (50:40:10).
250 mL metanol, 200 mL ionebyttet vann og 50 mL iseddik ble blandet sammen.
3.2.5 Løsninger til redusering og alkylering av BSA DTT, 1,4-dithiothreitol
50 mM: 7,71 mg DTT ble veid inn og løst i 1 mL 50 mM ABC-buffer.
Reduseringsreagensen ble laget like før bruk.
TCEP, Tris(2-karboksyetyl)fosfin hydroklorid
50 mM: 14,33 mg TCEP ble veid inn og løst i 1 mL 50 mM ABC-buffer.
Reduseringsreagensen ble laget like før bruk.
IAA, 2-jodeddiksyre
250 mM: 46,49 mg IAA ble veid inn og løst i 1 mL 50 mM ABC-buffer.
Alkyleringsreagensen ble laget like før bruk.
3.2.6 pH-regulerende løsninger HCl, saltsyre
10 mM: 83 μL av 37 % HCl ble tilsatt ionebyttet vann til 100 mL.
1 mM: 8,3 μL av 37 % HCl ble tilsatt ionebyttet vann til 100 mL.
NaOH, natriumhydroksid
1 M: 40,01 mg NaOH ble veid inn og løst i 10 mL ionebyttet vann.
FA, maursyre
1 % (v/v): 1 mL konsentrert maursyre ble tilsatt ionebyttet vann til 100 mL.
0,1 % (v/v): 5 mL av 1 % maursyre ble tilsatt ionebyttet vann til 50 mL.
3.2.7 Løsninger knyttet til kromatografi 20 mM maursyre
775 μL konsentrert maursyre ble tilsatt ionebyttet vann til 1000 mL.
Mobilfase A (20 mM maursyre : ACN, 95:5)
950 mL 20 mM maursyre og 50 mL 100 % acetonitril (ACN) ble blandet sammen.
Mobilfase B (20 mM maursyre : ACN, 5:95)
50 mL 20 mM maursyre og 950 mL 100 % acetonitril ble blandet sammen.
Vaskeløsning (MeOH : MilliQ-vann, 50:50) Til vask av autosampler og kolonne.
500 mL metanol (MeOH) og 500 mL ionebyttet vann ble blandet sammen.
Seal wash (MilliQ-vann : MeOH, 90:10) Vaskeløsning til autosampler.
900 mL ionebyttet vann og 100 mL metanol ble blandet.
Etter blanding ble løsningene satt i ultralydbad i 10 minutter for å fjerne eventuelle luftbobler før bruk. !
4. Metoder
4.1 Adsorpsjon og kovalent binding av BSA samt CBB-farging
4.1.1 Tillaging av ubehandlet disker
Puncher med punching-matte ble brukt til å stanse ut 6 mm disker (sirkelformede) fra A4-klippet Whatman® grade 1 filterpapir. Mellom 40-50 disker ble stanset ut hver gang og oppbevart i sentrifugerør til bruk.
4.1.2 KIO4 funksjonalisering av ubehandlet disker
Funksjonalisering av ubehandlet disker ved bruk av KIO4 ble utført i henhold til prosedyren publisert av Chen m.fl. [39].
Ubehandlet disker ble lagt i 10 mL 0,03 M KIO4-løsning ved 65 ºC i 2 timer. Deretter ble diskene vasket tre ganger ved å dyppe de i ionebyttet vann. Etter siste vask ble diskene blottet på tørkepapir og lufttørket ved romtemperatur før de ble plassert i eksikator over natten.
4.1.3 Immobilisering av BSA på KIO4-behandlet og ubehandlet disk
Det ble tilsatt 0,5 μL 0,5 % BSA til KIO4-behandlede og ubehandlede disker, og immobilisert over natten ved romtemperatur i forseglet 96-brønnsplate. Dagen etter ble diskene blottet, før halvparten av KIO4-behandlede diskene ble redusert (= redusert-behandlet disk) ved å dryppe 10 μL
1,6 mg/mL NaCNBH3 på hver disk og la de stå i romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble alle diskene vasket med 15 μL 10 mM HCl fra 0 opptil 10 ganger, etterfulgt av enda en blotting. Videre ble diskene inkubert ved 80 ºC i 10 minutter.
4.1.4 Farging av proteiner
To til tre disker pr. 200 μL 0,1 % Coomassie Brilliant Blue-løsning ble bløtlagt i 10 minutter, etterfulgt av blotting av hver disk på tørkepapir. Diskene ble så vasket i 10 mL vaskeløsning på Heidolph Vibramax 100 (shaker) ved 800 rpm i 30 minutter. Dette ble gjentatt en gang til. Til slutt ble diskene blottet på tørkepapir før tørking i romtemperatur.
4.2 Adsorpsjon og kovalent binding av trypsin samt BAEE-assay
BAEE-assay, måling av trypsinaktivitet i løsning, på KIO4-behandlet og ubehandlet disk ble utført i henhold til beskrivelsen av Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/
protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin.html, hentet 11.09.20) med noen endringer.
Klargjøring av UV-måler med blankprøve
Et volum av 2,8 mL 67 mM natriumfosfat buffer og 200 μL 1 mM HCl ble pipettert over i en kvarts kyvette og blandet ved å vende forsiktig. Videre ble 200 μL BAEE-løsning tilsatt og blandet forsiktig ved vending i noen sekunder, etterfulgt av aktivitetsmåling i spektrofotometer ved 253 nm (A253).
4.2.1 Immobilisering av trypsin
Trypsinkonsentrasjonene 1 % - 0,5 % - 0,4 % - 0,3 % - 0,2 % - 0,1% - 0,05 % ble benyttet ved måling av trypsinaktivitet i løsning og på KIO4-behandlet disk, mens det ble benyttet 1 % - 0,5 % - 0,1 % - 0,05 % trypsin på ubehandlet disk.
I løsning: 10 μL av trypsinkonsentrasjonene ble tilsatt i hvert sitt eppendorfrør over natten ved romtemperatur.
På disk: 10 μL av trypsinkonsentrasjonene ble dryppet på diskene i 96-brønnsplate og forseglet for immobilisering over natt ved romtemperatur.
4.2.2 Klargjøring av trypsinløsning til aktivitetsmåling
I løsning: Dagen etter ble 2,8 mL 67 mM natriumfosfat buffer, 200 μL 1 mM HCl og 10 μL trypsinløsning fra eppendorfrøret pipettert over i kvarts kyvette og blandet forsiktig ved vending.
På disk: Dagen etter immobilisering av diskene, ble diskene overført til kvarts kyvette med 2,8 mL 67 mM natriumfosfat buffer og 200 μL 1 mM HCl. Kyvetten ble lagt i HulaMixer (orbital 35 rpm, 5 sekunder; reciprocal 60º, 5 sekunder) i 5 minutter før disken ble fjernet.
4.2.3 Aktivitetsmåling i UV-spektrofotometer
Fortynning ble utført før aktivitetsmåling på trypsinkonsentrasjonene 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % og 0,1 %, hvor de ble fortynnet henholdsvis 20, 10, 8, 6, 4 og 3 ganger med totalvolum på 3,0 mL - bestående av 67 mM natriumfosfatbuffer, 1 mM HCl og trypsinløsning. Videre ble 200 μL BAEE-løsning tilsatt i hver prøveløsning og blandet forsiktig ved vending i noen sekunder,
etterfulgt av aktivitetsmåling i spektrofotometer ved 253 nm (A253) hvert 30. sekund i 5 minutter.
4.3 Vaskeprosedyre til KIO4-behandlet og ubehandlet disk Immobilisering av trypsin
På KIO4-behandlet og ubehandlet disker ble det dryppet 10 μl 0,1 % trypsin, som ble lagt i 96-brønnsplate og forseglet over natt ved romtemperatur.
Vasking av KIO4-behandlet og ubehandlet disk
Dagen etter ble diskene blottet på tørkepapir før de ble vasket. KIO4-behandlede og ubehandlede disker ble vasket med både 1,8 mL 0,05 % Tween i 1*PBS og 50 mM Tris HCl i hvert sitt
eppendorfrør i HulaMixer (orbital 35 rpm, 5 sekunder; reciprocal 60º, 5 sekunder) i 5 minutter åtte ganger. Deretter ble de vasket én gang i 1,8 mL ionebyttet vann i 5 minutter, og til slutt i én gang i 1,8 mL 50 mM ABC-buffer i 5 minutter, før de ble blottet og lufttørket i romtemperatur.
Proteolyse av CytoC på KIO4-behandlet og ubehandlet disk
På diskene som ligger i hvert sitt merkede eppendorfrør ble det dryppet 10 μL 1 mg/mL CytoC.
Proteolysen foregikk i eksakt i 10 minutter pr. disk, før 110 μL 1 % maursyre ble tilsatt og røret ble ristet i shaker i 5 minutter ved 600 rpm. Etter risting ble diskene tatt ut.
LC-MS/MS analyse
Prøveløsningene ble fortynnet før analyse i LC-MS/MS*.
* Fortynning: 10 μL ekstrakt + 25 μL 1 μg/mL CytoC IS + 65 μL 0,1 % maursyre.
