TRABAJO DE FIN DE GRADO
¡No te quedes atascado! Transiciones de obstrucción en materia activa.
Miquel Comas Adrover
Grado de Física Facultad de Ciencias
Año Académico 2020-21
¡No te quedes atascado! Transiciones de obstrucción en materia activa.
Miquel Comas Adrover
Trabajo de Fin de Grado Facultad de Ciencias
Universidad de las Illes Balears
Año Académico 2020-21
Palabras clave del trabajo:
Chlamydomonas reinhardtii, obstrucciones, estallido, cuello de botella.
Nombre Tutor/Tutora del Trabajo: Idan Tuval Gefen
Se autoriza la Universidad a incluir este trabajo en el Repositorio Institucional para su consulta en acceso abierto y difusión en línea, con fines exclusivamente académicos y de investigación
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Resumen
Cuando partículas inertes son arrastradas por el flujo de cualquier líquido o por la acción de la gravedad a través de una constricción en forma de cuello de botella, las partículas podrían seguir sin sufrir variaciones en el flujo, detenerse de forma intermitente permitiendo todavía su paso o generar una obstrucción de tal manera que no permitiese el paso de ninguna otra partícula. Este es el caso, por ejemplo, de un reloj de arena o de un silo que contiene algún tipo de material granular. La motivación de este ensayo es la utilización de materia activa, en vez de la pasiva, utilizando técnicas experimentales de vanguardia en la biofísica y comparándolo con estudios que proponen que el tipo de transiciones que ocurren es debido al ancho que tiene el cuello de botella.
Índice
1. Introducción al objeto de estudio 2
1.1. Comportamiento celular. Respuesta de las Chlamydomonas a estímulos externos 2
1.2. Estadística en la dinámica de obstrucción 3
1.3. El polidimetilsiloxano y la técnica de la litografía blanda 5
2. Montaje del set experimental 6
3. Análisis y resultados 7
3.1. Algoritmo 7
3.2. Ensayo introductorio de la fototaxis 8
3.3. Dinámica de obstrucción variando el ancho del cuello de botella 9
3.4. Dinámica de obstrucción de diferentes áreas 12
4. Conclusiones 14
5.
Referencias 152 1. Introducción al objeto de estudio.
Las Chlamydomonas reinhardtii son una especie de fitoplancton unicelular biflagelado del orden de las Volvocales y de la familia de las Chlamydomonadaceae. Las dos principales áreas de interés en el estudio científico es debido a su proceso de fotosíntesis y a su motilidad. En la figura 1 se representan las partes principales de forma esquemática.
Fig. 1. Estructura esquemática de las Chlamydomonas reinhardtii. Figura de [1].
Su cuerpo celular tiene un diámetro aproximado de 10 µm y posee una forma de esferoidal. Dispone de un núcleo central (N) con su nucléolo (Nu), el cloroplasto (C) que se ocupa de la fotosíntesis y donde se encuentra la mancha ocular (E) cuyo orgánulo es fotorreceptor y permite detectar la intensidad de la luz, posee también dos flagelos (F) que permiten la movilidad de la célula y otros orgánulos característicos de una célula eucariota como la mitocondria (M), el pirenoide (P), el aparato de Golgi (G) y la vacuola (V).
Las Chlamydomonas son células haploides con un ciclo asexual de aproximadamente un día. Esto permite un cultivo controlado y razonablemente fácil. En este trabajo, las células son depositadas en un frasco
Erlenmeyer esterilizados con autoclave y con un medio de tris-acetato-fosfato (TAP). Están sometidas a una iluminación continua junto a una agitación de 120 rpm y a una temperatura de 20ºC. Se utilizará la cepa CC125, una cepa de tipo salvaje que aparece más frecuentemente en la naturaleza y es la más utilizada en los laboratorios [1].
1.1 Comportamiento celular. Respuesta de las Chlamydomonas a estímulos externos.
El comportamiento celular cinético de las Chlamydomonas viene descrito por sus dos orgánulos más particulares, los flagelos. Compuestos por más de 500 tipos de proteínas y con una longitud aproximada de 12 µm en forma de látigo, tienen una estructura de axonema compuesto por 9 dobletes de microtúbulos rodeando a un par central. Los flagelos suelen latir con una frecuencia cercana a los 50 Hz y son desprendidos durante la división celular. Su función no es simplemente la de la motilidad, sino que también actúan como orgánulos sensoriales y de señalización. Hay estudios que muestran la existencia de tres distintas formas de latidos flagelares. Una modalidad sincronizada, que ocurre el 85% de las veces, y que, aunque puede haber pequeñas diferencias en cuanto al periodo de latido a latido, la fase entre los dos flagelos aparece inmutable. Sincronía con interrupciones transitorias, ocurre alrededor de un 10%, un flagelo se mueve más rápido que el otro, pero acaban sincronizándose. Y finalmente, flagelos que se encuentran en estado asincrónico dónde los dos flagelos tienen
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diferentes frecuencias y distintas fases. Si bien este estado ocurre el 5% de las veces, esto solo ocurre por pocos segundos, los autores propusieron que estas diferencias se debían a distintas subpoblaciones de células [3].
Efectos externos pueden producir reacciones en el movimiento de las células, uno de ellos fue descrito por Hirschberg y Rodgers (1978) donde reportaron que las Chlamydomonas estaban siendo atraídas por substancias tales como el cloruro de cobalto (II) y el sulfato de manganeso (II) pero que mostraban una respuesta negativa a la L-arginina (C6H14N4O2). A este movimiento se le conoce como quimiotaxis, es decir, la dirección del movimiento de las células corresponde al gradiente del incremento o decrecimiento de la concentración de una substancia en particular. Otro efecto, esta vez menos influyente, fue descrito por Bean (1997) cuando las Chlamydomonas, en ausencia de luz, tendían a acumularse en la parte superior de un tubo capilar, se le conoce como gravitaxis negativa. Sin embargo, la velocidad de movimiento con la que tendían a acumularse
correspondía a un rango del 8-12% a la velocidad media de la población, por eso este efecto no tendría ninguna consecuencia en nuestros experimentos. Kessler (1985) investigó también la girotaxis, la orientación directa de las células al flujo de un fluido.
No obstante, en este trabajo el movimiento inducido por el efecto externo que nos interesa es debido a la respuesta de las Chlamydomonas a la luz. Demostrado por Buder (1919) la dirección en la que se orientan las células es inducido por la intensidad lúminica de los rayos de luz, descrito como fototaxis negativa si estas células se alejan cuando la intensidad es grande, o fototaxis positiva si las células se acercan a intensidades bajas.
El orgánulo encargado de detectar la intensidad de luz que está en el medio es la mancha ocular, una especie de ojo de con poca complejidad. Al disponer de una sola mancha ocular, la visión tridimensional de las células no es muy buena, para contrarrestar esa deficiencia este fotorreceptor capta continuamente la intensidad y las células permanecen en constante movimiento [1].
1.2 Estadística en la dinámica de obstrucción.
La formación de una obstrucción antes de la constricción uniforme de un canal con una anchura D, viene marcado por el diámetro d de las partículas que se encuentran dentro de ese mismo canal, siendo d < D.
Dependiendo de la relación D/d un cierto número de partículas en movimiento debido al fluido en el que se encuentran puede generar un tipo de obstrucción que no permita el paso más partículas. En la figura 2 se observa de forma esquemática el más simple de estos embotellamientos.
Fig. 2. Obstrucción esquemática con relación D/d=1.02. Figura de [5]
La generación de este proceso implica la configuración de un arco estable cuando un número suficiente de partículas llegan de forma aleatoria y alcanzan la constricción. La obstrucción de partículas debería ocurrir al azar y con la misma probabilidad de que todas las partículas queden atrapadas, por ello se prevé que mediante la caracterización de estallidos o “bursts” deberían seguir una distribución exponencial.
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𝑝 ∝ 𝑒− <𝑠>𝑠
Estos estallidos ocurren cuando un arco estable ha generado una obstrucción antes del cuello de botella, el flujo de partículas se ha detenido, sin embargo, el líquido en el que se encuentran sigue fluyendo. Ocasionalmente esta perturbación en los arcos generado por el medio colapsará, permitiendo de nuevo el flujo de partículas y dejando paso a un cierto número de escapes s, hasta que el sistema vuelva a obstruirse de nuevo. Hay estudios que demuestran la proporcionalidad a esta distribución exponencial tanto para materia pasiva tales como partículas en silos [6] o suspensiones con partículas Brownianas y no Brownianas [7][5], además de para materia activa como es el caso de un rebaño de ovejas, peatones [6][10] o ratones [11]. En la figura 3 se muestran tres fotogramas con partículas de diámetro d que fluyen intermitentemente y muestran el proceso de estallido para partículas pasivas.
Otro cálculo que realizan los anteriores estudios corresponde a la dinámica de desobstrucción, donde se realiza la distribución de probabilidad de los lapsos de tiempos T entre el paso de dos partículas consecutivas.
Esta distribución, tiene la forma de una ley potencial y para tiempos de detención grandes podremos realizar en escala logarítmica un ajuste lineal determinando el valor de α [12].
𝑝 ∝ 𝑇−𝛼
No obstante, este trabajo se centra en el estudio de Chlamydomonas un tipo de materia activa que al tratarse de células poseen ciertas propiedades además de las mencionadas anteriormente. Las células son blandas y la mayoría de las veces son objetos no isotrópicos, también en ocasiones, debido a la porosidad del sustrato pueden adherirse a él y quedar atascadas. Por eso hay que mencionar diferentes dinámicas en la formación de
obstrucciones.
Fig. 3. De arriba abajo. Obstrucción antes del estallido, estallido, obstrucción después del estallido. Figura de [7].
Fig. 4. Tipos de obstrucciones. Figura de [9]
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La figura 4 (a) representa el método de tamizado, cuando partículas sólidas no deformables con relaciones D/d
≤ 1 llegan a una constricción estas quedan obstruidas de forma permanente y al no haber intermitencia en el flujo es imposible estudiar la probabilidad de que una partícula pase por el cuello de botella. Este no es el caso de las células que, al tratarse de partículas deformables, éstas pueden adaptarse y llegar a recorrer la constricción pudiendo estudiar su intermitencia. La figura 4 (b) es la obstrucción descrita principalmente y es la que se estudiará en este ensayo. La figura 4 (c) simboliza la agrupación de un cúmulo de células que pueden adherirse entre sí o en el medio que se encuentran, este tipo de obstrucción es inadecuada para el análisis, en consecuencia, se utilizará un surfactante que evitará este tipo de acumulaciones tanto en el estrecho como antes de la
constricción [9].
1.3 El polidimetilsiloxano y la técnica de la litografía blanda.
De manera habitual, para el estudio de cultivos celulares, se utilizaban y se siguen utilizando hoy en día técnicas de método in vitro. A pesar de eso, por un creciente interés en el rango de estudio a pequeños
volúmenes, la idea de seguir utilizándolo estas técnicas se veía poco probable debido al factor económico y a la complejidad en la creación de estructuras a pequeña escala. Por ello se desarrolló una técnica que permitía, a bajo coste y de fácil elaboración, el montaje de materiales de rango micrométricos. Se le conoce como litografía blanda y como material principal utilizaba un polímero llamado polidimetilsiloxano (PDMS). Este material disponía de ciertas características que implicaban estados óptimos para el cultivo celular. Es un material transparente, permite el paso de la luz con longitudes de ondas entre los 240 y 1100 nm. Es un material inerte y biocompatible, es decir, no produce efectos indeseados para organismos biológicos. Y, por último, tiene permeabilidad al gas, especialmente al oxígeno y al dióxido de carbono permitiendo una buena viabilidad para las células que se depositan, aunque puede llegar a ser un problema ya que esta característica puede facilitar la evaporación del medio [4].
Los microdispositivos de estudio son fabricados con un proceso conocido como micromoldeo, un elastómero se coloca sobre unas plantillas que pueden volver a reutilizarse cuando el proceso termina. El elastómero está compuesto por un caucho de silicona líquida, en este caso el PDMS, y un agente catalizador permitiendo que las cadenas de polímeros se activen y que el elastómero pase a ser de líquido a sólido. La relación en esta disolución es de 1:10, es decir, para un gramo de agente catalizador se necesitan nueve de PDMS. Al mezclar estos dos compuestos es inevitable la formación de burbujas de aire, por tanto, se debe colocar en una bomba de vacío hasta que no quede ninguna. Cuando el compuesto está listo se debe colocar sobre las plantillas y se debe dejar curar un cierto tiempo. Para condiciones de temperatura ambiente, el proceso necesita 72 horas, sin embargo, si se coloca sobre un plato caliente a 90º el tiempo se reduce a una o dos horas.
6 2. Montaje del set experimental.
La producción de microchips con el polidimetilsiloxano, utilizando la técnica de la litografía blanda, nos permite limitar a un movimiento bidimensional el recorrido de las células, evitando que puedan quedar una encima de la otra y obteniendo una mejor diferenciación a la hora de observarlas en el microscopio. Al disponer el PDMS curado se recortan los microchips que se necesitan de los moldes y se realizan las punciones necesarias de 1mm para la introducción posterior de las células. En la figura 5 se puede observar la forma que tienen los microchips.
Fig. 5. Geometría de los canales de estudio. Arriba geometría trapezoidal, abajo geometría rectangular.
A continuación, se efectúa el sellado, para ello se realiza una limpieza con plasma de oxígeno que limpia los objetos de sustancias no deseadas y mediante contacto adhiere los microchips a un cubreobjetos, formándose así una cámara de aire con los bordes sellados. Para una correcta adhesión se deja reposar el conjunto sobre una placa calefactora unos 15 minutos. Una vez terminado, el siguiente paso es la introducción de las células. En este experimento se centrifugaron las células para poder alcanzar una concentración de ~107 células/ml. El proceso consiste en el llenado de tres disoluciones en el microchip, para ello se utilizan tres jeringas de 1mL. Primero se inyecta una disolución de Pluronic F-127 con un porcentaje en masa del 0.5%, este agente actúa como
surfactante y evita que las células se queden pegadas en la superficie del cubreobjetos o en el PDMS reduciendo la tensión superficial del agua. Se deja reposar una media hora para que pueda actuar y posteriormente se limpia el microchip mediante la introducción en el extremo contrario de agua mili-Q (agua ultrapura). Finalmente se pueden introducir las Chlamydomonas, por el mismo agujero donde se inyectó el Pluronic, se introducen las células lentamente evitando cualquier posible obstrucción en los cuellos de botellas antes de poder realizar los experimentos. En el apartado 1.3. se comentó que debido a la permeabilidad al gas del PDMS es posible que se produzca la evaporación del medio introducido, por ello para finalizar se cubren con vaselina los orificios hechos con las punciones. Una vez comprobado la viabilidad, se puede pasar al montaje hecho en el microscopio, figura 6.
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Se trata de un microscopio invertido conectado a una cámara UI-3370CP que grabará imágenes de 10-15 fotogramas por segundo dependiendo del tiempo de grabación y con un objetivo con magnificación x10.
Utilizamos un LED Thorlabs M470L2 con una longitud de onda de 470nm conectado a una lente convergente que concentrará el haz de luz incidente sobre el microchip.
3. Análisis y resultados.
3.1 Algoritmo.
Para el análisis de los experimentos, se utilizará una extensión de Python que se encarga del seguimiento de las partículas en dos dimensiones, esta extensión es conocida como Trackpy. La computación que se realizará en cada uno de los análisis consistirá en dos partes, la primera parte es la misma cada vez que se ejecuta el
programa. Consiste en la creación de una imagen de fondo que elimina cualquier tipo de suciedad o los bordes de los canales, evitando que el programa detecte formas no deseadas, después el Trackpy localiza las partículas anotando su posición y el tiempo en el que se encuentran, figura 7.
Fig. 7. Ejemplo de localización celular. De arriba abajo, imagen obtenida con el microscopio, eliminación de bordes y partículas inmóviles, localización con trackpy.
Fig. 6. Montaje de recolección de datos. (1) Luz LED, (2) lugar donde se deposita la muestra, debajo se encuentran los objetivos de (3) microscopio invertido.
1 c
1 2
2
3 3
8
A pesar de la aplicación de una imagen de fondo, el programa todavía puede detectar bordes que no deberían estar, para solucionar el error se aplicarán una serie de filtros cuando el programa haya anotado toda la trayectoria de las partículas. La detección de una partícula se realiza de la siguiente manera, la cámara registra una imagen en alta resolución (extensión *.bmp) y el programa convierte la imagen en escala de grises asignando un valor por píxel de 0 a 255. Siendo 0 un color totalmente negro y 255 un color blanco, la acumulación de valores bajos equivale a la posición de una partícula y el programa anota su posición en la imagen.
La segunda parte del algoritmo es distinta para cada uno de los apartados siguientes, impuesto por el resultado de los análisis que queremos obtener.
3.2 Ensayo introductorio de la fototaxis.
En un principio necesitamos determinar la potencia de la intensidad lumínica que es conveniente para realizar los experimentos. En este apartado se introduce el comportamiento a grandes rasgos del movimiento celular cuando existe un estímulo luminoso. Mediante un tubo capilar que contiene Chlamydomonas se calculan sus trayectorias tal como muestra la figura 7.
A simple vista se observa que, en ausencia de luz, el movimiento que realizan es browniano mientras que a medida que se aumenta la intensidad empiezan a realizar un movimiento más lineal. Es posible cuantificar este resultado, si se realiza un histograma del ángulo θ con la posición de dos tiempos consecutivos de una misma partícula obtenemos su linealidad. Un valor de θ ≈ 0 corresponde a una transición hacia la derecha en el eje x, mientras que para valores de θ ≈ -π/2, π/2 incumben un desplazamiento en el eje y. Podemos realizar un ajuste de la función densidad de probabilidad (FDP) para estos resultados
Fig. 8. Trayectoria de las células en píxeles. De izquierda a derecha y de arriba abajo, I/Imáx=0 sin luz externa, I/Imáx=0.5, I/Imáx=1.
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La distribución que más se ajusta se denomina distribución de von Mises junto a un valor constante B que equivale a los valores extremos cuando el ángulo toma valores de θ = -π, π, es decir, cuando el movimiento de la célula toma la dirección negativa del eje x. La forma de este ajuste es
𝑓(𝜃) = 𝐴𝑒𝜅 cos 𝜃+ 𝐵
La desviación estándar disminuye a medida que el valor de la intensidad lumínica aumenta, por tanto, si queremos aumentar la probabilidad de que las Chlamydomonas se dirijan a la constricción utilizaremos siempre el valor máximo de intensidad que nos permita el dispositivo LED.
3.3 Dinámica de obstrucción variando el ancho del cuello de botella.
Se realizaron las grabaciones a 10 fps y con una duración de una hora. Los tres canales tienen un ancho de D = 10, 15, 20 µm y utilizaremos en este apartado los que tienen forma trapezoidal. Suponiendo que las células tienen un diámetro medio de 10 µm, las relaciones cuello-partícula serán de D/d = 1.0, 1.5, 2.0. El experimento empieza cuando las partículas desviadas hacia la constricción mediante el movimiento de fototaxis alcanzan el cuello de botella con un porcentaje en volumen de partículas estable.
Fig. 9. Función densidad de probabilidad junto a su desviación estándar del ángulo θ
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Observamos que para cada uno de los canales se alcanza una estabilidad cuando el porcentaje en volumen alcanza valores ϕ ≈ 60%. Se distinguen tres estados, el primero corresponde al llenado del canal, las partículas pueden atravesar la constricción, pero no pueden ser tomados como datos factibles porque todavía no se ha formado ningún tipo de obstrucción. El segundo atañe al empaquetamiento de partículas necesarias para realizar el cálculo, se trabaja a partir de aquí con este rango de tiempo. El tercero corresponde al apagado del LED, los datos recogidos no pueden ser evaluados en esta fase, pero es interesante notar que cuando las luces se apagan la pendiente es negativa, por tanto, las partículas ya no son atraídas hacia el cuello de botella debido a la existencia de algún flujo en el fluido o cualquier efecto externo comentado en el apartado 1.1.
Conocida la viabilidad, se realiza el gráfico del número de células que escapan en función del tiempo.
Cuando una célula atraviesa la línea roja (Figura 10, izquierda) equivale a que una célula ha atravesado la constricción y por ende se considera que ha escapado. Los segmentos horizontales pertenecen a los lapsos de tiempos en los cuales ninguna de las células atraviesa el cuello de botella, y, por tanto, determinan la generación de una obstrucción.
Si realizamos la función de distribución acumulada (FDA) complementaria de los tiempos de detención entre los que dos células consecutivas pasan a través del cuello de botella.
Fig. 10. Fracción del volumen de partículas en función del tiempo.
Fig. 11. A la izquierda, momento en el cual consideramos que una partícula logra atravesar la constricción. A la derecha representación de las células que cruzan en función del tiempo.
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Como lo predicho teóricamente, la distribución tiene una forma lineal cuando el tiempo de detención es mayor, obteniendo la pendiente mediante un ajuste lineal sabiendo que esta es ∝T - α, los valores de alpha que adquirimos son α = 1.57 ± 0.05, 2.17 ± 0.07, 2.66 ± 0.16 para relaciones D/d = 1.0, 1.5, 2.0
respectivamente. El siguiente paso es la caracterización de los estallidos para los tres canales. Para ello se realiza el cálculo de la pendiente de la figura 10 en función del tiempo (figura 12). cuando los valores de la pendiente superan un valor mínimo y posteriormente decaen por debajo de ese valor equivale a que ha habido un estallido, el incremento de partículas que escapan lo denotamos como s.
Si realizamos la función de densidad de probabilidad (FDP) en función del número de escapes normalizado por su valor medio <s> (Figura 13)
Fig. 12. Izquierda, FDA complementaria en escala logarítmica. Derecha, valores absolutos de la pendiente en función de D/d.
Fig. 13. Ejemplo de la pendiente en función del tiempo, la línea discontinua corresponde al valor mínimo escogido.
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El valor medio para cada uno de los canales es <s> = 1.37, 2.74, 4.01, valores que aumentan a medida que las relaciones D/d crecen. La línea discontinua corresponde al valor esperado predicho en teoría siendo ∝ e -s/<s>, es decir, la pendiente es la misma independientemente del ancho del canal debido al valor medio de los
estallidos.
3.4 Dinámica de obstrucción de diferentes áreas.
Se comprobó si realmente el valor de α dependía solamente del ancho del cuello de botella, por eso para los canales con geometría rectangular se hizo el mismo proceso que el apartado anterior. Esta vez las imágenes se grabaron a 15 fps con una duración de dos minutos y medio, analizando solamente cuando el experimento se encontraba en la fase estable. La relación cuello-partícula es la misma en todo momento (D/d = 2.0) pero el área que se encontraba antes de la constricción era diferente con relaciones A/Amáx = 0.25, 0.5 ,0.75, 1.0.
Fig. 15. A la izquierda, canales uno y cuatro con relaciones A/Amáx = 0.25,1. A la derecha, recuento de las células que atraviesan el cuello de botella.
Fig. 14. FDP en función del número de estallidos divido por su valor medio.
Escala semilogarítmica para valores en el eje. y.
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Calculamos los tiempos de detención y representamos la FDA complementaria para determinar los valores de α
Obtenemos los valores α = - 2.52 ± 0.15, -2.34 ± 0.16, -2.00 ± 0.15, -2.55 ± 0.23 para relaciones de área A/Amáx = 0.25, 0.5 ,0.75, 1.0 respectivamente, obteniendo unos valores de alpha parecidos para los cuatro canales. Comprobamos también si se conserva ∝ e -s/<s>
Fig. 16. FDA complementaria y valores de α para canales con distinta relación A/Amáx.
Fig. 16. FDP en función de los estallidos dividido su valor medio.
Fig. 14. FDP en función del número de estallidos divido por su valor medio.
14 4. Conclusiones.
En este trabajo se demostró que para agentes de materia activa como los son las Chlamydomonas reinhardtii, la generación de una obstrucción cuando cierto número alcanzan una constricción depende
sensiblemente del ancho que posee el cuello de botella. Un ancho de cuello pequeño equivale a estados en el que las partículas no pueden atravesar libremente y que por tanto se genera un flujo de partículas intermitente. A través de la estadística se ha podido cuantificar el comportamiento de estas obstrucciones comprobando que el tiempo de detención entre dos partículas consecutivas cumple que ∝T - α, siendo el valor de alpha dependiente de la relación que hay entre el ancho del cuello y el diámetro de las células (D/d). Aunque no se llegó al mismo resultado que para partículas pasivas [7], si pudimos comprobar que α aumentaba cuando la relación entre D/d era mayor. Las diferencias entre los valores pueden deberse a como se forman las obstrucciones antes de la constricción, para partículas pasivas establecían un arco estable que impedía el paso de las otras partículas que llegaban más tarde, hasta que el flujo del medio en el que estaban rompía esa estabilidad. No obstante, para la materia activa además de la formación de arcos estables podían aparecer otro tipo de obstrucciones debido a una mala aplicación del surfactante o al efecto de algún aspecto no controlable. Aparte se comprobó que mediante la caracterización de estallidos estos seguían una distribución exponencial, determinando así que una partícula tiene la misma probabilidad que las otras de formar una obstrucción y que el valor medio obtenido de los estallidos augmentaba a medida que lo hacia la relación D/d tal y como se obtiene de otros experimentos hechos con materia pasiva [5].
Al trabajar con materia activa se ve incrementada la dificultad en la obtención de datos, ya que influyen más factores no controlables que con la materia pasiva, por ejemplo, en nuestro caso la motilidad de las Chlamydomonas depende del estado de crecimiento exponencial en el que se encuentran, no siempre se podrá obtener la misma reacción de efectos externos como la intensidad lumínica. Por ello de cara a un futuro, se necesitaría para el caso de agentes activos un mayor número de experimentos que mejoren los datos estadísticos.
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