Anàlisi comparatiu de gens de virulència de soques del gènere Pseudomonas

Facultat de Ciències

Memòria del Treball de Fi de Grau

Anàlisi comparatiu de gens de virulència de soques del gènere Pseudomonas

Miquel Joan Servera Lauder Grau de Biologia

Any acadèmic 2014-15

DNI de l’alumne: 41616160Y

Treball tutelat per Dra. Elena Isabel García-Valdés Pukkits Departament de Biologia, Microbiologia

S'autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació

Paraules clau del treball:

Pseudomonas, soques, factors de virulència, relacions, gens, genomes.

NO

Índex

1. Resum i Abstract...pàg.1 2. Introducció...pàg. 2 2.1. Introducció al gènere Pseudomonas...pàg. 2 2.2. Els factors de virulència al gènere Pseudomonas ...pàg. 5 3. Objectius...pàg. 8 4. Materials i mètodes...pàg. 8 4.1. Soques emprades...pàg. 8

4.2.Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1...pàg. 9

4.3. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de 16 altres soques del gènere Pseudomonas...pàg. 9 5. Resultats...pàg. 10

5.1. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1...pàg. 10

5.2. Representació gràfica de les dades de l’anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1...pàg. 23

5.3. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front a 16 altres soques del gènere Pseudomonas...pàg. 24

5.4.Aplicació de l’algoritme “Unweighed Pair Group Method with Arithmetic Mean”

(UPGMA) creat a partir de les dades recopilades de diferents soques...pàg. 25 6. Discussió...pàg. 25 7. Conclusions...pàg. 28 8. Bibliografia...pàg. 28

1 Resum

El gènere Pseudomonas està compost per un conjunt d’espècies adaptades a viure en ambients molt diversos. Aquest fet, juntament amb la baixa especificitat dels seus requeriments nutricionals, fa que sigui un gènere molt ubic. Un dels nínxols que inclou el gènere Pseudomonas és el d’ambients clínics, on l’espècie que rep més atenció és Pseudomonas aeruginosa. És un patogen oportunista causant de malalties com la fibrosi quística. En aquest treball es pretén realitzar un anàlisi

comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 i els factors de virulència de dues soques de Pseudomonas stutzeri: Pseudomonas stutzeri A1501 (aïllada d’un camp d’arròs) i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 (d’origen clínic i soca tipus de l’espècie) per tal d’establir una relació entre les tres soques i, posteriorment, amb altres espècies de Pseudomonas els factors de virulència de les quals són coneguts. Per realitzar l’anàlisi es parteix d’una base de dades de 333 factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa. Per identificar aquests factors de virulència dins el genoma de les dues soques de Pseudomonas stutzeri s’envien a comparar (Local Blast) amb una base de dades nucleotídica que correspon amb els genomes complets de les dues soques de Pseudomonas stutzeri. Els resultats mostren una gran diferència entre els factors de virulència de les soques de Pseudomonas stutzeri i els factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa i que els factors de virulència més conservats són els més essencials, com els relacionats amb la motilitat i la regulació de l’expressió gènica.

Abstract

The Pseudomonas genera is composed by a range of species adapted to a wide variety of environments. This, together with a low specificity in nutritional requirements, makes this genera very ubiquitous. One of the niches related to this genera is the clinical environment in which the most known specie is Pseudomonas aeruginosa. This specie is an opportunistic pathogen related to diseases like Cystic Fibrosis. The aim of this project is to carry out a comparative analysis of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa and the virulence factors of two Pseudomonas stutzeri strains: Pseudomonas stutzeri A1501 (isolated from a rice field) and Pseudomonas stutzeri

ATCC17588 (isolated from clinical environments and type strain of the specie) in order to establish a relationship between the three strains and, later, with other Pseudomonas strains which virulence factors are known. To carry out this analysis, we begin with a database with 333 virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. To identify these virulence factors in the genome of the strains of Pseudomonas stutzeri they are sent to compare (Local Blast) with a nucleotidic database which corresponds with the two whole genomes of the strains of Pseudomonas stutzeri. The results show a great difference between the virulence factors of the Pseudomonas stutzeri strains and the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. They also show that the most conserved virulence factors are those related to basic activities like motility and gene expression regulation.

2 Introducció

Introducció al gènere Pseudomonas

Walter Migula, al 1894, descriu per primer cop gènere el Pseudomonas com a “Cèl·lules amb òrgans polars de locomoció”. Avui en dia, aquest gènere es descriu com bacteris en forma de vara recta o bé lleugerament corbada de 0.5-1.0 m de diàmetre i 1.5-5.0 m de llargària. La majoria d’espècies no acumulen grànuls de poli--hidroxibutirat però es pot donar acumulació de poli- hidroxialcanoats amb llargària monomèrica major a 4 carbonis si el creixement es dóna sobre alcans o gluconat. No produeixen prosteca i no s’envolten de beina. No es coneixen estadis vegetatius. Són Gram negatius. Són mòbils gràcies a un o varis flagels polars i rarament són immòbils. En algunes espècies es formen flagels laterals amb longitud d’ona curta. Són aerobis amb un metabolisme respiratori que estrictament usa oxigen com a acceptor final d’electrons. En alguns casos l’acceptor final pot ser el nitrat, permetent que es dóni creixement anaeròbic. No produeixen xantomonadines.

Moltes, si no totes les espècies, no creixen en medi àcid (pH inferior a 4.5). La majoria d’espècies no requereixen factors de creixement orgànics. Els bacteris poden ser oxidasa-positius o negatius. Són catalasa-positius. Quimioorganotròfics. Hi ha soques de l’espècie que inclouen en la seva composició àcids grassos hidroxilats 3-OH 10:0 i 12:0, 2-OH 12:0 i ubiquinona Q-9. Estan distribuïts àmpliament a la natura. Algunes espècies són patògenes per als humans, animals i plantes. El contingut mol% G + C del DNA és 58-69. L’espècie tipus és Pseudomonas aeruginosa (Palleroni et al. 2004).

Les espècies de Pseudomonas existeixen de manera individual, en parella, o bé formant cadenes curtes. La morfologia pot, ocasionalment, diferir de les descripcions generals. Els pilis són un objecte d’estudi intens en P. aeruginosa degut al seu paper en la patogènesi. El contingut baix en G+C dels gens codificadors de la pilina suggereix que han estat transmesos horitzontalment i, com a conseqüència, tenen un patró diferent en el maneig dels codons (Palleroni et al. 2004).

El fet de que el gènere Pseudomonas sigui tan ubic, sembla conseqüència de els seus simples requeriments nutricionals, el rang de substrats que poden utilitzar com a font de carboni i de la gran adaptabilitat genètica i metabòlica. Es troben espècies en ambients aquàtics, terrestres, així com en teixit animal i vegetal. Essencialment, qualsevol hàbitat amb un rang de temperatura que oscil·li entre 4-42⁰C, un rang de pH entre 4 i 8 i una font utilitzable de carboni, és colonitzable per Pseudomonas.

No es troben espècies de Pseudomonas en ambients termòfils ni acidòfils. Les espècies de Pseudomonas són aeròbiques i, el requeriment d’oxigen, sembla ser la seva major limitació.

Les espècies fitopatògenes es poden trobar generalment sobre plantes malaltes, en les que apareixen com a poblacions relativament homogènies quan les lesions són joves. La distribució a l’exterior de les plantes hoste no és gaire coneguda, tot i que pareix que també poden viure com a sapròfits (Palleroni et al. 2004).

Hi ha espècies de Pseudomonas que tenen un paper important en la indústria alimentària. Són responsables del deteriorament de productes càrnics, aus de corral i peix, encara que l’aliment estigui refrigerat (Barrett et al., 1986). Algunes espècies es troben a l’aigua corrent i a les solucions de sanejament dels hospitals, que són medis oligotròfics (Van der Krooij, 1977). També poden suposar un problema degut a la seva capacitat de formació de biofilms. En la formació de biofilms hi juga un paper important el quorum-sensing on la detecció de la densitat poblacional exerceix un control sobre l’expressió de certs gens. Dues espècies rellevants del gènere són Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas stutzeri.

3 Pseudomonas aeruginosa és un bacteri patogen oportunista ubic amb múltiples nínxols en l’ésser humà, incloent el pulmó. Per a establir una infecció, P. aeruginosa fa ús d’una sèrie de factors de virulència, incloent lipopolissacàrids, fosfolipases, exoproteases, fenazines, vesícules de la membrana externa, factors de secreció de tipus III, flagels i pilis. Aquests factors no només fan malbé les cèl·lules epitelials sinó que també indueixen canvis en la fisiologia i funció de les cèl·lules així com la seva forma, la permeabilitat de la membrana i la síntesi de proteïnes. Tot i que aquests factors són importants en l’inici de la infecció, molts es desregulen o perden la funció durant el curs de la infecció crònica.

Pseudomonas stutzeri va ser descrita per primera vegada per Burri i Stutzer al 1895. Tot i les diferències fenotípiques amb la soca tipus del gènere, la semblança entre les seqüències de rRNA demostren que la inclusió de P. stutzeri en el gènere Pseudomonas és correcte (Lalucat et al. 2006). El treball realitzat en els darrers anys ha donat lloc a l’agrupament de diferents soques en variants genòmiques anomenades genomovars. Les soques pertinents a cada genomovar tenen característiques fenotípiques semblants (Lalucat et al. 2006). Algunes soques tenen especial interès degut a propietats metabòliques específiques. Algunes soques han demostrat ser transformables i això ha donat lloc a estudis intensos de la seva capacitat de transformació. P. stutzeri es distribueix àmpliament en l’ambient ocupant diversos nínxols ecològics incloent teixit humà (Lalucat et al. 2006).

Pseudomonas stutzeri és reconegut, com totes les Pseudomonas, com un membre de la classe Gammaproteobacteria. Les cèl·lules tenen forma de vara, de 1 o 3 m de llargària i 0.5 m de gruixa.

Tenen un únic flagel en posició polar. Sota certes condicions poden desenvolupar un o dos flagels laterals que es caracteritzen per un moviment en longitud d’ona curta. S’ha suggerit que aquests flagels intervenen en el procés de formació d’eixams “swarming” i en la mobilitat per contraccions “twitching motility” sobre superfícies sòlides, tot i que els pilis de tipus IV també poden tenir un paper en aquests processos. Entre altres característiques fenotípiques, són bacteris Gram negatius, catalasa i oxidasa positius i tenen un metabolisme estrictament respiratori. A més, P. stutzeri es defineix com desnitrificant. Es diferencien d’altres espècies del mateix gènere en que no produeixen pigments fluorescents, sense oblidar que no són les úniques dins el grup. Abans dels avanços en els mètodes genòmics per a la identificació de bacteris P. stutzeri fou confós amb altres espècies degut a la semblança fenotípica. P. stutzeri pot viure en ambients oligotròfics, amb ions d’amoni o nitrat i una única molècula orgànica com a font de carboni i energia. Algunes són diazotròfiques i aquesta característica és rara dins el gènere Pseudomonas. Cap soca tolera condicions acídiques i no creixen sota un pH de 4.5. Té un metabolisme respiratori on l’oxigen és l’acceptor final d’electrons. Tot i així, totes les soques poden utilitzar nitrat com un acceptor alternatiu d’electrons donant lloc a un procés de desnitrificació. Tenen la capacitat de degradar oxidativament compostos aromàtics mitjançant mono- i dioxigenases. Una característica fenotípica d’aquesta espècie és la capacitat amilolítica. Les espècies de Pseudomonas són quimiotàctiques i són atretes per un ampli espectre de compostos orgànics. Tot i així, la maquinària que permet dur a terme aquests processos roman inexplorada. Una característica és que també són atretes per compostos que són incapaces de metabolitzar (Ortega- Calvo et al. 2006; Lalucat et al. 2006). Les espècies de Pseudomonas tenen un ampli rang d’adhesines que tenen un paper en la unió al substrat i això duu a la formació de biofilms. Tant els flagels com els pilis semblen ser importants en la colonització de superfícies biòtiques i abiòtiques, particularment en la formació inicial de microcolònies (Lalucat et al. 2006).

El concepte de genomovar va ser definit com un taxó provisional per a Pseudomonas stutzeri per a classificar soques genotípicament similars dins l’espècie. Dues soques que es classifiquen fenotípicament com a membres de l’espècie s’inclouen en la mateixa genomovar quan la comparació DNA-DNA dona valors de semblança superior al 70%. Al contrari, quan dues soques comparades tenen un valor de semblança igual o inferior al 50% es classifiquen en genomovars diferents. Les nostres dues soques de Pseudomonas stutzeri es classifiquen a la genomovar 1.

4 Figura I. Relacions entre diferents genomovars del gènere Pseudomonas. (M. Gomila, Comunicación personal).

Un dels factors que afavoreix la ubiqüitat de l’espècie és el fet de que és altament transformable.

També pot ser un dels factors que afavoreixi el procés de diversificació que es dóna dins la mateixa espècie. Aproximadament un terç de les soques que pertanyen a l’espècie tenen la capacitat de transformar-se. És una capacitat que ha estat molt estudiada en els darrers vint anys. S’ha demostrat que P. stutzeri es pot transformar a partir de DNA associat a partícules minerals al laboratori, a partir de DNA unit a sediments marins autoclavats i DNA adsorbit en sòl estèril (Lalucat et al. 2006). P. stutzeri es pot transformar a partir de DNA cromosòmic i de DNA plasmídic. El DNA que s’inclou en el genoma en el procés de transformació pot ser de la mateixa espècie o por provenir d’una espècie distinta (Lalucat et al. 2006). S’ha demostrat el rol que tenen els pilis de tipus IV en el procés de transformació.

Pseudomonas stutzeri és una espècie associada als ambients clínics. Tot i així, en la majoria dels casos les infeccions ocorren en pacients immunodeprimits, revelant el baix grau de virulència de l’espècie. S’han fet estudis de la sensibilitat de P. stutzeri front a diferents antibiòtics. Aquests estudis revelen que P. stutzeri és sensible a més antibiòtics que P. aeruginosa. Aquesta major sensibilitat es va explicar pel fet de que la prevalença de l’espècie als hospitals és molt més baixa que la prevalença de P. aeruginosa i que, per tant, ha estat exposada a menys antibiòtics. Tot i aquests resultats, s’han aïllat soques resistents de P. stutzeri per a quasi totes les famílies d’antibiòtics i això suposa que l’espècie té un ampli rang de mecanismes de resistència a agents antimicrobians dels quals se n’han descrit dos.

Un mecanisme es basa en alteracions en les proteïnes de la membrana externa i de la composició de lipopolisacàrids. L’altre es basa en la presència de -lactamases que hidrolitzen les penicil·lines, cefalosporines i monobactames (Lalucat et al. 2006). El genoma de Pseudomonas stutzeri A1501 fou seqüenciat per Yongliang Yan et al. al 2008 aïllada d’un camp d’arròs (Yongliang Yan et al. 2008). Els resultats obtinguts revelen que es composa per un únic cromosoma circular de 4,567,418 pb. Codifica 4,146 probables proteïnes, 59 gens de tRNA i quatre operons de rRNA. Conté 42 còpies de seqüències

5 repetides (formant part d’un 1.35% del genoma) que s’agrupen en 10 tipus diferents que codifiquen per transposases. Conté quatre regions amb un contingut atípic de CG que estan flanquejades per gens de tRNA que, juntament amb una estructura típica d’illes genòmiques, suggereix que el material genètic ha estat transferit recentment dins la soca. També hi ha una cinquena regió amb gens nif que també es podria considerar una illa genòmica. La mida del genoma és més petita que la d’altres espècies de Pseudomonas. L’espècie a la que més s’assembla és a Pseudomonas aeruginosa tot i que la majoria de gens codificadors de factors de virulència presents a P. aeruginosa no són presents a P.

stutzeri A1501 com els sistemes de secreció de tipus III i IV, sistemes de síntesi de molècules involucrades en el quòrum sensing, la síntesi d’alginat, sideròfors i rutes biosintètiques d’antibiòtics.

El genoma de la soca ATCC 17588 de Pseudomonas stutzeri fou estudiat per Ming Chen et al. al 2011 i és la soca tipus de l’espècie. Consisteix en un únic cromosoma circular de 4,547,930 pb amb un contingut mitjà de GC del 63.9%. No es varen detectar plàsmids. El genoma conté 4,217 gens codificadors de proteïnes, 58 gens codificadors de tRNA i 12 gens codificadors de rRNA. El genoma és un poc més petit que el de P. stutzeri A 1501 però és molt semblant. Les dues soques comparteixen 3,255 gens i 614 gens són exclusius de la soca ATCC 17588. Més de la meitat d’aquests gens codifiquen proteïnes de funció desconeguda. Conté gens involucrats en la desnitrificació, la degradació de benzoat/catecol, quimiotaxis i altres funcions com la soca A 1501 però, no conté gens per a la fixació de nitrogen.

Els factors de virulència a Pseudomonas

La patogenicitat és la capacitat o habilitat d’un organisme de causar una malaltia. La virulència és la mesura quantitativa de la capacitat de causar una malaltia, és a dir, una mesura de la patogenicitat (Chen et al., 2012). Els factors de virulència són proteïnes extracel·lulars, la majoria enzims, produïdes per patògens que contribueixen en la invasió i colonització dels teixits i en l’establiment i al manteniment de la malaltia (Brock, 10ª Edició, 2004.). Hi ha dos tipus de factors de virulència. Per una banda, tenim els que estan involucrats en les infeccions agudes. Aquests es troben o bé en la superfície de l’organisme o bé són secretats. Els pilis, la exotoxina A, la fosfolipasa C i l’exoenzim S són factors de virulència que pertanyen a aquest primer grup. Per altra banda trobem els factors involucrats en la infecció crònica. Entre aquests hi trobem els sideròfors i la producció d’una pseudocàpsula d’alginat en el cas de pacients malalts de fibrosi quística. Per regular tots aquests factors de virulència trobem dos tipus de sistemes de regulació. Per una banda trobem el sistema regulatori transcripcional de dos components i el sistema de quorum sensing. Aquests dos mecanismes són necessaris per a la supervivència i la proliferació dels microorganismes dins l’hoste.

Un dels factors de virulència que empra Pseudomonas és l’alginat. L’alginat és una biomolècula d’elevat pes molecular composta per polímers d’àcid L-gulurònic i D-mannurònic amb enllaços -1,4.

Un cas molt estudiat és el de la producció d’alginat per Pseudomonas aeruginosa en casos de fibrosi quística. La infecció dels pulmons causa el reclutament de cèl·lules inflamatòries al lloc d’infecció, on alliberen espècies reactives d’oxigen que causen mal al teixit. L’alginat sembla protegir al patogen dels radicals lliures a més de brindar protecció front als fagòcits ja que, tot i la seva presència, els anticossos que juguen un paper en la resposta fagocítica no són capaços d’intervenir en la resposta immune contra el patogen. També protegeix al patogen de la deshidratació i antibiòtics i a més proporciona adherència a les cèl·lules epitelials formant un biofilm (Ryder et al., 2007).

Un altre factor de virulència descrit és l’exoenzim-S (ADP-ribosyltransferase). És un factor associat a l’habilitat del patogen de creuar barreres epitelials i passar al torrent sanguini a partir del qual pot distribuir-se a la resta de l’organisme de l’hoste. És el responsable de la disrupció de la organització normal del citoesquelet, de la destrucció de les immunoglobulines G i A, de la despolimerització dels

6 filaments d’actina i contribueix a la resistència a macròfags (Rucks et al., 2002). La Exotoxina de Pseudomonas és una toxina secretada amb la capacitat de transposar un domini catalític dins cèl·lules de mamífers a través de receptors específics. Una vegada la toxina ha arribat al citoplasma s’inhibeix la síntesi de proteïnes degut a la interrupció de l’activitat de ribosilació de l’ADP del factor 2 d’elongació. Causa necrosi del teixit (Allured et al., 1985). La fosfolipasa-C és un enzim hidrolític que hidrolitza l’enllaç fosfodièster dels fosfolípids. La seva funció més característica com a factor de virulència és l’hemòlisi. Els llocs d’acció més comuns són el fetge i els ronyons de mamífers (Elleboudy et al., 2014).

Els flagels també juguen un paper important en la virulència. Els flagels són essencials per a la motilitat del patogen i això, combinat amb la quimiotaxis, permet al patogen dirigir-se cap als substrats que siguin més convenients. En el cas de Pseudomonas, la presència i ús dels flagels es pot combinar amb la twitching motility. En el procés de la twitching motility hi juguen un paper important els pilis o fímbries de tipus IV. Aquests pilis també intervenen en l’adhesió a cèl·lules epitelials (Feldman et al., 1997). El nombre de flagels de P. aeruginosa ve controlat per la FleN, una proteïna putativa d’unió de ATP-GTP. L’alteració d’aquesta proteïna resulta en un descontrol en el nombre de flagels que donarà lloc a defectes de motilitat, important per a activitats com la quimiotaxis (Dasgupta et al., 2000).

S’accepta que els flagels laterals participen en l’activitat de swarming (Shinoda i Okamoto, 1977).

Els sideròfors són un altre factor de virulència present a Pseudomonas. Els sideròfors són agents quelants d’ions ferrosos que permeten als patògens obtenir ferro, indispensable per al seu creixement.

Un d’aquests sideròfors presents a Pseudomonas és la pioquelina, el precursor de la qual és el salicilat.

Pseudomonas conté gens que codifiquen per a la biosíntesi de salicilat i gens que codifiquen per a la transformació d’aquest a pioquelina. Un altre sideròfor present en Pseudomonas és la pioverdina (Gherinot, 1994).

La producció d’antibiòtics també pot considerar-se com un factor de virulència ja que pot reduir possibles competències. Un antibiòtic produït per Pseudomonas és la fenazina. En el cas de Pseudomonas aeruginosa, el precursor de la fenazina és l’àcid shikímic. A partir de les fenazines es poden produir derivats amb activitat antibiòtica com la piocianina. La producció de la fenazina és un procés regulat pel quorum sensing (Mazzola et al., 1992).

Una gran part dels factors de virulència són proteïnes que han de ser secretades. Aquestes poden quedar adherides a la superfície del patogen, poden alliberar-se a la matriu extracel·lular o bé poden ser injectades al citosol d’una cèl·lula hoste. En bacteris Gram negatius, la secreció de proteïnes s’aconsegueix després de creuar una envolta formada per dues barreres hidròfobes, la interna (citoplasmàtica) i l’externa que delimiten una capa intermitja de peptidoglicà, el periplasma. S’han descrit sis classes de sistemes de secreció que s’anomenen des de “Type I Secretion System” o T1SS fins a “Type VI Secretion System” o T6SS. Més recentment s’han descrit dos sistemes de secreció més, el T7SS i el “fimbrial chaperone-usher pathway” (Bleves et al., 2010).

El T1SS és un dels sistemes de secreció més simples. Requereix una proteïna de la membrana externa, un transportador ABC (ATP-binding cassette) que s’insereix a la membrana interna i aporta energia al procés i, finalment, una proteïna adaptadora que connecta els dos components anteriors.

Els substrats del T1SS estan senyalats amb una senyal de secreció no escindible a l’extrem C-terminal.

Les exoproteïnes es secreten en forma desplegada.

El T2SS també rep el nom de “secreton” i és un dels sistemes utilitzats per bacteris Gram negatius més versàtils per secretar proteïnes extracel·lulars al medi que les envolta. És el que més facilitat té de promoure la translocació de la membrana externa d’una gran varietat de proteïnes multimèriques que es pleguen en el periplasma. El T2SS consta de 3 parts i el seu sistema de muntatge es considera

7 homòleg al dels pilis de tipus IV. La primera part és una plataforma proteica que forma la base i utilitza ATP com a motor. La segona part és un canal constituït per una estructura multimèrica inclosa en la membrana externa i, finalment, una estructura fimbrilar que s’anomena el pseudopili. El paper del pseudopili és empènyer les proteïnes a través del canal cap a l’exterior cel·lular amb la força de l’ATP que li proporciona el motor.

El T3SS és un sistema que permet la injecció de proteïnes tòxiques, anomenades efectors, directament dins el citosol de la cèl·lula hoste. El contacte entre la cèl·lula bacteriana i la cèl·lula eucariota promou la translocació dels efectors en un mecanisme d’una passa. Molts d’aquests efectors de tipus III són proteïnes que imiten les proteïnes eucariotes i poden modificar la resposta de l’hoste.

L’aparell del T3SS també es coneix com injectosoma i està relacionat amb el sistema d’assemblatge de flagels. El mecanisme és semblant al del secreton, a diferència de que el T3SS insereix els efectors a l’interior de la cèl·lula hoste en lloc de deixar-los a la matriu extracel·lular.

Les subunitats proteiques del T4SS formen un canal en les membranes bacterianes i, freqüentment una estructura en forma de pili. És una eina fonamental en la transmissió horitzontal de material. El T4SS no només transfereix proteïnes sinó que també complexes nucleoprotèics i, per això, juga un paper important en la transferència horitzontal de gens. La transferència horitzontal de gens ha jugat un paper important en la evolució de Pseudomonas. S’han descrit transferències de factors de virulència i factors de resistència a antibiòtics (Juhas, 2014). En la majoria dels casos, els gens que codifiquen per al T4SS es localitzen en un únic operó però, el mecanisme de regulació no està descrit en Pseudomonas sinó que s’utilitzen models com Agrobacterium tumefaciens o Eschericha coli (Darbari et al., 2015).

El T5SS és el sistema de secreció més senzill descrit fins ara. Permet la sortida de proteïnes grosses associades amb la virulència i l’adhesió. Consta d’un procés de dues passes. Primer, les proteïnes creuen la membrana interna a través de la maquinària de transport Sec. Després, es transporten a través de la membrana externa a través d’un canal format per un barril . Finalment, o bé les exoproteïnes romanen associades a la cara exterior de la membrana externa o bé són alliberades a la matriu extracel·lular per escissió proteolítica. Hi ha dos tipus de T5SS en bacteris Gram negatius: els autotransportadors (AT o T5aSS i T5cSS) i els “2-partner secretion” (TPS o T5bSS). Les proteïnes que es secreten a través d’autotransportadors tenen un únic pèptid senyal a l’extrem amino-terminal, un domini  de 12 làmines  a l’extrem C-terminal i, entre aquest dos un domini passatger que engloba el domini catalític de la proteïna. El pèptid senyal permet l’exportació de la proteïna a través de la membrana interna i després s’escindeix. Una vegada en el periplasma, l’extrem C-terminal s’insereix en la membrana externa i forma un barril  que permetrà o bé l’exposició del domini passatger a la superfície del bacteri o bé el seu alliberament a la matriu extracel·lular després de l’escissió per autoproteòlisi o per una proteasa específica. La diferència entre el T5aSS i el T5bSS és que els barrils  estan formats per un monòmer o per un homo-trímer (cada monòmer amb 4 làmines ) respectivament.

El T6SS és un sistema de secreció els substrats del qual no tenen pèptid senyal. Els substrats s’anomenen Hcp (hemolysin-coregulated protein) i VgrG (valine-glycine repeat) i s’alliberen al medi extracel·lular. Hi ha evidències que suggereixen que les Hsp i VgrG que es secreten podrien considerar- se com a components extracel·lulars que formarien part de la maquinària de la T6SS. Això és degut a que l’estructura de Hcp és homòloga al domini tubular de la coa del bacteriòfag T4 i que l’estructura de l’extrem amino-terminal de la VgrG s’assembla a les proteïnes gp5 i gp27 del bacteriòfag T4 que compondrien la punxa de la coa. Aquesta estructura permetria perforar la membrana cel·lular.

8 Figura II. A. Estructura dels sistemes de secreció T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS. (Brock et al. 2009).

Figura II. B. Representació esquemàtica dels diferents factors de secreció (Bleves et al., 2010).

Objectius

- Realitzar un anàlisi comparatiu dels factors de virulència presents a dues soques de Pseudomonas: una d’origen clínic anomenada Pseudomonas stutzeri ATCC17588 i una d’origen ambiental anomenada Pseudomonas stutzeri A1501 front als factors de virulència coneguts de Pseudomonas aeruginosa PAO1.

- Establir relacions entre els factors de virulència d’aquestes dues soques i els factors de virulència d’altres espècies del gènere Pseudomonas, ja coneguts.

- Clarificar la diferència entre la soca Pseudomonas stutzeri A1501 i la soca Pseudomonas stutzeri ATCC17588.

Materials i mètodes

Característiques de les soques emprades

Pseudomonas aeruginosa PAO1 conté un cromosoma circular de 6.26 Mb amb un percentatge de GC del 66.6%. El seu genoma presenta 5,697 gens que codifiquen per 5,572 proteïnes. Conté 13 tipus de rRNA, 63 tipus de tRNA i 30 tipus d’altres RNA. El seu nombre de referència al National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) és NC_002516.2. Pseudomonas stutzeri A1501 conté un cromosoma circular de 4.57 Mb amb un percentatge de GC del 63.9%. El seu genoma presenta 4,119 gens que codifiquen per 4,093 proteïnes. Conté 12 tipus de rRNA i 60 tipus de tRNA. El seu nombre de referència al National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) és NC_009434.1. Pseudomonas stutzeri ATCC17588 o bé Pseudomonas

9 stutzeri LMG1119 conté un cromosoma circular de 4.55 Mb amb un percentatge de GC del 63.9%. El seu genoma presenta 4,181 gens que codifiquen per 4,051 proteïnes. Conté 12 tipus de rRNA i 59 tipus de tRNA. El seu nombre de referència al National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) és NC_015740.1.

Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i

Es va fer servir una base de dades de factors de virulència del genoma de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (NC_002516.2 com a nombre de referència a l’NCBI) creada per la Dra. García-Valdés al laboratori de Microbiologia a partir dels treballs de Potvin, Winstanley i Wolfgang (Potvin et al. 2003;

Winstanley et al. 2009; Wolfgang et al. 2003) que inclouen 333 factors de virulència. Per a identificar aquests factors de virulència en els genomes de Pseudomonas stutzeri A1501 (NC_009434.1 com a nombre de referència a l’NCBI) i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 (NC_015740.1 com a nombre de referència a l’NCBI) es va utilitzar el programa BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, T. A. 1999). El que es feia era crear una base de dades local, un “local blast”, comparant la seqüència nucleotídica del factor de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 amb al genoma sencer de les dues soques. Cada factor s’enviava a comparar (Local Blast) amb una base de dades nucleotídica que corresponia amb el genoma sencer de la soca desitjada. Hi havia una base de dades nucleotídica per a cada soca. Les dades obtingudes de la realització del local blast s’introduïen i organitzaven a una fulla de càlcul de Microsoft Excel (2010 Microsoft Corporation versió 14.0.7153.5000). El criteri establert per a determinar que un factor de virulència era present a alguna de les dues soques va ser que hi hagués al menys un 75% de solapament i un 65% d’identitat entre les dues seqüències comparades. Els factors de virulència que compleixen aquest criteri es varen marcar de color verd i, al contrari, els que no compleixen el criteri es marcaren de color vermell. Per a la representació gràfica de les dades es va utilitzar el mateix programa Microsoft Excel (2010 Microsoft Corporation versió 14.0.7153.5000).

Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i

Per a la realització de l’”Unweighed Pair Group Method with Arithmetic mean” (UPGMA) es varen fer servir dades de diferents soques de bacteris del Virulence Factors Data Base de l’Institute of Pathogen Biology de Pequín, Xina (http://www.mgc.ac.cn/VFs/). Les soques utilitzades eren: Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14, Pseudomonas aeruginosa LESB58, Pseudomonas entomophila L48, Pseudomonas protegens, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas fluorescents SBW25, Pseudomonas mendocina ymp, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas putida F1, Pseudomonas putida GB-1, Pseudomonas putida W619, Pseudomonas syringae DC3000 (patògen de la tomàtiga), Pseudomonas syringae B728a (patògen del blat de moro) i Pseudomonas syringae 1448A (patògen dels fesols). Es varen descarregar les dades en format Microsoft Excel i es varen transformar en una matriu on, en cas d’haver-hi presència del factor de virulència s’assignava un 1 a la cel·la i, en cas contrari, un 0. Una vegada feta la matriu, s’introduïen les dades en format FASTA al programa online DendroUPGMA (S. García-Vallvé i P. Puigbò, 2002. http://genomes.urv.cat/UPGMA/index.php?entrada=Example2) que, a partir d’aquestes dades, crea una matriu amb tots els coeficients de Jaccard (que indica la similitud entre les diferents variables) a partir de la qual construeix el dendrograma.

10 Resultats

Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de Pseudomonas aerugiosa PAO1

L’anàlisi de les dades ha permès obtenir els següents resultats:

La següent taula recopila totes les dades de cada un dels 333 factors de virulència de cada una de les dues soques, introduïdes una per una a la base de dades local “local blast”. Es va realitzar un total de 666 local blasts i es varen introduir les dades una per una a la taula d’esxel. A la primera columna es mostra la categoria en que s’agrupa el factor de virulència. La segona columna correspon al nom del gen o el seu locus tag. La tercera columna mostra el nombre de nucleòtids que té la seqüència del factor de virulència a Pseudomonas aeruginosa PAO1, la qual s’introdueix al local blast per comparar amb el genoma de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588. El “valor de solapament” mostra el valor de solapament que s’ha obtingut entre la seqüència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 i la seqüència de Pseudomonas stutzeri ATCC17588, és a dir, la llargària, en nucleòtids, de la seqüència que coincideix a les dues espècies comparades. El “% de solapament” indica el percentatge coincident dins la seqüència total del factor de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1. El “valor d’identitat” indica el nombre de nucleòtids idèntics dins la seqüència coincident i, finalment, el “% d’identitat” indica el percentatge de nucleòtids idèntics dins la seqüència coincident.

Grups majoritaris de factors de virulència

Gens/Locus tag (*)

Nº nucleòtids a PAO1

Valor solapament de ATCC17588 i PAO1

%

Solapament ATCC17588 i PAO1

Valor identitat de ATCC17588 i PAO1

% Identitat ATCC17588 i PAO1

Valor solapament de A1501 i PAO1

%

Solapament A1501 i PAO1

Valor identitat A1501 i PAO1

% Identitat A1501 i PAO1

% Identitat ATCC17588 i A1501

Adherèn-

cia Flagels

fliF 1797 654 36,39 550 84 654 36,39 551 84 99,82

flgD 714 239 33,47 200 83 22 3,08 21 95 10,50

flgB 408 119 29,17 101 84 73 17,89 64 87 63,37

flgC 441 134 30,39 117 87 168 38,10 152 90 76,97

flgF 750 174 23,20 148 85 537 71,60 445 82 33,26

flgG 786 761 96,82 669 84 764 97,20 669 87 100,00

flhA 2124 2074 97,65 1726 83 2074 97,65 1733 83 99,60

11

flhB 1137 568 49,96 465 81 477 41,95 396 83 85,16

flhF 1290 290 22,48 236 81 290 22,48 236 81 100,00

fliP 768 347 45,18 306 88 347 45,18 306 88 100,00

fliQ 270 189 70,00 162 85 189 70,00 162 85 100,00

fliR 777 170 21,88 151 88 170 21,88 150 88 99,34

fliD 1425 19 1,33 19 100 19 1,33 19 100 100,00

flgE 1389 215 15,48 184 85 115 8,28 93 80 50,54

flgK 2052 105 5,12 93 88 47 2,29 44 93 47,31

flgL 1320 19 1,44 19 100 22 1,67 22 100 86,36

fliE 330 221 66,97 187 84 221 66,97 188 85 99,47

flgH 696 296 42,53 252 85 342 49,14 297 86 84,85

fliG 1017 983 96,66 847 86 983 96,66 850 86 99,65

fliM 972 935 96,19 821 87 935 96,19 823 88 99,76

fliN 474 255 53,80 222 87 255 53,80 222 87 100,00

flgI 1110 1046 94,23 864 82 1017 91,62 865 85 99,88

flgJ 1203 265 22,03 223 84 288 23,94 247 85 90,28

fliJ 444 33 7,43 33 100 33 7,43 33 100 100,00

fliO 453 178 39,29 147 82 179 39,51 147 82 100,00

fleN 843 752 89,21 622 82 788 93,48 657 83 94,67

fliC 1467 118 8,04 101 85 359 24,47 300 83 33,67

fliI 1356 1163 85,77 1000 85 1163 85,77 1005 86 99,50

flgM 324 21 6,48 21 100 40 12,35 36 90 58,33

PA1103 807 536 66,42 428 79 537 66,54 431 80 99,30

PA1441 1283 306 23,85 253 82 306 23,85 253 82 100,00

Pilis de tipus IV

pilQ 2145 245 11,42 195 79 92 4,29 79 85 40,51

fimT 510 16 3,14 16 100 24 4,71 22 91 72,73

fimU 507 18 3,55 18 100 18 3,55 18 100 100,00

pilB 1701 650 38,21 534 82 821 48,27 672 81 79,46

pilB 1701 650 38,21 534 82 821 48,27 672 81 79,46

12

pilE 426 20 4,69 20 100 28 6,57 26 92 76,92

pilF 759 84 11,07 74 88 84 11,07 74 88 100,00

pilM 1065 469 44,04 390 83 489 45,92 403 82 96,77

pilN 597 151 25,29 120 79 179 29,98 141 78 85,11

pilO 623 323 51,85 257 79 131 21,03 109 83 42,41

pilP 525 51 9,71 43 84 51 9,71 45 88 95,56

pilV 558 54 9,68 46 85 30 5,38 29 96 63,04

pilW 825 60 7,27 52 86 61 7,39 52 85 100,00

pilX 588 21 3,57 21 100 21 3,57 21 100 100,00

pilY1 3486 64 1,84 56 87 94 2,70 78 82 71,79

pilY1 3486 64 1,84 56 87 94 2,70 78 82 71,79

pilY2 348 23 6,61 22 95 23 6,61 22 95 100,00

pilZ 357 317 88,80 284 90 317 88,80 287 90 98,95

pilA 450 19 4,22 19 100 19 4,22 19 100 100,00

pilD 873 152 17,41 133 87 152 17,41 132 86 99,25

cupA1 552 24 4,35 23 95 24 4,35 23 95 100,00

cupA4 1362 22 1,62 22 100 22 1,62 22 100 100,00

cupB6 1146 21 1,83 21 100 23 2,01 22 95 95,45

cupC1 618 17 2,75 17 100 19 3,07 19 100 89,47

cupE4 789 19 2,41 19 100 20 2,53 20 100 95,00

pilC 1125 101 8,98 85 84 102 9,07 85 83 100,00

Prot.

Adhe. cupB5 3057 19 0,62 19 100 20 0,65 20 100 95,00

Probable adhesin

znuA 924 190 20,56 154 81 190 20,56 157 82 98,09

PA2407 954 21 2,20 21 100 29 3,04 27 93 77,78

Anti-

fagocitosi Alginat

alg44 1170 23 1,97 22 95 23 1,97 22 95 100,00

alg8 1485 20 1,35 20 100 20 1,35 20 100 100,00

algX 1425 22 1,54 21 95 22 1,54 21 95 100,00

algK 1428 21 1,47 21 100 20 1,40 20 100 95,24

13

alfF 651 25 3,84 24 96 25 3,84 24 96 100,00

algI 1563 66 4,22 58 87 66 4,22 58 87 100,00

algJ 1176 22 1,87 22 100 21 1,79 21 100 95,45

algE 1473 25 1,70 24 96 25 1,70 24 96 100,00

algG 1632 20 1,23 20 100 30 1,84 27 90 74,07

algW 1170 449 38,38 382 85 449 38,38 382 85 100,00

mucC 456 18 3,95 18 100 23 5,04 22 95 81,82

Captació de ferro

Pio- chelina

pchD 1644 33 2,01 30 90 38 2,31 34 89 88,24

pchC 756 21 2,78 21 100 21 2,78 21 100 100,00

pchF 5430 22 0,41 22 100 27 0,50 26 96 84,62

Pio- verdina

pvdD 7347 19 0,26 19 100 19 0,26 19 100 100,00

pvdD 7347 19 0,26 19 100 19 0,26 19 100 100,00

pvdF 828 19 2,29 19 100 19 2,29 19 100 100,00

Paerucu- marina

pvcA 987 20 2,03 20 100 20 2,03 20 100 100,00

pvcB 876 19 2,17 19 100 22 2,51 21 95 90,48

pvcC 1503 31 2,06 28 90 31 2,06 28 90 100,00

pvcD 648 23 3,55 22 95 23 3,55 22 95 100,00

Salicilat pchA 1431 20 1,40 20 100 20 1,40 20 100 100,00

pchB 306 18 5,88 18 100 18 5,88 18 100 100,00

Àc. Aerug. pchE 4317 37 0,86 34 91 37 0,86 34 91 100,00

Abs.

Hemo. phuR 2295 19 0,83 19 100 37 1,61 34 91 55,88

Proteases

Proteasa alcalina

aprA 1440 32 2,22 29 90 32 2,22 29 90 100,00

aprA 1440 32 2,22 29 90 32 2,22 29 90 100,00

aprI 396 20 5,05 20 100 20 5,05 20 100 100,00

aprF 1446 20 1,38 20 100 20 1,38 20 100 100,00

aprD 1782 42 2,36 39 92 42 2,36 38 90 97,44

aprE 1299 18 1,39 18 100 19 1,46 19 100 94,74

lasA lasA 1257 22 1,75 22 100 22 1,75 22 100 100,00

14

lasB lasB 1497 25 1,67 24 96 25 1,67 25 100 96,00

Sistemes de secreció

T2SS

PA0683 1146 19 1,66 19 100 19 1,66 19 100 100,00

PA0684 594 20 3,37 20 100 17 2,86 17 100 85,00

PA0685 2412 21 0,87 21 100 30 1,24 28 93 75,00

PA0686 1410 419 29,72 335 79 326 23,12 263 80 78,51

PA0687 1215 32 2,63 32 100 32 2,63 32 100 100,00

PA1382 2280 18 0,79 18 100 18 0,79 18 100 100,00

PA2672 591 22 3,72 21 95 17 2,88 17 100 80,95

PA2673 426 18 4,23 18 100 18 4,23 18 100 100,00

PA2674 411 18 4,38 18 100 28 6,81 26 92 69,23

PA2675 435 18 4,14 18 100 25 5,75 23 92 78,26

PA2676 1188 18 1,52 18 100 18 1,52 18 100 100,00

PA2677 1728 69 3,99 65 94 66 3,82 62 93 95,38

Sistema de secreció xcp (T2SS)

xcpU 519 56 10,79 50 89 56 10,79 50 89 100,00

xcpQ 1977 299 15,12 255 85 299 15,12 256 85 99,61

xcpQ 1977 299 15,12 255 85 299 15,12 256 85 99,61

xcpS 1218 404 33,17 347 85 404 33,17 347 85 100,00

xcpT 447 399 89,26 348 87 399 89,26 348 87 100,00

xcpV 390 46 11,79 42 91 46 11,79 41 89 97,62

xcpW 714 77 10,78 67 87 77 10,78 67 87 100,00

xcpX 1002 36 3,59 35 97 36 3,59 35 97 100,00

xcpY 1149 26 2,26 25 96 26 2,26 25 96 100,00

xcpZ 525 19 3,62 19 100 23 4,38 22 95 86,36

T3SS

pscO 477 19 3,98 19 100 21 4,40 21 100 90,48

pscP 1110 20 1,80 20 100 20 1,80 20 100 100,00

pscQ 930 18 1,94 18 100 18 1,94 18 100 100,00

pscR 654 53 8,10 48 90 53 8,10 48 90 100,00

pscT 789 19 2,41 27 93 29 3,68 27 93 100,00

pscU 1050 20 1,90 20 100 20 1,90 20 100 100,00