Kitosanbaserte vaginale filmer med faste lipidnanopartikler:
Fremstilling og karakterisering
Jiaen Yan
Masteroppgave for graden master i farmasi Avdeling for galenisk farmasi
45 studiepoeng
Farmasøytisk institutt
Det matematiske-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
Mai 2021
II
Kitosanbaserte vaginale filmer med faste lipidnanopartikler:
Fremstilling og karakterisering
Jiaen Yan
Masteroppgave for graden master i farmasi Avdeling for galenisk farmasi
Farmasøytisk institutt
Det matematiske-naturvitenskapelige fakultet
UNIVERSITETET I OSLO Mai 2021
Veiledere:
Ingunn Tho
Sverre Arne Sande
© Jiaen Yan Mai 2021
Kitosanbaserte vaginale filmer med faste lipidnanopartikler: fremstilling og karakterisering Jiaen Yan
http://www.duo.uio.no/
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
IV
Sammendrag
Bakgrunn: Vaginale infeksjoner er anerkjent som et globalt helseproblem som kan ramme kvinner i alle aldre. Konvensjonelle legemiddelformer til vaginal bruk har ofte begrenset effekt på grunn av selvrensingsmekanismen i vagina som fører til at legemiddel blir for raskt eliminert sammen med utflod av vaginal væsken. I tillegg kan mange kvinne oppleve residiverende infeksjoner på grunn ufullstendig behandling og resistensutvikling, noe som til en viss grad skyldes dårlig pasientetterlevelse av behandlingen. Av den grunn er det et behov for utvikling av nye legemiddelformuleringer som vil ha en økt residenstid på slimhinnen og sørge for at legemidlet er på virkningsstedet lenge nok til å øke behandlingseffekt og samtidig være bedre akseptert av kvinnene slik at pasientetterlevelse øker. Målet med dette prosjektet var å utvikle mucoadhesive filmformuleringer som i kombinasjon med faste lipid-nanopartikler (SLN) kan egne seg som doseringssystem for behandling av vaginale infeksjoner.
Metoder: Lipidet fosfatidylkolin fra soya (Lipoid S100) og surfaktanten Polysorbat 80 ble brukt til å fremstille SLN med metronidazol eller klotrimazol ved hjelp av en løsningsinjeksjonsmetode. Metoden innebærer rask injeksjon av en lipidfase i en vandig fase.
Partikkelstørrelse, størrelsesfordeling og zetapotensial til SLN-formuleringene ble karakterisert ved hjelp av Zetasizer Nano-SZ. Innkapslingsgrad av legemiddel i SLN ble bestemt ved hjelp av en ultrasentrifugeringsmetode. Alle SLN-formuleringene ble også testet for lagringsstabilitet over 15 uker i kjøleskap. Kitosan filmer ble fremstilt ved å løse 1% (w/w) kitosan og 2 % (w/w) glyserol i 1 % (v/v) eddiksyre. 0,01% (w/w) glyseraldehyd som er en kryssbinder og SLN- suspensjoner tilsettes til den homogene polymerløsning etter ønske. Ferdiglaget polymerløsning støpes i en petriskål og lufttørkes på en flat overflate. Ferdig tørket filmer kuttes i enhekt doser (2 x 2 cm) og tykkelse og masse bestemmes. Filmens mekaniske egenskaper og mucoadhesive egenskaper ble undersøkt ved hjelp av en teksturmåler. Svellingsgrad og erosjon ble undersøkt i 0,1 % (v/v) melkesyre (pH 2,67) og vaginalvæske simulant (pH 4,2).
Legemiddelfrisetting i vaginalvæske simulatn (pH 4,2) ble bestemt ved hjelp et Transwell oppsett i en 6-brønners plate.
Resultater: Resultatene viser at både lipidkonsentrasjon og type legemiddel kan påvirke partikkelstørrelse og zetapotensial av SLN. Alle SLN-formuleringene hadde en smal
størrelsesdistribusjon og har en god lagringsstabilitet over 15 uker når det gjelder størrelse og størrelsesfordeling, men zetapotensialet endret seg med tiden, spesielt for formulering med klotrimazol, noe som kan bety at legemiddel lekker ut av partiklene. Inkorporeringsgrad for metronidazol ble bestemt til 4 %, mens for klotrimazol ble den bestemt til rundt 50 %. Tilsetting av SLN til filmer utgjør ikke en signifikant forskjell på de fysikalsk-kjemiske egenskaper av filmer, men utfellinger når høyt antall partikler tilsettes viser at det finnes en øvre grense for mye partikler som kan tilsettes. Tilsetting av kryssbindinger gjør at kitosan filmene ikke desintegrer i vandig surt miljø. Men kryssbinding hadde også en negativ påvirkning på filmer, da det gir lavere mekanisk styrke, og reduserer mucoadhesive egenskaper og svellingsgrad, sammenliknet med filmer uten kryssbinder.
Konklusjon: Dette prosjektet viser at kryssbundne kitosanfilmer kombinert med SLN med et antimikrobielt legemiddel har potensial som en mucoadhesiv formulering til vaginal anvendelse. Det er behov for videre optimalisering både av formuleringen og enkelt analysemetoder for at denne tilnærmingen skal kunne anvendes klinisk.
VI
Forord
Denne masteroppgaven ble gjennomført i forskningsgruppen PersDrug ved Farmasøytisk institutt, Universitet i Oslo i perioden august 2020 - mai 2021.
Først og fremst vil jeg takke mine kunnskapsrike veileder professor Ingunn Tho og professor Sverre Arne Sande for alle gode veiledninger gjennom denne perioden. Dere kom alltid med gode forslag når jeg satt fast i oppgaven, og har fulgt meg tett opp hele perioden, noe som jeg setter utrolig stor pris på.
En stor takk til ingeniør Tove Larsen, Bente Breiby og Ivar Grove for alle tekniske støtter og veiledninger i labratoriet. Spesielt takk for Tove som passet godt på meg under labarbeidet.
En spesiell takk til stipendiat Markus Herberg Hovd for den gode hjelpen hver gang når jeg skulle låne ultrasentrifugen fra farmakologi i Gyldas veien.
Det har vært en krevende prosess under masterskrivingen. Heldigvis får jeg mye støtter fra venninner og familien min. Takker til Emily, Iram, Julia og Lin som har holdt kontakt med meg hele perioden, slik at jeg ikke bli ensomt under skrivingen .
VIII
Forkortelser
ANOVA BV Clot DDA DLS HME HL HPLC HSD IQR IUD LL MTZ MWCO PB PBS PDI Ph. Eur RH Rpm RSD SLN SOI
UV-spektroskopi VCF
VFS VVC
Variansanalyse Bakteriell vaginose Klotrimazol
Deacetyleringsgrad Dynamisk lysspredning Smelte-ekstrudering Høy lipidkonsentrasjon Væskekromatografi
Honestly signifikant differances Interkvantil rekkevidde
Intrauterin enhet Lav lipidkonsentrasjon Metronidazol
Molekylvekt cut-off
Fosfatbuffer pH 6,8, dvs. isoton fosfatbuffer Fosfatbuffer saline
Polydispersitetsindeks Den Europeisk Farmakopé Relativ luftfuktighet, % Omdreiningstall
Relativ standard avvik Faste lipid-nanopartikler
Seksuelle overførbare infeksjoner Ultrafiolett-synlig spektroskopi Vaginal prevensjonsfilm Vaginalvæske simulant Vulvovaginal candidasis
X
Innholdsfortegnelse
Sammendrag ... IV Forord ...VII Forkortelser ... IX
1 Innledning ... 1
1.1 Bakgrunn ... 1
1.2 Hensikt ... 2
2 Teori ... 3
2.1 Vaginal anatomi og fysiologi ... 3
2.2 Vaginale infeksjoner ... 5
2.2.1 Bakteriell vaginose ... 5
2.2.2 Vulvovaginal candidainfeksjon ... 6
2.3 Vaginal legemiddelformulering ... 7
2.4 Mucoadhesjon ... 8
2.4.1 Mekanisme og teori ... 8
2.5 Mucoadhesive polymere ... 11
2.5.1 Kitosan ... 11
2.5.2 Kryssbinding av kitosan ... 13
2.5.2.1 Fysikalsk kryssbinding ... 13
2.5.2.2 Kjemisk kryssbinding ... 13
2.6 Mucoadhesive vaginale filmer ... 15
2.6.1 Fremstilling av filmer ... 15
2.7 Karakterisering av mucoadhesive filmer ... 17
2.7.1 Tykkelse og masse ... 17
2.7.2 Mekaniske egenskaper ... 17
2.7.3 Disintegrasjon, svelling og erosjon ... 18
2.7.4 Mucoadhesive egenskap ... 18
2.7.5 Legemiddel frisetting ... 19
2.8 Faste lipid-nanopartikler (SLN) ... 20
2.9 Karakterisering av nanopartikler ... 21
2.10.1 Metronidazol ... 23
2.10.2 Klotrimazol ... 24
3 Materialer, utstyr og metoder ... 26
3.1 Materialer ... 26
3.2 Utstyr ... 27
3.3 Løsninger ... 29
3.5.1 Partikkelstørrelse bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) ... 31
3.5.2 Zetapotensial ... 32
3.5.3 Bestemmelsen av faktisk konsentrasjon av legemiddel ... 33
3.5.4 Innkapslingsgrad ... 33
3.4.4.1 Dialyse metoden: Et forsøk ... 33
3.4.4.2 Ultrasentrifugeringsmetode ... 34
3.5.5 Lagringsstabilitet ... 35
3.6.1 Fremstilling av filmformulering ... 35
3.6.2 Tilsetting av kryssbinding og filmstøping ... 35
3.7 Karakterisering av filmer ... 36
3.7.1 Film tykkelse og masse ... 36
3.7.2 Disintegrering ... 37
3.7.3 Test av mekaniske egenskaper ... 38
3.7.4 In vitro bestemmelse av mucin-interaksjon av filmer ... 40
3.7.5 Svelling og erosjon ... 41
3.7.6 In vitro frisettingsstest ... 42
3.8 Statistisk analyse ... 43
4 Resultater ... 44
4.1 Fremstilling av faste lipid-nanopartikler (SLN) ... 44
4.2 Karakterisering av SLN ... 45
4.2.1 Partikkelstørrelse, størrelsesfordeling og zetapotensial ... 45
4.2.2 Bestemmelsen av faktisk konsentrasjon av legemiddel i SLN-suspensjon ... 48
4.2.3 Innkapslingsgrad ... 48
4.2.3.1 Dialyse metoden: et forsøk ... 48
4.2.3.2 Ultrasentrifugeringsmetode ... 50
4.2.4 Lagringsstabilitet ... 51
4.3 Fremstilling av mucoadhesive filmer ... 53
4.4 Karakterisering av mucoadhesive filmer ... 54
XII
4.4.1 Masse og tykkelse ... 54
4.4.2 Disintegrasjon ... 55
4.4.3 Test av mekaniske egenskaper ... 56
4.4.4 In-vitro mucin interaksjon ... 57
4.4.5 Svelling og erosjon ... 58
4.4.6 In-vitro frisettingshastighet ... 61
5 Diskusjon ... 64
5.1 Fysikalsk-kjemiske egenskaper av SLN ... 64
5.1.1 Innkapslingsgrad ... 65
5.1.2 Lagringsstabilitet av SLN ... 67
5.2.1 Tykkelse og masse ... 68
5.2.2 Mekaniske egenskaper ... 69
5.2.3 Mucoadhesjon ... 70
5.2.4 Svelling og erosjon og disintegrasjon ... 71
5.2.5 Legemiddelfrisetting ... 72
6 Konklusjon ... 74
Litteraturliste ... 76
1 Innledning
1.1 Bakgrunn
Vaginale infeksjoner er anerkjent som et globalt helseproblem som kan ramme kvinner i alle aldre, spesielt kvinner i fertil alder. De mest utbredte vaginale infeksjonene inkluderer bakteriell vaginose, gjærsoppinfeksjon og trikomansinfeksjon [1]. Det er estimert at mer enn 70% av alle kvinner har opplevd vaginale infeksjoner minst en gang i livet og mange får tilbakevendende infeksjoner, noe som legger grunnlag til utvikling av mer effektive legemiddelformuleringer [2, 3]. Lokalbehandling er foretrukket for behandling av vaginale infeksjoner, og det finnes forskjellige legemiddelformer på markedet som kapsler, kremer, oppløsninger, geler og vagitorier. Disse konvensjonelle legemiddelformuler har begrenset effekt på grunn av den selv- rensingsmekanismen av vagina [4]. Denne mekanismen fører til at en mengde av legemiddel vil bli eliminert for rask ved utflod av vaginal væsken. Dermed er det et behov for utvikling av nye legemiddelformer med økt retensjonstid og forlenget frigjøring av legemiddelsubstans på virkningsstedet som er egnet for lokal vaginal administrasjon.
Mucoadhesive filmformuleringer har i de siste årene vært interessante som en ny strategi for administrering av legemidler ved hjelp av kroppens slimhinner [5]. Egenskaper som mucoadhesjon og kontrollert frisetting gjør at mucoadhesive filmer kan være en måte å forbedre farmakokinetikken til legemidler på. I tillegg vil slike filmformuleringer kunne øke etterlevelse hos pasienter ved å redusere doseringsfrekvens og tilby enkel administrasjon. Mange forskjellige polymer har blitt undersøkt for utvikling av mucoadhesive filmer, blant annet pektin og kitosan [6]. Kitosan er et naturlig polysakkarid som har vært en av de mest undersøkte polymerene, og egenskaper som lav toksisitet, biokompatibilitet og mucoadhesive egenskaper gjør at kitosan er godt egnet for bruk i legemiddelformuleringer [7]. En annen viktig egenskap til kitosan er at det virker antimikrobielt [8], noe som er en fordel når man skal utvikle en legemiddelformulering for behandling av vaginale infeksjoner. Filmer basert på kitosan er imidlertid kjent å løse seg raskt i et surt miljø, noe som er relevant for bruk i vagina.
Nanotpartikulære systemer har vist seg å være gunstige legemiddelbærere for å forbedre terapeutisk effekt, og har til hensikt å overkomme begrensninger assosiert med de
2
konvensjonelle legemiddelformene. Faste lipid-nanopartikler (SLN) er lipoid-basert nanopartikler med en lipidmatriks som er fast ved kroppstemperatur [9]. Lipidkjernen av SLN kan øke løselighet av hydrofobe legemidler og redusere mobiliteten av legemiddel, noe som kan gi kontrollert frigjøring av legemidlet [10]. For å hindre aggregering i vandig miljø stabiliseres lipidpartiklene med en surfaktant [11]. Inkorporering av SLN i mucoadhesive filmer dermed gir en formulering som er forventet til å øke løselighet av legemiddel, tilby kontrollert frisetting av legemiddel samt øke oppholdstid av legemiddel i kontakt med vaginaslimhinnen.
Slike formuleringer har et potensiale til å forbedre behandling av vaginale infeksjoner.
1.2 Hensikt
Hensikten med denne oppgaven er å utvikle en ny vaginal legemiddelformulering basert på mucoadhesive filmer fremstilt fra kitosan i kombinasjon med SLN. Hovedmålet er å lage en mucoadhesiv formulering som er egnet for lokalbehandling av vaginale infeksjoner. SLN har til hensikt å øke løseligheten til legemiddelsubstansen samt å kontrollere frigjøring av legemidlet. De to legemidlene metronidazol og klotrimazol er valgt som modellsubstanser, og SLN fremstilt med to legemidlene samt placebo partikler er inkorporert i kitosanfilmer. For å forsinke desintegrasjonen av filmmatriksen studeres filmer fra kitosan kryssbundet med glyseraldehyd, og sammenlignes med ikke-kryssbundet kitosan. For inkorporering i filmer, karakteriseres SLN i forhold til partikkelstørrelse, størrelsesfordeling, zetapotensial, innkapslingsgrad og lagrinsstabilitet. Filmformuleringene karakteriseres med hensyn til tykkelse og masse, mekaniske egenskaper, svelling og erosjon, mucoadhesjon i form av in-vitro mucin-interaksjon og legemiddelfrisetting fra filmer, for å vurdere deres egnethet som vaginal legemiddelform.
2 Teori
2.1 Vaginal anatomi og fysiologi
Vagina er en fibromuskulær kanal som strekker seg fra den spalteformede skjedeforgården til livmorhalsen [12]. Vagina epitel består av fire forskjellige typer cellelag: stratifisert plateepitellag, bindevevslaget lamina propria, muskulært lag og adventita (figur 1) [12, 13].
Stratifisert plateepitel er det øverste laget og bidrar til endring av overflatearealet til vaginal kanalen. Epitelet kan blant annet endre strukturen sin under tilstedeværelse av østrogen, noe som vil danne foldede eller rugea struktur og dermed øke overflatearealet til vagina. Dette kan bidra til en økt legemiddelabsorpsjon [1, 12, 14]. Under det stratifiserte plateepitellaget befinner lamina propria seg, som er et tynt og løst bindevevslag. Under lamina propria befinner et muskulært lag seg som består av glattmuskulatur, som har ansvar for den store strekkingskapasiteten som vaginal kanalen har som fødselskanal [1]. Deretter kommer muskulatur er deretter omgitt av et lag med kollagen, elastin og fett som inneholder lymfatiske, nerve- og blodårer, dette laget kalles adventitia [1]. Det finnes en rekke faktorer som kan påvirke tykkelsen av vaginal epitelet, blant annet alder og hormonregulering [15].
Figur 1: En illustrasjon vaginal epitelet som består av fire typer celle lag: Stratifisert plateepitel
(Epithelial layer i figuren), Lamina popria som er et bindevevslag, et muskulært lag (Lamina Mucuscularis) og adventita. Figuren er utarbeidet av [16].
Vagina er et organ som skiller ut en blanding av væsker, kalt vaginal væske eller vaginal utflod, selv om den ikke har noen sekretoriske kjertler [13]. Væsken er produsert av vaginale celler, livmorceller og cervikale celler, og inneholder en blanding av enzymer, proteiner, elektrolytter, karbohydrater og aminosyrer, i tillegg til cervikalt mucus [1, 12, 17]. Kvinner i fertil alder
4
produserer vaginal væske med en hastighet på rundt 3-4 g/4 timer, mens postmenopause reduseres væskevolum, ofte til et halvert volum [13].
Vaginal epitel er dekket med et viskoelastisk mucus-lag som består av opptil 95 % vann, og forskjellige uorganiske salter, karbohydrater, lipider og glykoproteiner [13]. Vaginal mucus er hovedsakelig produsert av cervikale epitelceller, som migrerer fra cervikal kanalen til vaginal kanalen [18]. Mucus-laget er viktig for å beskytte vagina fra infeksjoner ved å fange opp og fjerne de uønskede patogener og fremmede partikler [13]. Mucus er også viktig for biologiske funksjoner av vagina, for eksempel virke mucus som et smøremiddel i vaginal kanalen under samleie [18]. Viskositeten av mucus endres under påvirkning av hormonregulering i menstruasjonssyklus. Et økt østrogennivå vil føre til at mucus blir tynnere, som eksempel rundt eggløsning. Et redusert østrogennivå vil derimot føre til at mucus blir tykkere [19].
En normal vaginal mikroflora inneholder forskjellige mikroorganismer, særlig lactobacillus bakterier som er den med høyest forekomst [15]. Lactobacillus er en gunstig bakterie som hemmer vekst av potensielle patogener ved å opprettholde det sure vaginalt miljøet [13]. En vanlig vaginal pH ligger på omtrent 3,5-4,5, og opprettholdes av lactobaccillus ved at de konverterer glykogen fra epitelceller til melkesyre [13, 15]. En økt pH-verdi i vagina som et resultat av reduksjon i mengde lactobaccillus kan oppstå ved infeksjoner som for eksempel vulvovaginal candidiasis og bakteriell vaginose [13]. Derfor kan en økt vaginal pH i noen tilfeller indikere en infeksjonstilstand. Andre faktorer som alder, menstruasjonssyklus og bruk av legemiddel kan også påvirke den vaginale pH. For eksempel vil både alder og menstruasjonssyklus påvirker østrogennivå. Østrogen induserer produksjon av glykogen i epitelceller [20]. Et redusert østrogennivå hos postmenopause kvinner har dermed en høyere pH på 6-7 sammenliknet med premenopause kvinner [13]. Legemiddel som antibiotika kan også påvirke lactobacillus og fører til økning i pH. Faktorer som pH endringer, alder, menstruasjonssyklisk forandring spiller derfor en rolle for stabilitet og effekt av legemiddelformuleringer og bør dermed tas i betraktning under utvikling av vaginal legemiddelformulering.
2.2 Vaginale infeksjoner
Studier har estimert at mer enn 70 % av alle kvinner har opplevd vaginale infeksjoner minst en gang i livet, og stadig bruker vaginale produkter for å behandle infeksjonene [2, 3]. De mest utbredte vaginale plagene inkluderer bakteriell vaginose, gjærsoppinfeksjon (candidainfeksjon) og trikomansinfeksjon [1]. Opphavet til disse infeksjonene kommer av at en eller flere mikrober blir dominerende i det vaginale miljøet, noe som fører til ubalanse i den normale mikrobefloraen i skjeden [1].
Mange kvinner opplever residiverende infeksjoner, noe som kan skyldes resistensutvikling hos patogener og manglende effekt av legemiddel [21]. Den selv-rensningsmekanismen av vagina vil bidra til å rense bort en del legemiddel, og dersom det skjer for rask vil det bidra til en terapisvikt. I tillegg har mange kvinner en dårlig etterlevelse for eksempel på grunn av uønsket bivirkninger og ubehagelige følelser ved bruk av legemiddelformene [22], som gjør at de ikke fullfører behandlingen. Dårlig etterlevelse av behandling kan føre til økt resistensutvikling og ufullstendig behandling som igjen kan føre til infeksjonen kommer tilbake.
2.2.1 Bakteriell vaginose
Bakteriell vaginose (BV) er en gynekologisk tilstand der normale Lactobacillus i vagina blir erstattet av en blanding av anaerobe bakterier som for eksempel Gardnerella vaginalis, Prevotella vaginae og Atopobium vaginae [23]. Denne unormale tilstanden har en høy prevalens som ligger på rundt 29 % globalt [24, 25], og blant kvinnene med BV kan 67% få et tilbakefall av infeksjonen innen en måned [24]. Risikofaktorer for BV inkluderer seksuell aktivitet, dårlig hygiene, bruk av feil rengjøringsprodukter til skjeden, røking, menstruasjon, intrauterin enhet (IUD) til prevensjon, og legemiddelbruk [23, 24].
Bakteriell vaginose kan være både symptomatisk og asymptomatisk, og er som regel en ufarlig sykdom. Men tilstanden kan bidra til en økt infeksjonsrisiko for andre seksuelle overførbare infeksjoner (SOI) [23]. Slike SOI med BV som risikofaktor inkluderer herpes simplex virus 1 og 2 [26, 27], trikomaninfeksjoner, Nesseria gonorrhoeae og chlamydia trachomatis [28, 29].
I tillegg er BV også assosiert med overføring av humant immunsviktvirus (HIV) [30, 31].
6
Derfor er det nødvendig å behandle bakteriell vaginose selv om man ikke har symptomer.
Behandlingsalternativer for BV innebærer en antibiotikakur med enten metronidazol, klindamycin, nitroimidazol, secnidazol eller tinidazol [24]. Det finnes legemiddelformer på markedet både til systemisk og lokalt bruk. Lokalbehandlinger er foretrukket på grunn av direkte levering av legemiddel på virkningsstedet gir mindre systemiske bivirkninger [23].
Lokale legemiddelformuleringer er i tillegg er mer effektive enn systematisk formuleringer, det vil si at den ønsket terapeutiske effekten kan oppnås ved lavere dosen. Likevel finnes det en del begrensninger som er knyttet til de tradisjonelle legemiddelformuleringene som vil bli diskutert senere i kapittelet.
2.2.2 Vulvovaginal candidainfeksjon
Vulvovaginal candidasis (VVC) er en vaginal infeksjon som er kjennetegnet med inflammatoriske endringer i vagina og vulvaepitel. Infeksjonen er forårsaket av en unormal vekst av Candida-arter, særlig Candida albicans og er ansett som den nest mest utbredte vaginale infeksjonen etter bakteriell vaginose [32, 33]. Opptil 75% av alle kvinner vil oppleve vulvovaginal candidainfeksjoner en gang i løpet av livet, og 6-9 % vil få tilbakevendende plager [34, 35]. Behandlingsalternativer for VVC innebærer bruk av soppdrepende legemidler som azoler (deriblant klotrimazol), polyener og echinocandins i form av orale eller vaginale doseringsformer [32, 36]. Både oral- og lokal behandling gir lik god behandlingseffekt. Likevel er lokalbehandling et foretrukket alternativ. En kan unngå ulike systemiske bivirkninger azoler, som for eksempel gastrointestinale bivirkninger, utslett, hodepine og svimmelhet [37]. Videre har azoler også dårlig løselighet, som eksempel klotrimazol og miconazol, noe som bidrar til at det kreves høyere doser per tablett for orale formuleringer. Dette kan også potensielt øke faren for bivirkninger og begrense dermed bruk av oral behandling med azoler [37]. Derfor vil det være fordelaktig å utvikle nye lokale legemiddelformuleringer som eksempel film for behandling av VVC.
2.3 Vaginal legemiddelformulering
Vagina har i flere tiår blitt studert som en gunstig administrasjonsvei for både lokal og systemisk levering av legemidler, spesielt for kvinne-relaterte tilstander [4]. Lokalbehandling er foretrukket for behandling av vaginale infeksjoner på grunn av de fordelene som er nevnt i avsnittene over. Likevel finnes det en del begrensninger for bruk av vagina som administrasjonsvei. En av de viktigste begrensningene er selv-rensningsmekanismen av vagina.
Utskillelse av vaginal utflod kan rense bort legemidler på samme måte som den vil rense bort andre fremmede partikler. Dette bidrar til en redusert oppholdstid av legemiddel på virkningsstedet, og dermed reduserer effekten av legemidlet [4]. Andre faktorer som ubehagelig innsetting av legemiddelformer, personal hygiene, menstruasjonssyklus, samleie og graviditet kan også begrense bruk av vagina som en administrasjonsvei [38].
På markedet finnes det flere konvensjonelle legemidelformer for lokalbehandling av vaginale infeksjonene, som kapsler, kremer, oppløsninger, geler og vagitorier. Disse legemiddelformene har ofte begrenset effekt på grunn av den selv-rensingsmekanismen av vagina som er nevnt i avsnittet over. Nye legemiddelformuleringer som mucoadhesive formuleringer er derfor utviklet for å overkomme utfordringer til de konvensjonelle formuleringene [36].
Bio/mucoadhesive vaginale formuleringer vil sørge for økt oppholdstid i kontakt med vaginaslimhinnen ved å interagere med mucin i mucus, og dermed forlenger legemiddelfrigjøring på virkningsstedet og øker terapeutisk effekt [4].
8
2.4 Mucoadhesjon
Bioadhesjon kan defineres som en tilstand hvor to materialer adherer til hverandre i en lengre periode ved hjelp av intermolekylære interaksjoner, og der et av materialene er biologisk. I tilfeller hvor det biologiske materialet er mucus (slim), eller en slimhinne (mucosa), kalles denne tilstanden som mucoadhesjon [6, 39].
Mucoadhesjon involverer to trinn: en kontaktfase og en konsolideringsfase [39-41]. I kontaktfasen vil en intim kontakt oppstå mellom legemiddelformulering og slimhinne. Mucus- gel-laget vil bli dehydrert samtidig som legemiddelformulering blir fuktet og sveller. Deretter følger det med en gjennomtrengning av polymerkjeder inn i mucus og vice versa [40, 41]. I konsolideringsfasen oppstår varierende fysikalsk-kjemiske interaksjoner som opprettholder binding mellom legemiddelformulering og mucus-lag, noe som resulterer i økt oppholdstid på slimhinnen. I denne fasen vil den mucoadhesive styrken bestemmes av polymeren i formuleringen, hvilke bindinger som kan dannes (f.eks. hydrogenbindinger, elektrostatiske interaksjoner; se mer under) og hvilken hydreringsgrad legemiddelformuleringen har ved kontakt med mucus-gel-laget [40].
2.4.1 Mekanisme og teori
Det er gjerne hydrofile makromolekyler eller hydrofile polymerer som viser sterk mucoadhesjon. Adhesjon oppstår mellom funksjonelle grupper hos polymer og glykoproteinet mucin i mucu [42]. Mucin er den viktigste komponenten i mucus og er ansvarlig for den geleaktig-konsistensen av mucus. Selv spiller mucin en sentral rolle i mucoadhesjon [43].
Mucin har en molekylvekt fra 0,5-20 MDa og består av en proteinkjede forgreinet med oligosakkarider via O-glykosidbindinger [44]. Proteinkjeden består hovedsakelig av aminosyrene serin, threonin og prolin, og oligosakkaridene er bundet til hydroksyl sidekjeder av serin og threonin. Oligosakkarider kjedene har en forgrenet struktur, og består hovedsakelig av N-acetylgalaktosamin, N-acetylglukosamin, fruktose, galaktose og sialinsyre samt små mengder av mannose og sulfat. Hver oligosakkarider kjede inneholder 5-20 karbohydratenheter og til sammen utgjør de ca. 80% av molekylvekten til mucin [44]. Denne høye glykosyleringsgraden av mucin gjør at de kan motvirke proteolyse [43]. Oligosakkarider kjeder
ender ofte med sialinsyre som har en pKa 2,6, noe som gjør at mucin har en negativ ladning ved fysiologisk pH [43]. Strukturen av mucin vises i figur 2:
Figur 2: Struktur av mucin, hvor en proteinkjede er forgrenet med oligosakkardier via O- glykosidbindinger [45].
Mange intermolekylære krefter er involvert i mucoadhesjon, og seks generelle teorier for mucoadhesjon er beskrevet, som vist i figur 3 [41].
Figur 3: Seks generelle teorier for mucoadhesjon [41].
10
1. Fukteteorien brukes hovedsakelig for flytende eller lavviskøse mucoadhesive formuleringer, og baserer seg på evnen til en mucoadhesive polymer til å spre seg (sprebarhet). Affiniteten eller adhesjonen bestemmes av kontaktvinkelen mellom formuleringen og overflaten til slimhinnen, og baserer seg på prinsippet om at jo mindre kontaktvinkel desto høyere adhesjon [6, 41].
2. Diffusjonsteorien innebærer at det vil dannes et tredimensjonalt nettverk mellom mucin og polymerkjeder som har diffundert inn i det mucus-laget. Diffusjonsprosessen for polymerkjedene er tidsavhengig og vil bli påvirket av molekylvekt, mobilitet av polymer, kryssbindingsgrad av polymer og temperatur som en viktig miljøfaktor [6].
3. I kohesjonsteori er adhesive egenskaper presentert som en kohesjonskraft. Det er den kraften som trengs for å dissosiere legemiddelformulering fra slimhinnen.
Kohesjonskraften øker med økende lengde av polymer i polymernettverket, eventuelt med redusert antall kryssbindinger i systemet [6, 41].
4. Den mekaniske teorien antar at adhesjon oppstår ved at flytende mucus fyller opp små rom på en grov overflate, og resulterer i en sammenslåing av systemene. Grove overflater gir også et økt overflateareal som er tilgjengelig for interaksjon [39, 41].
5. Den elektroniske teorien tar utgangspunktet i at forskjellige overflater har forskjellige elektronstruktur. Forskjell i elektronstruktur fører til overføring av elektron og dannelse av et elektrisk dobbelt lag ved grensesnitt, som danner tiltrekkende krefter [6, 39].
6. Adsorpsjonsteori beskriver at adhesjon er basert på hydrogen binding og Van-der- Waal´s krefter [6, 39].
2.5 Mucoadhesive polymere
Mucoadhesive polymere kan klassifiseres etter naturlig eller syntetisk opprinnelse av polymer, overflateladning, løselighet og deres mekanisme til mucoadhesjon [41]. Både struktur og funksjonelle grupper til polymere kan ha effekt på styrken av mucoadhesjon, og kan påvirke andre egenskaper til legemiddelformuleringer [46]. Flere faktorer til polymere bør derfor tas i betraktning når man skal utvikle en mucoadhesiv formulering.
Polymere bør ha en høy viskositet og høy molekylvekt for å øke grad av interpenetrering med mucin. Kryssbinding kan redusere mobilitet av polymerkjeder og dermed redusere penetreringsgrad i mucus [46, 47]. Mucoadhesive polymere deles etter overflateladning inn i anionisk, kationisk og ikke-ionisk system. En kationisk overflateladning kan signifikant øke mucoadhesive egenskaper til polymer ved å danne sterke ionebindinger med det negative ladet mucin, og bør dermed foretrekkes under fremstilling av mucoadhesive formuleringer [6, 47].
Tilstedeværelsen av funksjonelle grupper som karboksyl (-COOH), hydroksyl (-OH), ami- grupper (-NH2) og sulfat grupper (-SO4H) viser god evne til å danne hydrogenbindinger mellom polymer og mucin. Polymer med disse funksjonelle gruppene er derfor også foretrukket ved produksjon av legemiddelformulering [46]. Andre faktorer som konsentrasjon, hydrering av polymer og pH til polymeren kan også bidra til å styrke mucoadhesjon [6, 46].
2.5.1 Kitosan
Kitosan er et lineært polysakkarid som består av tilfeldig distribuert β-(1,3)–bundet-D- glukosamin og N-acetyl-D glukosamin-enheter, hvor mengde av D-glukosamin er større enn 50% [48, 49]. Kitosan er hovedsakelig fremstilt ved partiell deacetylering av kitin ved bruk av alkalisk hydrolyse eller enzymatisk metode (figur 4). Deacetyleringsprosessen fører til dannelsen av frie amin-grupper, noe som bestemmer fysikalsk-kjemiske og biologiske egenskaper til kitosan [50].
12
Figur 4: Struktur av kitin og kitosan [7]
Kitosan har mange gode egenskaper som inkluderer blant annet at det er biokompatibilitet, biodegraderbar, ikke-toksisk, lav immunogen og utøver en antimikrobiell effekt som virker fordelaktig for behandling av vaginale infeksjoner [7, 51]. Kitosan har en toksisk effekt på varierende bakterier, sopp og parasitter, og er ikke menneskeskadelig [8]. Flere studier rapporterer i tillegg at kitosan har evne til å åpne epitel tight junctions, noe som kan øke permeabiliteten gjennom epitelmembranen [48, 52]. På bakgrunn av disse egenskapene fungerer kitosan som et godt og mye brukt hjelpestoff i legemiddelformulering. Polymeren er mye brukt i kombinasjon i nanosystem, enten i form av overflatemodifisering eller ved å danne legemiddelformulering som inkorporerer nanosystem, for eksempel hydrogeler [53, 54].
Den mucoadhesive egenskapen til kitosan skyldes strukturen. Kitosan er en svak base med pKa rundt 6,5, noe som gjør polymeren løselig i et vandig surt miljø [51]. Løselighet av kitosan og viskositet av kitosanløsning er avhengig av graden av deacetylering (DDA) og molekylvekten til kitosan [53]. Funksjonelle grupper til kitosan spiller en viktig rolle i mucoadhesjon. For eksempel kan hydroksyl-grupper danne hydrogenbindinger med mucin og aminogrupper kan danne ionisk bindinger med mucin [55]. Ved å modifisere faktorer under fremstillingsprosessen kan man kontrollere molekylvekt og DDA til kitosan, og dermed oppnå egenskapene til et spesifikt ønsket produkt.
2.5.2 Kryssbinding av kitosan
For at kitosan-baserte formuleringer skal brukes i klinisk anvendelser må de være biokompatible og blant annet ha gunstig mekaniske egenskaper [56]. En begrensning for bruk av kitsoanfilmer er at de er ustabile i et vandig surt miljø. For å øke mekanisk- og struktur stabilitet kan man derfor tilsette en naturlig eller syntetisk kryssbinder for å danne kryssbinding mellom polymerkjeder [56, 57]. Kryssbinding er definert som induksjon av kjemiske- eller fysikalske bindinger som binder sammen funksjonelle grupper av polymerer [58]. Det er en metode som ble mye brukt til å modifisere egenskaper som mekanisk styrke, kjemisk stabilitet, svelling og legemiddelfrigjøring av legemiddelformulering [59].
2.5.2.1 Fysikalsk kryssbinding
Fysikalske kryssbinding er dannelse av ikke-permanente bindinger mellom polymerkjeder gjennom intermolekylære bindinger, som for eksempel ionebindinger og hydrogenbindinger.
Disse intermolekylære kryssbindinger er reversible bindinger som danner et ikke-permanent polymernettverk [48]. Dette gjør at fysikalske bindinger gir mindre mekanisk- og struktur stabilitet sammenliknet med kjemiske bindinger. Til tross for svakere bindinger, kan fysikalske kryssbinding gir bedre sikkerhet enn kjemiske bindinger. Fordi fysikalske kryssbinder er generelle mindre toksisk enn kjemiske kryssbindere [58]. En annen viktig egenskap av fysikalsk kryssbinding er at ionebindinger kan være pH sensitiv, noe som kan gi en pH-avhengig svellingsprofil av legemiddelformulering [48]. Eksempler av fysikalske kryssbinder kan være Ca2+, Ba2+ som ble mye brukt til å kryssbinde alginater formuleringer [60, 61].
2.5.2.2 Kjemisk kryssbinding
Kjemisk kryssbinding er dannelse av kovalente bindinger mellom funksjonelle grupper i polymerkjeder og kryssbinder, slik at det dannes et tredimensjonal polymernettverkt [48, 58].
Kovalente bindinger er irreversible bindinger [62]. Dette har vist seg å være gunstig for å øke mekanisk- og struktur stabilitet av kitosan-formuleringer, slik at kryssbundet kitosan forblir stabil selv i et veldig surt miljø (pH 1) [62]. Til trosse for dannelse av permanente bindinger, er bruk av kjemisk kryssbinder begrenset på grunn av celletoksisitet til kjemiske kryssbindere, som eksempel glutaraldehyd [62]. Det er derfor nødvendig å finne ikke-toksiske kjemisk
14
kryssbindere. Andre eksempler av kjemiske kryssbinder er formaldehyd, glyseraldehyd og vanillin [59].
For kitosan-formuleringer ble glutaraldehyd som er en kjemisk kryssbinder mye bruk. Men på grunn av toksisitet av glutaraldehyd ble glyseraldehyd valgt som en ikke-toksisk erstatning i et tidligere masterprosjekt [63]. Glyseraldehyd kan på samme måte som glutaraldehyd danne kovalente bindinger med frie aminogrupper, noe som antagelig er mekanismen bak kryssbindingsreaksjon med kitosan [64]. Figur 5 viser reaksjonsmekanismen av kryssbinding mellom glyseraldehyd og et molekyl som inneholder frie aminogrupper. Lysin er brukt som et eksempel i figuren 5.
Figur 5: Reaksjonsmekanismen av kryssbinding mellom glyseraldehyd og et molekyl som inneholder frie aminogrupper. Lysin er brukt som et eksempel i figuren. Mekanismen er utarbeidet av [64].
2.6 Mucoadhesive vaginale filmer
Mucoadhesive filmer har i de siste årene vært interessante som en gunstig legemiddelformulering til lokal administrasjon [5]. De er definert som mucoadhesive preparater som inneholde et eller flere aktive substanser ment for absorpsjon gjennom slimhinne over en lengre tidsperiode ifølge den Europeisk Farmakopé [65]. Til vaginal bruk har mange forskjellige filmsammensetninger bltt studert, og kitosan basert filmer er blant en av de mest populære sammensetningene [66-68]. Sammenliknet med andre konvensjonelle legemiddelformuleringer er filmformuleringer mer fleksible enn tabletter og vagitorier. Noe som kan øke pasient etterlevelse [36, 40]. På markedet finnes vaginal filmer som virker som prevensjonsmidler (Vaginal contraceptive film) (VCF®) [69, 70]. Disse filmene løser seg raskt i vagina og har i tillegg en rengjørende og smørende funksjon til vagina [70].
2.6.1 Fremstilling av filmer
Forskjellige typer fremstillingsmetoder kan brukes til fremstilling av mucoadhesive filmer.
Ofte fremstilles en større film som kuttes opp i enkeltdoser som siste ledd av produksjonen. To av de mest brukte fremstillingsmetodene, filmstøpingsmetode og smelte-ekstrudering, er beskrevet i dette kapitlet. I dette prosjektet ble filmstøpingsmetoden brukt til filmfremstilling.
Støping av flytende filmdispersjon er den mest brukte fremstillingsmetoden for filmproduksjon.
Denne metoden er både enkel å bruke og har lav produksjonskostnad når det gjelder produksjon i liten skala [40]. Prinsippet bak metoden går ut på å lage en film dispersjon som skal stå stille og tørkes. Film dispersjonen består av en polymerløsning og kan inneholde andre hjelpestoffer som mykgjørende middel, fyllmaterialer, penetreringsforsterker og kryssbinder [40].
Ferdiglaget filmdispersjonen støpes vanligvis på et støpning-apparat [71], men den kan også helles over i en form, eksempel petriskål, og settes på en flat overflate til tørking (figur 6) [40, 72] . De reologiske egenskapene til film dispersjon vil avgjøre tørkehastighet og jevn fordeling av legemiddel utover filmarealet. Luftbobler som ble introdusert i løsningen under omrøring av filmdispersjon kan resultere i ujevnhet i tykkelse og overflate til det endelige produktet, og bør derfor fjernes før støping [40].
16
Figur 6: Skjematisk oversikt over filmstøpingsmetode [73].
Smelte-ekstrudering (HME) er en annen konvensjonell metode som fremstiller filmer uten å bruke løsemiddel. I denne metoden blir innholstoffene smeltet og ekstrudert gjennom en definert åpning som former materialet for eksempel til en tynn film [74, 75]. Under prosessen blir smeltet innholdsstoffene blandet og homogenisert ved hjelp av en roterende skrue [76].
Etter at filmen er ekstrudert gjennom den definerte åpningen blir filmen kjølt ned ved hjelp av en kjøleruller og samlet opp av en rulle som tar opp filmen (figur 7) [76, 77]. HME har fordeler over filmstøpingsmetode som blant annet kan unngå bruk av løsemiddel, noe som er egnet for legemiddel som har dårlig vannløselighet. I tillegg tilby et mer stabilt fremstillingsmiljø. Slik at problem som dannelse av luftbobler og luftstrøm under tørking kan unngås [78].
Figur 7: Skjematisk oversikt over smelte-ekstrudering av film [76].
2.7 Karakterisering av mucoadhesive filmer
2.7.1 Tykkelse og masse
En av de kritiske egenskapene til filmformulering er homogen fordeling av komponenter i hver enkelt filmenhet eller enkeltdose [40]. Dette sier noen om reproduserbarhet av fremstillingsprosess og har betydning for legemiddeldosering [79]. I forskningsartikler har massevariasjon av filmbiter har ofte blitt brukt som et mål for å si noe om homogenitet, sammen med tykkelsen som også sier noe om jevnhet av komponentdistribusjon over hele filmarealet.
2.7.2 Mekaniske egenskaper
Mekanisk styrke og fleksibilitet er noen av de viktige egenskaper for håndtering av filmer. En ideell filmformulering skal være noe fleksibel, elastisk og holde sin form intakt under pakking, transport og håndtering [74]. Den bør hverken være klissete eller sprø. Det finnes imidlertid ingen fasit på hva som regnes som en tilstrekkelig mekanisk styrke, men basert på spesifikke egenskaper til filmer kan man gjøre en vurdering på hver enkel formulering. De spesifikke egenskapene som har blitt studert inkluderer strekkstyrke, relativ forlengelse av film til brudd, og Young´s modul [40, 74]. Strekkfastheten til en film er definert som materialets evne til å motvirke en kraft som skal rive filmen i stykker. Dette kan testes i en strekk test eller en punkteringstest. Fleksibilitet kan bestemmes som forlengelse av film til brudd og er et mål for maksimal deformasjon av film før filmen gikk i stykker. Young´s modul er en evaluering av stivheten eller hvordan filmen deformeres i det elastiske området [40, 80]. En myk og svak polymer har gjerne en lav strekkfasthet, lav Young´s modul og lav relativ forlengelse til brudd.
Mens en myk og sterk polymer har en moderat strekkfasthet, lav Young´s og høy relativ forlengelse til brudd [40, 81]. En studie har rapportert mekanisk styrke av markedsførte vaginale filmer (VCR®) med en strekkstyrke på 13,7-21,6 N/mm2 (1400-2200 g/mm2) [69].
18
2.7.3 Disintegrasjon, svelling og erosjon
Når en hydrofil film kommer i kontakt med vandig medium vil den begynne å svelle.
Disintegrasjon sier noe om filmens integritet i vandig medium, for eksempel i vaginal væske, over en tidsperiode [82]. En rask disintegrasjon innebærer at filmen faller fra hverandre og er uønsket med tanke på at den ikke vil få nok tid til å feste på slimhinnen og øke kontakttiden for legemidlet på virkningsstedet.
Filmens kapasitet til å ta opp vann og svelle er en kritisk faktor for filmens mucoadhesive segenskaper, hvor svellet polymer bidrar til å danne et miljø der binding til mucin lettere oppstår [47, 83]. Svellingsgraden til en film er avhengig av polymerens type og konsentrasjon, ionestyrke, og mengde vann som er til stedet. Dersom polymeren er pH sensitiv, så vil pH i mediet sammenliknet med polymerens pKa-verdi også ha betydning. Jo høyere grad av hydrofilisitet en polymer har, desto høyere svellingsgrad [84]. For lite mengde av vann i mucus kan redusere svellingsgrad og gir dermed utilstrekkelig adhesjon til mucin, mens overhydrering av filmen kan også resultere i en våt-og-glatt slimhinne som svekker mucoadhesjonen [58].
Filmer som ikke disintegrerer vil likevel kunne eroderes over tid. En erosjonsprofil til mucoadhesive filmer kan si noe om hvordan filmer oppløses gradvis og frigjør legemiddel i det aktuelle mediet. En rask erosjon kan føre til en initial burst frigjøring av legemiddel, noe som kan være både fordelaktig og problematisk. En initial burst frigjøring kan bidra til en raskere terapeutisk effekt, men kan også være uønsket dersom frigjøringsprofilen av legemiddel skal være langsom [85].
2.7.4 Mucoadhesive egenskap
Mucoadhesive egenskap er som nevnt tidligere en kritisk egenskap til filmformuleringer som skal klistre seg fast på slimhinnen, og bestemmelsen av slike egenskaper står sentralt i dette prosjektet. Forskjellige metoder er beskrevet i litteraturen for å bestemme mucoadhesive egenskaper, og vurderingen kan gjøres basert på ulike parametere [40]. Noen metoder fokuserer på bestemmelse av tiden for adhesjon og/eller retensjonstid av formuleringer, og andre metoder fokuserer på måling av adhesjonskrefter til filmen [72, 86, 87]. Mangel på en standardisert
metode for å evaluere mucoadhesjon er en stor utfordring som gjør det vanskelig å sammenlikne de forskjellige studiene [40, 72]. En annen utfordring er dårlig in vitro-in vivo korrelasjon mellom de metodene som er beskrevet [72]. Selv om dyreforsøk er rapportert, er det vanskelig å gjenskape det humane mucusale miljøet uten å gjøre kliniske studier [72].
Mange metoder presentert i litteratur for bestemmelsen av mucoadhesjon bruker enten strekkstyrke test eller skjærstyrke test [5]. Metoder som bruker strekkstyrke test måler maksimal kraft som trengs for å separere formuleringer fra overflaten av substrater til instrumentet etter en viss kontakttid [5, 88]. Mens under skjærstyrke test blir krefter påført for å bryte bindinger mellom overflatene reorientert slik at kraft virker langs koblingsgrensesnitt [88, 89].
2.7.5 Legemiddel frisetting
Konvensjonelle frisettingstester for fast doseringsformer er mindre egnet for filmformuleringer, da plassering av filmer uten noe holdeutstyr som holder filmer på plass kan føre til dårlig reproduserbarhet av resultater [72]. Som en løsning kan eksisterende metoder tilpasses for å undersøke frigjøringshastighet av legemiddel. For eksempel kan filmer adheres til bestemt plass på frisettingskaret ved hjelp av et lim-middel for å få til reproduserbare resultater. Modifisert paddle apparatet ble mye brukt til å teste legemiddelfrigjøring av filmer. Andre modifiseringer kan være volumreduksjon av oppløsningsmedium, bytte ut omrøringstilbehør med tilpasset element, type av medium som skal etterlikne det biologiske miljøet på administrasjonsstedet, og tilpasse temperatur og andre miljøfaktor [72, 74]. Bruk av diffusjonsceller, for eksempel Franz diffusjonsceller, med eller uten cellekultur ble også mye brukt til å undersøke frisetting og permeabilitet av legemidler fra en filmmatriks. I slike celler er donor kammer separert fra akseptor kammer ved en membran (kunstig membran, vev eller cellemonolag) som virker som en epitelmodel [40].
20
2.8 Faste lipid-nanopartikler (SLN)
SLN er lipid-baserte kolloidale partikler med en lipid matriks som er fast ved kroppstemperatur og stabilisert av surfaktanter [9]. Dette nanosystemet er ansett som en lovende legemiddelbærer på grunn av sin enkelthet og allsidighet [9]. Med sin lipidkjernen er SLN et gunstig verktøy som bærer av lipofile legemiddelsubstanser som ellers er vanskelig å levere ved bruk av konvensjonelle legemiddelformuleringer [10]. Legemiddel i lipidkjernen har mindre mobilitet sammenliknet med legemiddel i flytende olje dråper. Dette har fordel som kan hindre legemiddel-lekkasje og gi kontrollert frigjøring av legemiddel [9]. SLN har i tillegg en fordel ved at de kan beskytte legemidler fra degradering i biologiske væske [9, 10].
SLN kan fremstilles ved hjelp av forskjellige fremstillingsteknologier. Høytrykk homogenisering er blant den mest brukte og veletablerte metodene [9]. Metoden innebærer å dispergere en smeltet lipidfase i en surfaktant-holdig vandigfase. Den vandige fasen kan enten varmes opp til samme temperatur som lipidfasen (varm homogenisering) eller ha lavere temperatur enn smeltepunktet (kald homogenisering), etterfulgt med høytrykk homogenisering og rask nedkjøling av suspensjon [9, 90]. En annen metode som er mye brukt er mikroemulsjons metoder, der en varm mikroemulsjon blir fremstilt og består av en smeltet lipidfase og en varm vannfase. Mikroemulsjonen dispergeres deretter i kaldt vann (2-4oC) under omrøring for å danne SLN [9]. Andre metoder som løsemiddelfordamping, og dobbelt emulsjon er også brukt [9]. I dette prosjektet ble det brukt en løsemiddel-injeksjons metode som ble utviklet av Ternullo et al. og ble videre tilpasset av Tzanova et al. [11, 91].
2.9 Karakterisering av nanopartikler
Karakterisering av nanopartiklenes fysikalsk-kjemiske egenskaper er nødvendig for å ha kontroll på produktkvalitet. Noen av de mest sentrale egenskapene inkluderer partikkelstørrelse, størrelsesfordeling, zetapotensial, innkapslingseffektivitet og stabilitet. Dette gjelder også for SLN. I dette kapittelet vil fokus være på primæregenskaper som partikkelstørrelse, størrelsesfordeling og zetapotensial.
Partikkelstørrelser og størrelsesfordeling er kritiske egenskaper som kan endre de fysikalske egenskapene til nanopartikler. Partikkelstørrelsen kan for eksempel påvirke løselighet og tendens til agglomerering, sistnevnte påvirker stabilitet [9]. Partikkelstørrelse bestemmes ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS), en metode som måler tilfeldige Brownske bevegelser av nanopartiklene suspendert i et dispensjonsmedium [9]. Partikler bestråles med en laserstråle med en bestemt bølgelengde og ved en konstant temperatur. Intensiteten av fluktuasjon i lysspredning forårsaket av partiklene detekteres ved en gitt vinkel for å bestemme en diffusjonskoeffisient, som kan brukes til å beregne hydrodynamisk diameter av partiklene ved hjelp av en Stokes-Einstein likning (likning 1) [9, 92]. Jo større partikler, desto langsommere bevegelser og dermed gir mindre intensitet av fluktuasjon av spredtlys [9].
𝐷 = 𝑘𝑇 3𝜋𝜂𝑑𝐻
Likning 1: Stokes-Einstein likning som brukes til å beregne hydrodynamisk diameter av nanopartikler.
D er partikkelens diffusjons koeffisient; k er Boltzmann konstnant, T er absolutt temperatur, 𝜂 er viskositet av dispersjonsmediet og dH er hydrodynamisk diameter av partikler.
Polydispersitetsindeks (PDI) indikerer bredden på partikkelstørrelsefordelingen, som varierer fra 0 til 1. Teoretisk sett skulle et monodisperst system ha en PDI lik 0. I praksis er PDI < 0,2 ansett som et monodisperst system, altså at det har en smal størrelsesdistribusjon [93].
Zetapotensial er en betegnelse på det elektrokinetiske potensialet av partikler i en dispersjon [94]. De fleste kolloidale dispersjoner i et vandig medium vil bære en ladning på partikkeloverflaten. Overflateladningen til partikler påvirker ioner i nærheten og føre til en økt ionekonsentrasjon nær partikkeloverflaten. Omorganisering av ioner danner et elektronisk
22
dobbeltlag (figur 8) [95]. Det elektroniske dobbeltlaget består av et stern lag (Stern layer) og et diffust lag (diffuse layer). Stern layer omfatter motionet som er motsatt ladet til ladningen på partikkeloverflaten. Diffuse layer inneholder både positive ioner og negative ioner [95]. Når partikler beveger seg vil ioner i elektronisk dobbeltlag følge med, og grensen mellom ioner som føler med og ioner som forblir i medium defineres som slipping plane. Zetapotensialet er potensialet ved denne slipping planen [95, 96].
Figur 8: Illustrasjon av et elektronisk dobbeltlag som omgir en partikkel i et vandig medium.
Zetapotensialet er potensialet ved slipping plane [95].
Zetapotensial indikerer grad av frastøtning mellom partikler med lik ladning i en dispersjon [96]. Det er en kritisk parameter som brukes for å bestemme stabilitet av nanopartikkel- suspensjoner og kan ikke minst påvirke celleadhesjon og cytotoksisitet [97, 98]. For et kolloidalt system vil et høy absolutt zetapotensial (> 30 mV) indikere at systemet er elektrostatisk stabilisert. Et lav absolutt zetapotensial (0-10 mV) indikerer at partikler kan aggregere med hverandre, noe som dermed representerer et ustabilt system [99]. Kolloidale systemer med zetapotensial rundt ± 20 mV kan stabiliseres ved hjelp av sterisk hindring [99].
Zetapotensialet er også viktig for celleadhesjon. Mange studier har rapportert at positivt ladede partikler viser økt cellulært opptak på ikke-fagocytiske celler enn negativt ladede partikler [100].
Dette kan ha interaksjon mellom positive ladningen på partikkeloverflaten og negativt ladede cellemembraner å gjøre. Negativt ladede partikler derimot viser økt cellulært opptak på
fagocytiske celler [100]. Cytotoksisk effekt kan forekomme både av negativt- og positivt ladede partikler [100]. I mange tilfeller vil positivt ladede nanopartikler øke cytotoksisitet ved at de kan interagere sterkere med den negative ladede cellemembranen [101]. Dette kan føre til destabilisering av cellemembranen og gir en økt risiko for nanopartikler til å interagere med cellulære target og dermed forårsake skadelig effekt [100, 101]. Zetapotensialet blir ofte bestemt ved å detektere elektroforetisk mobilitet av ladet partikler, som er den hastigheten av partikler når de vander i et elektronisk felt [93].
2.10 Legemiddelsubstanser i denne studien
2.10.1 Metronidazol
Metronidazol er en nitroimidazol antibiotika som ble oppdaget på 1950-tallet, og har vært i klinisk bruk i over 50 år. Den antibakterielle effekten ble introdusert i 1962 [102, 103].
Metronidazol ble opprinnelig brukt til å behandle trikomansinfeksjon, men ble etter hvert funnet til å være effektiv mot flere mikroorganismer, slik som protozooer organismer, Gram-negative- og Gram-positive anaerober mikroorganismer [102, 104]. Den kliniske bruk av metronidazol i dag inkluderer protozoal-infeksjoner som trikomaniasis vaginitis, anaerobe infeksjoner, rosacea, magesår forårsaket av Helicobacter pylori og bakteriell vaginose [105, 106].
Figur 9: Kjemiske struktur av metronidazol [104].
24
Kjemisk struktur a metronidazol er vist i figur 9. Metronidazol er en svak base med pKa 2,62 og har vannløselighet på 10 mg/mL ved 20oC [105, 107]. Det er et hydrofilt legemiddel med log P -0,02, og er klassifisert som klasse I legemiddel ifølge Biopharmaceutics Classification System (BSC) [105, 106].
Metronidazol er tilgjengelig i orale, intravenøse, vaginale og topikale formuleringer [106].
Systemisk behandling med metronidazol har noen ulemper som potensiell legemiddelinteraksjon, ettersom de hemmer hepatiske enzymer som CYP2C9 og CYP3A4, og gir dessuten systemiske bivirkninger [103]. Metronidazol ble valgt som et modell-legemiddel i dette prosjektet for lokalbehandling av vaginale infeksjoner. I dette prosjektet ble metronidazol valgt som en modellsubstans til å behandle vaginale infeksjoner som BV.
2.10.2 Klotrimazol
Klotrimazol er et førstevalg bredspektret soppdrepende middel av typen imidazol som brukes ved behandling av candidainfeksjoner og andre soppinfeksjoner, slik som tinea pedis, tinea rusis, vaginale soppinfeksjoner, og oral candidainfeksjon [93, 108]. Kjemisk struktur av klotrimazol er vist i figur 10. Klotrimazol er et hydrofobt legemiddel (log P = 6,1) og har svak basisk egenskap (pKa = 4,1). Det er klassifisert som et BCS klasse II legemiddel, med en vannløselighet på 0,49 mg/L [108, 109]. Den dårlige vannløseligheten av klotrimazol fører til en lav oral biotilgjengelighet. Ved intravaginal administrering vil kun rundt 3% av den totale dosen bli absorbert [110].
Figur 10: Den kjemiske strukturen av klotrimazol [108].
På markedet finnes det kun topikale legemiddelformuleringer som krem, liniment, vaginalkapsler og tabletter som brukes til å behandle vulvovaginal candidainfeksjon [111]. Men mange avanserte legemiddelformuleringer er utviklet i litteraturen for å øke løselighet og terapeutisk effekt av klotrimazol, eksempel mucoadhesive termosensitive gel, bioadhesive liposomal gel og andre nanobærersystem [110]. Klotrimazol-lastet SLN har også blitt undersøkt av andre forskere. Das et al. konkludert at SLN er et effektivt nanosystem for levering av klotrimazol. Det ble blant annet påvist en langsommere frigjøringsprofil av klotrimazol, og en optimal innkapslingsgrad > 50% som var avhengig av konsentrasjon av lipid og surfaktant [93].
26
3 Materialer, utstyr og metoder
3.1 Materialer
Batch/LOT Produsent
Eddiksyre 16F304034 VWR International.
Radnor, Pennsylvania, USA
Bovint serumalbumin 045K0688 Sigma-Aldrich, Saint-
Louis, USA
Kalsiumhydroksid (Ca(OH)2) 6384749 E.Merck KG, Darmstadt, Tyskland
Kitosan (Chitopharm S) UPBH 3820 PR Chitinor AS, Tromsø, Norge
Klotrimazole A0411886 Acros Organics, Geel,
Belgia
Glyseraldehyd BCBW9924 Sigma-Aldrich, Saint-
Louis, USA
Melkesyre BCB1772V Sigma-Aldrich, Saint-
Louis, USA
Glukose 15C120011 VWR International.
Radnor, Pennsylvania, USA
Glyserol K441198692 305 Merck KGaA, Darmstadt,
Tyskland
Kaliumhydroksid (KOH) 12D040031 VWR International.
Radnor, Pennsylvania, USA
Fosfatidylkolin fra soya (Lipoid S100)
Charge:579000-1120675- 01/909
Lipoid GmbH, Newark, USA
Metanol I1004218 917 Merck KGaA, Darmstadt,
Tyskland
Metronidazol WXBD640V Sigma-Aldrich, Saint- Louis, USA
Mucin fra svinemage type II SLBL 3184V Sigma-Aldrich, Saint- Louis, USA
Natriumklorid (NaCl) 13F130010 VWR International.
Radnor, Pennsylvania, USA
Natriumdihydrogenfosfat monohydrat (NaH2PO4 x H2O)
AM0863421 632 VWR International.
Radnor, Pennsylvania, USA
Dinatriumhydrogenfosfat dihydrat (Na2HPO4 x 2H2O)
K46663780 533 EMSURE®, Merck KGaA,
Darmstadt, Tyskland Fosfat buffer salin tablett SLBX3017 Sigma-Aldrich, Saint-
Louis, USA
Tween 80 (Polysorbat 80) K40498461 947 Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland
Urea 410002 Apotekproduksjons AS,
Oslo, Norge
3.2 Utstyr
Generelt utstyr Produsent
Analysevekt AG204 DeltaRange® MettlerToledo, Ohio, USA
Celle kultur insert Transparent PET
membrane 6 well 0,4 µm pore size
Corning Incorporated, Corning, New York, USA
Filterholder SWINNEX® non-sterile EMD Millipore
Corporation, Burlington, USA
Engangsceller for zetapotensial måling med Zetasizer
Zetasizer Nano Series DTS1070 celler
Malvern Panalytical, Malvern, Storbritannia Engangskyvetter til UV-spekter UV-Transparent
Disposable cuvettes
Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland.
28
Engangskyvetter til Zetasizer 10 x 10 x 45 mm Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland
Engangssprøyte for måling av zetapotensial med Zetasizer, 1mL
Henke-ject Henke-Sass, Tuttlingen, Tyskland
Filtermembran Nuclepore Track-Etch
membran (0.8 µm, 0.4 µm og 0.2 µm)
Whatman, Maidstone, Storbritannia
Luer lock sprøyte, 10 mL 3H04048 B.Braun, Melsungen,
Tyskland
Magnetrører IKa®RCT basic IKA-Werke FmbH & Co.
KG, Staufen, Tyskland
MilliQ vann Millipore milli-Q integral®
water purification system
Merck Millipore,
Burlington, Massachusetts, USA
Micrometer Cocraft® Clas Ohlson, Dalarna,
Sverige
pH meter pH/Ion meter S220 Mettler Toledo, Columbus,
USA
Petriskål (12x12 cm) F200235 N Greiner Bio-One,
Kremsmünster, Østerrike
Petriskål (35x10 mm) 430588 Corning Incorporated,
Corning, New York, USA
Rotavapor Hei-VAP Advantage Heidolph, Schwabach,
Tyskland Rotor til ultrasentrifuge MLA-80 Fixed-Angle
Rotor
Beckman Coulter, Brea, California, USA
Scalpel-blad Paragon Sterile strainless surgical blade
Swann-Mosten® Sheffield, England
Shaker-incubator Orbital Shaker-Incubator Riga, biosan, Latvia
Soft Juct® sprøyte, 3 mL Henke Sass Wolf,
Tuttlingen, Tyskland
Sterican® kanyle 0,3 x 12 mm Henke-Sass Wolf,
Tuttlingen, Tyskland
Texture Analyzer TA-XT Godalming, Surrey, UK Tissue culture plate, 6 well Multi well, 6 well Corning Incorporated,
Corning, New York, USA
Ultrasentrifuge Optima™MAX
Ultracentrifuge
Beckman Coulter, Brea, California, USA
UV-VIS spektrofotometer UV-2550 Shimadzu, Kyoto, Japan
Zetasizer Nano series Nano-ZE Malvern Panalytical,
Malvern, Storbritannia
3.3 Løsninger
1 % (v/v) Eddiksyre
- En 500 mL målkolbe fylles med litt vann og 5 mL av eddisyre overføres til målkolben.
Målkolben fylles opp med MilliQ vann til merket.
Fosfatbuffer pH 6,8
- 0,460 g av NaH2PO4xH2O og 0.267 g av Na2HPO4x2H2O løses i MilliQ vann i 1 L målekolben og fylles opp med MilliQ vann til merket. pH sjekkes og justeres ved behov.
Fosfatbuffer saline (PBS) pH 7,4
- 1 tablett av fosfatbuffer salin løses i 200 mL MilliQ vann. Dette gir en isoton fosfatbufferløsning som inneholder 0,01 M fosfatbuffer, 0,0027 M kaliumklorid og 0,137 M natriumklorid.
1,66 % (w/v) Glyseraldehyd
- 0,830 g glyseraldehyd løses i 1% (v/v) eddiksyre i 50 mL målekolbe og fylles opp med 1%(v/v) eddiksyre til merket.
0,01% (v/v) Melkesyre
- 111 µL av melkesyre fortynnes med MilliQ vann i målekolben til et totalt volum på 100 mL
3 % (w/w) Mucin-dispersjon
- 3 g av mucin fra svinemagesekken type II dispergeres i 97 g av PBS pH 7,4.
30
Vaginalvæske simulant (VFS) pH 4,2
- 3.51g NaCl, 1.40 g KOH, 0,222 g Ca(OH)2, 0.018 g Bovint serumalbumin, 2.00 g melkesyre, 1.00 g eddiksyre, 0.016 g glyserol, 0,4 g urea og 5.0 g glukose løses i MillQ vann til 1 L [112].
3.4 Fremstilling av faste lipid-nanopartikler (SLN)
Løsningsinjeksjonsmetoden til fremstilling av faste lipid-nanopartikler er beskrevet av Ternullo et al., og innebærer rask injeksjon av en lipidfase injiseres i en vandig fase [91]. Metoden ble og tilpasset av Tzanova et al. [11]. Lipidfasen (10 mg/mL og 30 mg/mL) består av en passende mengde av Lipoid S100 løst i metanol, legemiddel (10 mg/mL og 2 mg/mL) som er lipofile løses også i lipidfasen. Vandig fase består av 1 mg/mL polysorbat 80 (PS-80) i PBS løsning som tilberedes ved fortynning av en stamløsning på 10 mg/mL PS-80 i PBS. 2 mL av lipidfasen injiseres raskt i 6 mL vandig fasen under omrøring ved 300 rpm ved hjelp av en kanyle med dimensjon 0.3 x 12 mm. Spissen legges nær overflaten i løsningen. Suspensjonen står på omrøring i 2 timer ved romtemperatur tildekket med aluminium folie for å unngå lys. Deretter dampes metanol (2 ml) bort ved hjelp av rotavapor i 20 min, temperaturen til vannbad ble innstilt på 40 oC og rotasjonshastighet til 90 rpm. Trykket opprettholdte på 105 ± 5 mbar. Det endelig volumet av suspensjonen bestemmes og suspensjonen oppbevares i kjøleskap (4oC) over natten. PBS løsningen som brukes under fremstillingsmetoden er på forhånd filtrert med 0,2 µm membran.
SLN-suspensjon ble ekstrudert for å redusere partikkelstørrelsen av SLN. SLN-suspensjon ble ekstrudert for hånd ved hjelp av Luer-lock sprøyte gjennom polykarbonat membraner med porestørrelse på henholdsvis 0,8 µm, 0,4 µm og 0,2 µm i denne rekkefølgen. Filtreringen utføres 3 ganger for hver porestørrelse. Etter ekstrudering oppbevares SLN suspensjonen i kjøleskap under inert (N2) atmosfære, til neste dag før karakterisering av partikler. For hver nylaget batch bestemmes gjennomsnittlig partikkelstørrelse, størrelsesfordeling og zetapotensial dagen etter ekstrudering.
SLN ble laget med to forskjellige lipidmengder (10 mg/mL og 30 mg/mL), og to ulike legemidler (metronidazol og klotrimazol) i tillegg til placebo partikler uten legemiddel. Tabell 1 gir en oversikt over deres teoretiske sammensetning og navngivelse.
Tabell 1: Sammensetning av formuleringer for fremstilling av SLN og deres navn.
SLN formulering Lipid- konsentrasjon
(mg/mL)
Polysorbat-80 konsentrasjon
(mg/mL)
Legemiddel type
Legemiddel konsentrasjon
(mg/mL)
SLN Placebo 10 1 - -
SLN MTZ 10 1 metronidazol 10
SLN Clot LL 10 1 klotrimazol 2
SLN Clot HL 30 1 klotrimazol 2
3.5 Karakterisering av faste lipid-nanopartikler
3.5.1 Partikkelstørrelse bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS)
DLS måler tilfeldige bevegelser av små partikler (Brownske bevegelser) i en løsning ved hjelp av en laser, og beregner hydrodynamisk diameter (Z-average) for partiklene og polydispersitetsindeks (PDI) som er et mål for partikkelstørrelses distribusjon. Bevegelsene til partikler er avhengig av temperatur i løsningen, og alle målingene ble utført ved romtemperatur (25oC). SLN-suspensjon ble tatt ut fra kjøleskap omtrent 1 time før måling.
Partikkelstørrelse ble målt ved hjelp av DLS på Zetasizer Nano-ZS. 10 µL av SLN- suspensjonen fortynnes direkte i en engangskyvette (10 x 10 x 45 mm kyvette) med 990 µL filtrert PBS til et volum på 1 mL. For hver SLN-suspensjon lages 3 prøveuttak ved separat fortynning. De parameterne som ble innstilt i Zetasizeren vises i tabell 2. Resultatene angis som gjennomsnitt og standardavvik.
32
Tabell 2: Konfigurasjon av Zetasizer Nano-ZS ved måling av partikkelstørrelse
Parameter
Materiale Polystyrene latex
Dispergeringsmiddel Vann
Viskositet 08872 cP
Generelt valg Mark-Houwink parameter
Temperatur 25oC
Målevinkel 173o Backscatter
Målingens varighet Auto
Antall målinger 3
Analysemodell General purpose (normal resolution)
3.5.2 Zetapotensial
Zetapotensial (mV) representerer overflatesladning og måles ved hjelp av Zetasizer Nano-ZS på samme dag som måling av partikkelstørrelse. Engangsceller (DTS1070 celler, Malvern, UK) ble brukt til å måle zetapotensial, cellen sjekks først ved en standard løsning på -40 mV ± 5,8 mV før måling av SLN-suspensjon. 10 µL av SLN-suspensjonen fortynnes direkte i engangskyvette (10 x 10 x 45 mm) med 990 µL filtrert MilliQ til et volum på 1 mL og overføres til cellen. For hver SLN-suspensjon lages 3 prøveuttak ved fortynning, de parameterne som ble innstilt i Zetasizeren vises i tabell 3. Resultatene angis som gjennomsnitt og standardavvik.
Tabell 3: Konfigurasjon av Zetasizer Nano-ZS ved måling av zetapotensial Parameter
Materiale Polystyrene latex
Dispergeringsmiddel Vann
Viskositet 08872 cP
Generelt valg Smuluchowski
Temperatur 25oC
Målingens varighet Auto
Antall målinger 5
Analysemodell Auto mode
